宋功吉, 王煜煜, 王善龍, 王建南,2, 許建梅,2

(1. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院, 江蘇 蘇州 215021; 2. 蘇州大學(xué) 紡織行業(yè)醫(yī)療健康用蠶絲制品重點(diǎn)實驗室, 江蘇 蘇州 215127)

由意外和創(chuàng)傷造成的周圍神經(jīng)損傷會導(dǎo)致中樞神經(jīng)與周圍器官之間的感知神經(jīng)和運(yùn)動神經(jīng)異常,甚至?xí)?dǎo)致自主神經(jīng)功能的部分或全部喪失,這將會對患者的日常生活造成極大不便[1]。雖然目前可通過自體神經(jīng)移植手術(shù)進(jìn)行治療,但這種方法的成功率較低,且存在供體神經(jīng)源有限、供區(qū)神經(jīng)與受損神經(jīng)匹配度差、手術(shù)時間長和需要多次手術(shù)等缺陷[2],因此,急需研發(fā)新的神經(jīng)替代物來提高周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的效果。人工神經(jīng)導(dǎo)管可作為一種替代自體神經(jīng)移植的理想方案,其管狀結(jié)構(gòu)能夠連接被切斷的神經(jīng),并作為引導(dǎo)軸突生長的通道,進(jìn)而促進(jìn)受損神經(jīng)的再生[3]。目前,采用編織法、靜電紡絲等紡織加工方法制備的神經(jīng)導(dǎo)管,融合了紡織、醫(yī)學(xué)、生物等多學(xué)科技術(shù)[4],在導(dǎo)管力學(xué)性能以及高聚物材料使用方面都具有明顯的優(yōu)勢。

高聚物因其優(yōu)異的可加工性、生物相容性和降解性,被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)組織工程,常用的高聚物包括:絲素蛋白、膠原蛋白、殼聚糖等天然高聚物;聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)和聚己內(nèi)酯(PCL)等合成高聚物。研究表明,電刺激既能促進(jìn)軸突的再生,也能為自然細(xì)胞的分化提供信號[5],但高聚物通常都是非導(dǎo)電材料,無法產(chǎn)生電刺激響應(yīng),因此,可通過表面涂覆或在高聚物中加入導(dǎo)電性物質(zhì)如碳納米管(CNT)、聚吡咯(PPy)、聚苯胺(PANI)等制備導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管。其中,CNT因其獨(dú)特的化學(xué)、力學(xué)、結(jié)構(gòu)、導(dǎo)電特性以及可改性,在神經(jīng)組織的修復(fù)與再生中備受關(guān)注;并且CNT特有的納米形貌更有利于神經(jīng)細(xì)胞的黏附,刺激細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基因、生物信號的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖與軸突再生;CNT具有一定的細(xì)胞毒性與基因毒性,經(jīng)過功能化處理后,CNT的細(xì)胞毒性可明顯降低,因而需要不斷探索復(fù)合工藝使CNT與高聚物基體材料結(jié)合的穩(wěn)定性提高,降低其與細(xì)胞接觸時的毒性[6]。

本文探討了碳納米管的性能,包括微觀形貌、電學(xué)性能和生物相容性等,以及其對神經(jīng)再生的影響與作用機(jī)制;分析碳納米管的功能化改性及其對神經(jīng)再生的促進(jìn)機(jī)制;高聚物和碳納米管復(fù)合制備導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管的方法,以及高聚物與碳納米管復(fù)合導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管的再生效果,為導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管的研究和發(fā)展提供參考。

1 碳納米管的性能與神經(jīng)再生

神經(jīng)再生是指退化了的神經(jīng)和神經(jīng)組織的再生、恢復(fù)或修復(fù),其與軸突、神經(jīng)元和突觸等的重新產(chǎn)生有關(guān)[7]。神經(jīng)損傷后,植入人工神經(jīng)導(dǎo)管為神經(jīng)組織的再生提供了物理引導(dǎo)[8],而具有導(dǎo)電性的導(dǎo)管更有利于神經(jīng)再生。碳納米管是具有無縫中空圓柱結(jié)構(gòu)的一維納米級材料,其性能優(yōu)異,具有尺寸小、比表面積大、長徑比大等特點(diǎn),還具備非常高的強(qiáng)度和韌性,以及優(yōu)異的導(dǎo)電性能[9]。高聚物與碳納米管的復(fù)合不僅使神經(jīng)導(dǎo)管具備導(dǎo)電性,且碳納米管的納米形貌和功能化改性,使其在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮著非常好的作用。

1.1 碳納米管的納米形貌

碳納米管的形態(tài)結(jié)構(gòu)與神經(jīng)突起很相似,小的碳納米管束的尺寸也與樹突相似,且碳納米管具有巨大的電化學(xué)接觸表面積,可使其與細(xì)胞或組織之間的相互作用界面達(dá)到最大[10]。高聚物基底上的碳納米管加強(qiáng)了界面處的神經(jīng)信號傳遞[11],為神經(jīng)元的存活、分化、生長提供了一個有利的環(huán)境[12]。

納米材料的納米形貌表面能構(gòu)建出類似于細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境,并能在納米尺度上與神經(jīng)元膜相互作用[13]。碳納米管界面能為神經(jīng)元的黏附提供一種納米級的結(jié)構(gòu)引導(dǎo)[6],神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞附著在碳納米管上時,也可分泌出一些促進(jìn)神經(jīng)元與碳納米管黏附的蛋白質(zhì)(如纖連蛋白),且當(dāng)碳納米管的表面粗糙度與神經(jīng)元突起的長度尺度相適應(yīng)時,更有利于細(xì)胞的黏附[14]。

1.2 碳納米管的電學(xué)特性

高聚物摻雜碳納米管改善了神經(jīng)導(dǎo)管的電傳導(dǎo)性能。純化的碳納米管是神經(jīng)元良好的生長界面,碳納米管與神經(jīng)元之間的電耦合也能促進(jìn)神經(jīng)信號傳輸效率的增加[15],這是因為碳納米管作為一維導(dǎo)電材料,其各向異性的導(dǎo)電性與神經(jīng)元的導(dǎo)電性有一定的相似之處,有利于中樞(大腦、脊髓)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信號的傳導(dǎo)[10]。利用碳納米管的導(dǎo)電特性,配合外部電刺激作用,可更好地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[16]。研究發(fā)現(xiàn):用20 Hz的電刺激1 h,可上調(diào)生長因子的表達(dá),能夠增強(qiáng)和加速神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)[17]。因為神經(jīng)細(xì)胞具有內(nèi)在的電活性,所以高聚物復(fù)合碳納米管制備的導(dǎo)電神經(jīng)支架為其提供了施加電刺激的媒介,進(jìn)而能夠促進(jìn)神經(jīng)突起的生長和活體功能的恢復(fù)[16]。

Malarkey等[18]還發(fā)現(xiàn),只有在一定電導(dǎo)率范圍內(nèi)的碳納米管才能促進(jìn)神經(jīng)突的生長,其制備了碳納米管和聚乙二醇接枝共聚物,然后噴涂到熱玻璃片上以形成均勻的導(dǎo)電薄膜,通過調(diào)整薄膜厚度分別制備了電導(dǎo)率為0.3、28、42 S/cm的導(dǎo)電膜。在其上進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),電導(dǎo)率為0.3 S/cm時,神經(jīng)元的分枝與軸突生長的長度均為最優(yōu),而更高的電導(dǎo)率水平反而可能會損害細(xì)胞的活力。

1.3 碳納米管的生物相容性

生物相容性是指生物材料在宿主的特定環(huán)境和部位,與宿主直接或間接接觸時所產(chǎn)生相互反應(yīng)的能力,是材料在生物體內(nèi)處于動態(tài)變化過程中,能耐受宿主各系統(tǒng)作用而保持相對穩(wěn)定、不被排斥和破壞的生物學(xué)特性。

碳納米管通常與神經(jīng)元組織表現(xiàn)出較好的相容性。Mattson等[19]在關(guān)于碳納米管生物相容性體外研究的首次報道中指出:當(dāng)神經(jīng)元在碳納米管上培養(yǎng)8 d后,仍舊存活并繼續(xù)生長,表明碳納米管能支持細(xì)胞的長期存活,并允許軸突的生長。當(dāng)通過共價或非共價的方法將CNT牢固固定在高聚物表面上時,CNT不會在體內(nèi)四處游離而集聚在組織中導(dǎo)致炎癥等不良反應(yīng)[7]。此外,通過在碳納米管基體材料上形成納米圖案化表面,還可以提高細(xì)胞的黏附增殖,引導(dǎo)軸突的生長方向[20]。

經(jīng)過純化或功能化等方法處理的碳納米管的溶解性提高,且不易集聚,不會對細(xì)胞膜造成嚴(yán)重的損傷,不會破壞細(xì)胞的完整性[21]。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管氮功能化后具有較低的溶血率,能夠抑制血小板的黏附和血栓的形成,且細(xì)胞黏附強(qiáng)度和細(xì)胞存活率較高。多項研究[23-24]表明,經(jīng)過表面功能化改性,碳納米管可獲得較低的毒性和非免疫原性,但碳納米管的加入也一定程度上減緩了高聚物在體內(nèi)的降解速度[25]。

2 碳納米管的表面改性

碳納米管在生物體內(nèi)應(yīng)用時,面臨的最大問題是其潛在的生物毒性與基因毒性。CNT與生物體作用時,通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)而可能產(chǎn)生潛在的生物毒性,提高細(xì)胞內(nèi)化作用可以顯著降低生物毒性。而CNT的長徑比、聚集度、表面化學(xué)基團(tuán)都是細(xì)胞內(nèi)化作用的重要影響因素。未經(jīng)處理的CNT不具有水溶性、易團(tuán)聚,即使劑量很低,也可因為團(tuán)聚而不是在納米尺度上與細(xì)胞作用,從而降低細(xì)胞內(nèi)化作用,影響高聚物/CNT復(fù)合導(dǎo)管在細(xì)胞體內(nèi)的降解、代謝等[26],因此,需對CNT進(jìn)行表面功能化處理來改善其水溶性[27],處理過程見圖1。

圖1 碳納米管的表面功能化

CNT的表面功能化改性有多種方法,最簡單的方法是用帶正電荷或負(fù)電荷的化學(xué)物質(zhì)通過共價結(jié)合的方法修飾碳納米管,如引入帶正電荷的氨基或帶負(fù)電荷的羧基和巰基等[26]。Hu等[28]用帶負(fù)電荷的羧基、中性的聚間氨基苯磺酸和帶正電荷的乙二胺,對多壁碳納米管進(jìn)行功能化改性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶正電荷的碳納米管底物上生長的神經(jīng)元軸突的平均長度明顯更高,這也證明了可以通過化學(xué)修飾碳納米管的方法控制神經(jīng)突的延伸和分支。

碳納米管的表面功能化改性也可通過非共價結(jié)合的方式,使用聚合物、表面活性劑包裹碳納米管,改變其表面疏水性,改善其生物相容性,增強(qiáng)與細(xì)胞的相互作用。常用的聚合物主要為親水性的聚乙二醇(PEG)、聚乙二胺(PEI)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)等。Heister等[29]將碳納米管聚乙二醇化后進(jìn)行細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的存活率顯著提高,聚乙二醇化一方面增強(qiáng)了碳納米管分散穩(wěn)定性,另一方面也減少了細(xì)胞非特異性攝取的能力。動物實驗中,有研究[30]直接將聚乙二醇化的水溶性碳納米管注射到大鼠體內(nèi)脊髓損傷處,幾周后觀察到損傷部位的神經(jīng)絲和皮質(zhì)脊髓束纖維增加。

除以上簡單的表面功能化改性外,還可進(jìn)行生物功能化改性。一些生物因子[31]如藥物、生長因子、黏附蛋白、基因等,均能夠用來特異性修飾碳納米管,這不僅能降低其細(xì)胞毒性,更能促進(jìn)細(xì)胞黏附、軸突生長、神經(jīng)元分化以及神經(jīng)組織的再生。

3 高聚物/CNT復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管的制備

復(fù)合CNT的導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管主要是通過將碳納米管與高聚物共混或交聯(lián)等,再利用3D打印[32]、靜電紡絲[33]和溶液澆鑄[34]等技術(shù)進(jìn)行制備。圖2示出導(dǎo)電性神經(jīng)導(dǎo)管支架制備方法。表1列出不同高聚物和碳納米管復(fù)合制備的導(dǎo)電性神經(jīng)導(dǎo)管的性能以及體內(nèi)外應(yīng)用效果。

注:BAPO—苯基雙 (2,4,6-三甲基苯甲?；?氧化膦;PGF—磷酸鹽玻璃微纖維。

3.1 3D打印技術(shù)

使用3D打印技術(shù)制備導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管,通常將碳納米管和高聚物溶解共混,調(diào)配出可以用于打印的生物油墨,然后利用CAD等輔助軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計。Lee等[35]通過3D打印技術(shù)成功制備出一種復(fù)合神經(jīng)支架(制備過程見圖2(a)),其將功能化的多壁碳納米管(MWCNTs)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)共混攪拌制備成生物墨水,然后打印出分散性良好且具有可調(diào)多孔結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架。細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)該導(dǎo)電性支架能夠有效地促進(jìn)神經(jīng)突起的生長。

3.2 靜電紡絲

使用靜電紡絲技術(shù)制備導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管,通常在配制紡絲液時,將碳納米管均勻分散到高聚物中進(jìn)行紡絲。Yu等[25]先將膠原蛋白和聚己內(nèi)酯(PCL)按1∶1的質(zhì)量比混合溶解,再加入多壁碳納米管制備成紡絲液(制備過程見圖2(b))。該導(dǎo)電性人工神經(jīng)導(dǎo)管呈黑色,能夠與神經(jīng)殘端組織很好地融合。碳納米管的加入改善了復(fù)合支架的力學(xué)性能,一定程度上加速了神經(jīng)的再生,但也明顯減緩了神經(jīng)支架的降解速度。

3.3 其它制備方式

將碳納米管與高聚物混合后還可通過溶液澆鑄、浸提或涂覆等方法制成導(dǎo)電性神經(jīng)導(dǎo)管。Zang等[37]將多壁碳納米管分散在明膠溶液中,然后涂覆在聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)基底表面上(見圖2(c)),制備了一種納米微孔支架。Mottaghitalab等[23]使用冷凍干燥和靜電紡絲聯(lián)合的方法制備了神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管,首先通過冷凍干燥法構(gòu)建絲素/單壁碳納米管(SF/SWCNT)基底,然后在其表面靜電紡取向的纖維連接蛋白納米纖維(FN),最后卷曲成神經(jīng)導(dǎo)管(見圖2(d))[40]。溶液澆鑄法是將碳納米管和高聚物的混合溶液注入到設(shè)計好的模具中,然后讓其固化成型[34],因此也稱模具法。溶液澆鑄固化通?？刹捎美鋬龈稍锘蚬饨宦?lián)固化等方法。Zhou等[36]將碳納米管和聚己內(nèi)酯富馬酸酯(PCLF)混合溶液注入到玻璃模具中,并采用紫外線誘導(dǎo)的光交聯(lián)技術(shù)交聯(lián)聚合物(見圖2(e))。

4 高聚物/CNT復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管的應(yīng)用

高聚物/CNT復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管具有較好的電學(xué)性能,有利于神經(jīng)信號的傳遞,支持樹突延長和細(xì)胞黏附[41],能夠支持、促進(jìn)和引導(dǎo)缺損的軸突末端的再生。由表1可以看到,復(fù)合碳納米管的神經(jīng)導(dǎo)管材料具有較好的生物相容性,可以明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞、PC12細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等細(xì)胞的黏附、生長、增殖。從表1的動物實驗可以看到,一般在12～16周神經(jīng)再生基本完成,其功能基本得到恢復(fù),導(dǎo)電復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管在大鼠坐骨神經(jīng)、背部神經(jīng)等神經(jīng)的損傷修復(fù)中表現(xiàn)出較好的神經(jīng)再生效果。合適的電導(dǎo)率在神經(jīng)再生修復(fù)過程中可以支持受損神經(jīng)的電傳遞,促進(jìn)神經(jīng)元和軸突的生長,加快再生神經(jīng)纖維的髓鞘化與功能恢復(fù),從而促進(jìn)神經(jīng)肌肉再生[38],縮短神經(jīng)再生修復(fù)的周期[18,23]。一般電導(dǎo)率在10-4～10-3S/m時,神經(jīng)修復(fù)效果較好,過高的電導(dǎo)率反而會影響細(xì)胞活力,影響神經(jīng)再生效果。

5 結(jié)束語

碳納米管的高強(qiáng)度、低質(zhì)量、高導(dǎo)電性和生物相容性使其在生物傳感器[42-43]、生物電極[44]、生物顯像劑[28-29]、抗菌[45]和藥物輸送[46-47]等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用,特別是近年來碳納米管在人工神經(jīng)導(dǎo)管中的應(yīng)用漸成熱點(diǎn)。將高聚物和碳納米管復(fù)合材料用于周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的人工神經(jīng)導(dǎo)管的研究中,應(yīng)特別關(guān)注以下幾點(diǎn)。

1)碳納米管在神經(jīng)修復(fù)中的突出作用:一是由于其特有的納米形貌有利于與神經(jīng)細(xì)胞膜在納米尺度上作用,創(chuàng)造類細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境,從而促進(jìn)神經(jīng)元黏附生長,因此,將碳納米管與高分子材料復(fù)合時應(yīng)注意保留復(fù)合材料基質(zhì)的納米形貌;二是碳納米管優(yōu)異的電學(xué)性能可以促進(jìn)軸突生長,且與電刺激協(xié)同作用可最大程度地發(fā)揮碳納米管在神經(jīng)再生修復(fù)中的作用。

2)碳納米管雖然生物相容性較好,但是應(yīng)用于生物體內(nèi)時其細(xì)胞毒性與基因毒性仍然受到質(zhì)疑,對碳納米管表面進(jìn)行各種功能化改性不僅可改善其水溶性,提高可加工性,其細(xì)胞相容性也大大提高,且體內(nèi)實驗也證實功能化的碳納米管可以更好地促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生和修復(fù)。

3)將碳納米管與不同高聚物共混、交聯(lián),采用不同方法可制備出不同結(jié)構(gòu)的人工神經(jīng)導(dǎo)管,應(yīng)特別關(guān)注碳納米管的添加量以及神經(jīng)導(dǎo)管的降解速度,以確保不會因降解產(chǎn)物短時間過量而引起代謝毒性。