李雪儀，彭東輝，陳雨嬋，姜帆，秦安琪，曾元寧，匡海學(xué)，王秋紅

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室/黑龍江中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

柴胡在《中國藥典》中收錄為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按照2種不同種植物的性狀不同，前者習(xí)慣稱之為“北柴胡”，后者習(xí)稱“南柴胡”。柴胡性味微苦、微辛、微寒，具有退熱解表、疏肝解郁、截瘧等功效[1-3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，柴胡主要含有黃酮、皂苷、多糖以及揮發(fā)油等物質(zhì)[4]，在具有抗腫瘤、抗抑郁癥和抗纖維化、抗衰老作用，對肝、肺損傷的保護(hù)作用的同時，還有保護(hù)心臟、肝臟和腎臟等作用[5-13]。

柴胡的炮制方法有酒制、蜜制、醋制、鱉血制等，酒炙柴胡的應(yīng)用歷史可追溯到《原機啟微》，附方[14]中提到：“瀉熱黃連湯治內(nèi)障，癥同上，有眵淚，黃芩（酒炒）、黃連（酒洗）、柴胡（酒炒）、生地黃（酒洗，各一兩）、升麻（半兩）、龍膽草（三錢）”，酒炙后能增強柴胡行血通經(jīng)、疏肝解郁的作用[15]，柴胡酒炙方法在《全國中藥飲片炮制規(guī)范（一）（征求意見稿）》及部分地方炮制規(guī)范中有收錄[16]。目前柴胡研究較多的炮制方法是醋炙法和鱉血制法，關(guān)于酒炙法以及酒炙法對柴胡化學(xué)成分及藥理作用影響的研究較少。邱云等[17]研究發(fā)現(xiàn)酒炙后會降低柴胡中SSa和SSd質(zhì)量分?jǐn)?shù)，李小寧等[18]研究發(fā)現(xiàn)酒炙能減少柴胡總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，葉耀輝等[19]提出酒法炮制后柴胡揮發(fā)性成分在總柴胡檢出物中比例升高。酒炙后的柴胡對血瘀證模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血四項指標(biāo)的改善作用更強[20]，增強了活血行氣作用；酒炙后柴胡能更大范圍地提高虛熱大鼠的D-木糖值，側(cè)重于提高機體免疫能力[21]，該效果較生柴胡更顯著?，F(xiàn)行研究多關(guān)注醋炙柴胡對柴胡功效的影響或炮制對柴胡的總體影響，酒炙對柴胡的影響較少單獨出現(xiàn)，并且對酒炙柴胡所造成的影響及其原因沒有進(jìn)一步研究。本試驗在現(xiàn)行柴胡總黃酮和柴胡各皂苷測定方法的基礎(chǔ)上，研究柴胡酒炙前后總黃酮以及柴胡皂苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，為后續(xù)柴胡酒炙的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

生柴胡片購于廣州清平藥材市場，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系劉基柱教授鑒定為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根，屬北柴胡。藥材共9 批，產(chǎn)地為黑龍江、甘肅和內(nèi)蒙古，由實驗室自行炮制加工，詳細(xì)信息見表1。

表1 9批柴胡藥材信息表Table 1 The information of 9 batches of radix bupleuri

1.2 試劑

柴胡皂苷a（SSa，批號：J0901 AS）、柴胡皂苷b1（SSb1，批號：A1130 AS）和柴胡皂苷b2（SSb2，批號：A0319 AS）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，柴胡皂苷d（SSd，批號：B20150）和蘆?。ㄅ枺築20771）購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。乙腈購自賽默飛世爾科技公司，為色譜純；甲醇、氨水購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，均為分析純。

1.3 儀器

ACQUITY Arc 型超高效液相色譜儀、2489 UV型紫外檢測器（美國Waters 公司），MX-F 型渦旋器（美國Scilogex 公司），CA-1330 型冷卻水循環(huán)裝置、SB-1300 型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司），SB25-12 DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），H1750 R 型高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），ME802/104 E 型電子分析天平［梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司］，N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA 公司），AllegraX-15R 型臺式離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

2 方法

2.1 柴胡飲片的制備

根據(jù)《湖北省中藥飲片炮制規(guī)范（2018 年版）》[22]所載，取凈柴胡片適量，加10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）黃酒拌勻，于室溫中悶透，等待酒液被吸盡后，置于炒制容器內(nèi)，用文火將其炒干，取出后放涼，打粉，過4號篩，即得生柴胡粉末和酒柴胡粉末。

2.2 柴胡酒炙前后總黃酮成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 稱取50 mg干燥至恒重的蘆丁對照品，置于25 mL 容量瓶中，加入適量甲醇，水浴加熱溶解，放冷，加入甲醇定容至容量瓶刻度，搖勻，即得[23]。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各批次的生柴胡和酒柴胡粉末（過4號篩）各200 mg，稱定，置于具塞錐形瓶中，加入75%甲醇4 mL，超聲處理（功率800 W，頻率40 kHz）20 min，離心10 min（轉(zhuǎn)速4 750 r/min）。如上再次重復(fù)提取2 次，每次都加入75%甲醇3 mL，合并3 次上清液，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，分別作為生柴胡和酒柴胡粉末的供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考周亞福等[24-25]的方法，將“2.2.1”項下制備的對照品溶液分別稀釋，配置成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。分別量取7 份上述質(zhì)量濃度的對照品溶液1 mL 于7 個10 mL 具塞試管中，依次加入60%甲醇溶液3.0 mL以及5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻后再次放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻后放置15 min，以等體積蒸餾水為空白對照，同時以1 mL黃酒代替供試品溶液，重復(fù)上述步驟重復(fù)測定3次，以消除黃酒本身的影響，在510 nm 處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），總黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.077 2X-0.008 2（r=0.999 5）。

2.2.4 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.2.3”項下方法測定各供試品的吸光度值，代入回歸方程，計算得生柴胡和酒柴胡粉末中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。通過t檢驗可知2 種柴胡總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證明酒炙后柴胡總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高。

表2 各批次柴胡中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fraction of total flavonoids in different batches of radix bupleuri(,n=3) w/（mg·g-1）

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2.3 柴胡酒炙前后皂苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 分別取SSa、SSb1、SSb2 和SSd 對照品適量，精確稱定，置于5 mL 容量瓶中，分別加入甲醇制成每1 mL 含SSa 10 mg、SSd 10 mg、SSb1 1 mg、SSb2 1 mg 的各對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 參考黃江等[26]的方法，分別取各批次生柴胡和酒柴胡粉末0.5 g，稱定，置具塞錐形瓶中，加入5%濃氨甲醇25 mL，密塞，超聲（功率500 W、頻率40 kHz）30 min。取出，放冷，用甲醇20 mL分3次洗滌藥渣以及容器，合并洗液及濾液回收溶劑至蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，搖勻，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為SunFireC18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈（A）和水（B），以梯度方式洗脫（0～60 min，25%A→58%A）；SSb1 和SSb2 的檢測波長為254 nm，SSa 和SSd 的檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃[27-29]，進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 分別吸取SSa、SSb1、SSb2、SSd 對照品溶液，分別稀釋至表3 中的質(zhì)量濃度。按照“2.3.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果線性關(guān)系良好，回歸方程見表4。

表3 4種成分對照品溶液的質(zhì)量濃度Table 3 Mass concentration of reference solutions for SSa，SSb1，SSb2 and SSd mg/mL

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 4 Results of linear relationship investigation

2.3.5 專屬性試驗 分別精密稱取SSa、SSb1、SSb2、SSd適量，置于5 mL 容量瓶中，加入甲醇制成SSa、SSb1、SSb2、SSd 質(zhì)量濃度分別為0.02、0.09、0.09、0.2 mg/mL 的混合對照品溶液。以甲醇為陰性對照溶液。

分別精密吸取生柴胡和酒柴胡供試品溶液（S1）、混合對照品溶液、陰性對照溶液，分別按照“2.3.3”項下方法進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。從圖1 可知，254 nm 處SSb1 和SSb2 互不干擾，210 nm 處SSa和SSd 亦互不干擾，且陰性無干擾，方法專屬性良好[30]。

圖1 生柴胡粉末供試品溶液（S1）、酒柴胡粉末供試品溶液（J1）和混合對照品溶液的HPLC色譜圖Figure 1 H PLC chromatograms of Raw Bupleurum chinense test solution（S1），alcoholic bupleurum chinense test solution（J1）and mixed standard solution

2.3.6 精密度試驗 精密吸取同一批生柴胡粉末（S1），按“2.3.3”項下方法重復(fù)進(jìn)樣6 次，測得SSa、SSb1、SSb2、SSd 峰面積的RSD 值分別為0.34%、0.51%、0.84%和0.81%，表明方法精密度良好[30]。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取同一批生柴胡粉末（S1）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按“2.3.3”項下方法測定。得到SSa、SSb1、SSb2、SSd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別為0.16%、0.43%、0.10%和0.11%，表明方法重復(fù)性良好[30]。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批生柴胡粉末（S1）0.5 g，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、12、24、48 h 后依次進(jìn)樣，按“2.3.3”項下方法測定，計算得到SSa、SSb1、SSb2、SSd峰面積的RSD值分別為0.36%、0.84%、0.84%和0.90%，結(jié)果顯示供試溶液中各待測成分在48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定[30]。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生柴胡粉末（S1）6 份，分別加入SSa（0.6 mg/mL）、SSb1（0.004 mg/mL）、SSb2（0.01 mg/mL）、SSd（1.0 mg/mL）對照品溶液1 mL，進(jìn)樣量10 μL，按“2.3.3”項下方法測定各柴胡皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平行測定3次，表明樣品的加樣回收率良好[30]。見表5。

表5 4種成分加樣回收率試驗結(jié)果Table 5 The results of recovery rate of 4 components

2.3.10 樣品中皂苷類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 分別取各批次的柴胡生品和酒炙品的供試品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進(jìn)樣，平行測定3 次，見圖2。通過回歸方程計算炮制前柴胡中SSa、SSb1、SSb2、SSd 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，SSb1 的定量限為0.001 mg/mL，結(jié)果如表6－8所示。通過t檢驗可知酒炙能使SSa 和SSd 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少（P<0.05），SSb1 和SSb2 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加（P<0.05）。

圖2 柴胡炮制前后的HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of radix bupleuri before and after processing

表6 柴胡生品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 The contents of SSa，SSb1，SSb2 and SSd in crude bupleurum chinense DC(,n=3) w/(mg·g-1)

表6 柴胡生品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 The contents of SSa，SSb1，SSb2 and SSd in crude bupleurum chinense DC(,n=3) w/(mg·g-1)

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表7 柴胡酒炙品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 7 The contents of SSa，SSb1，SSb2，SSd in radix bupleuri stir-fried in wine(,n=3) w/(mg·g-1)

表7 柴胡酒炙品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 7 The contents of SSa，SSb1，SSb2，SSd in radix bupleuri stir-fried in wine(,n=3) w/(mg·g-1)

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表8 柴胡中4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的t檢驗結(jié)果Table 8 T-test results of the mass fractions of four components in radix bupleuri

3 討論

本試驗通過比較酒炙前后柴胡中總黃酮、皂苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化來研究酒炙法對柴胡化學(xué)組成的影響。結(jié)果顯示，柴胡酒炙后總黃酮成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，其原因可能與輔料黃酒以及加熱情況下化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化有關(guān)，具體機制有待進(jìn)一步研究。此外，有研究報道柴胡中的總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為酒柴胡>生柴胡>醋柴胡[31]，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酒炙后，SSa 和SSd 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，原因可能是生柴胡在潤洗和浸潤前處理的過程中，皂苷成分隨著水的沖洗而流失減少[32]，與本實驗結(jié)果一致；同時，SSa、SSd 中的C13、28 位的有氧醚環(huán)在加熱過程中不穩(wěn)定，易開環(huán)[31]，其中SSa 可以轉(zhuǎn)化生成SSb1[34]，SSd轉(zhuǎn)化生成SSb2[33]，導(dǎo)致SSb1、SSb2 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。但是過程是否定量、轉(zhuǎn)化的影響因素等還需要進(jìn)一步研究。

經(jīng)前期研究得知，柴胡酒炙之后可增強升舉陽氣、活血行氣等功效，但是其化學(xué)成分變化以及對功效的影響還沒有深入研究，后續(xù)可進(jìn)一步研究酒炙法對柴胡功效的影響，從而闡明柴胡酒炙的科學(xué)內(nèi)涵。