丁 健，陳 果，李建明，李開奇，楊晨一，伍月榕

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)、廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣西特色實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病證模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530200；2.湖北省中醫(yī)院脾胃病科，湖北 武漢 430060）

復(fù)方扶芳藤合劑（compound fufangteng mixture，CFM）是廣西壯族自治區(qū)特色中成藥，以扶芳藤為君，黃芪、紅參為臣，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、健脾養(yǎng)心的功效，主治氣血不足、心脾兩虛諸癥［1-3］。研究顯示，CFM 對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）具有動(dòng)員作用，可促進(jìn)大鼠BMSCs 的增殖能力［4-6］；具有改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［7］；可通過提高機(jī)體免疫能力及抗氧化能力進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用［8，9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CFM 可調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）免疫抑制小鼠 CD3-CD49b+NK細(xì)胞的免疫功能［10］及提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞吞噬率的作用［11］，但其調(diào)節(jié)單核細(xì)胞免疫機(jī)制尚不清楚。單核細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)免疫反應(yīng)有著舉足輕重的作用。本研究制備CTX 誘導(dǎo)小鼠免疫抑制模型，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察 CFM 對(duì)免疫抑制小鼠脾臟及外周血CD11b+單核細(xì)胞表面活化分子CD2、CD69 及耗竭分子PD-1、CD95 表達(dá)水平變化，進(jìn)一步探討CFM 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)Balb/c 雄性小鼠30 只，42～62 日齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.1.2 主要儀器 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，TC20）；高端分析型流式細(xì)胞儀（美國(guó) BD 公司，BD LSRFortessa）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo-Fisher， ST16R）

1.1.3 主要試劑 CFM 受贈(zèng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬百年樂藥廠（國(guó)藥準(zhǔn)字 Z4502181）；黃芪顆粒購(gòu)自南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20113052）；CTX 購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字 H32020857）；小鼠外周血、脾組織淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自Solarbio 公司；CD11b、CD2、CD69、PD-1 及CD95 流 式 抗 體 購(gòu) 自 美 國(guó) BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備［10］將30 只小鼠隨機(jī)分為空白組（Control 組）、免疫抑制模型組（CTX組）、CFM 高、中、低劑量干預(yù)組（CTX+CFM-H組、CTX+CFM-M 組、CTX+CFM-L 組）、黃 芪（Astragalus particles，AP）干預(yù)對(duì)照組（CTX+AP組）共6 組，每組5 只。

CTX 誘導(dǎo)免疫抑制模型參考課題組前期建模方式，模型組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)第1 至3天腹腔注射CTX（70 mg/kg），空白對(duì)照組腹腔注射相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 給藥及取材方法 各干預(yù)組在造模后開始給藥，給藥時(shí)間為10 d。CTX+CFM-H 組胃飼CFM 15 g/kg，qd；CTX+CFM-M 組胃飼CFM 7.5 g/kg，qd；CTX+CFM-L 組 胃 飼CFM 3.75 g/kg，qd；CTX+AP 組胃飼黃芪 5 g/kg，qd；Control 組及CTX 組胃飼生理鹽水0.15 mL/10 g，qd，所有動(dòng)物每日8∶30 開始自由進(jìn)食和飲水。

末次給藥后麻醉，摘眼球取血，取脾組織并稱重研磨。淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠外周血、脾組織單個(gè)核細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，配置50 μL 的細(xì)胞懸液，濃度為1×104個(gè)/μL，備檢。

1.2.3 流 式 細(xì) 胞 術(shù) 檢 測(cè)CD11b、CD2、CD69 及PD-1、CD95 表 達(dá) 情 況［12，13］取 預(yù) 先 配 置 好 的 單 個(gè)核細(xì)胞懸液各50 μL 分別加入CD11b、CD2、CD69、PD-1、CD95 抗體1 μL；4 ℃避光孵育30 min，離心，棄上清加入500 μL 含1%多聚甲醛稀釋液的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過FSC、SSC 選取脾組織、外周血單個(gè)核細(xì)胞，從選定的細(xì)胞中根據(jù)所標(biāo)記的熒光設(shè)門CD11b，再?gòu)腃D11b+細(xì)胞上設(shè)門 圈 出 CD2、CD69、PD-1、CD95 陽 性 細(xì) 胞群（圖1）。

圖1 設(shè)門策略Fig 1 Door setting strategy

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠外周血CD11b+細(xì)胞表面活化分子CD2、CD69 的表達(dá)情況

如圖2、表1 所示，小鼠外周血CD11b+單核細(xì)胞比值在各組間沒有顯著差異（P＞0.05）。小鼠外周血CD11b+單核細(xì)胞上CD69 的表達(dá)趨勢(shì)可見，CTX+CFM-M 組CD11b+單核細(xì)胞上CD69 的表達(dá)顯著高于CTX 組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.89）。CD11b+單核細(xì)胞上CD2 的表達(dá)水平在各組間沒有顯著的差異性（P＞0.05）。

2.2 小鼠外周血CD11b+細(xì)胞表面耗竭分子PD-1、CD95 的表達(dá)情況

如圖3、表2 所示，小鼠外周血CD11b+單核細(xì)胞比值于各組沒有顯著差異（P＞0.05）。小鼠外周血CD11b+單核細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)趨勢(shì)可見，CTX+CFM-M 組CD11b+單核細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)高于CTX 組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.74）。CD11b+單核細(xì)胞上CD95 的表達(dá)水平在各組間沒有顯著的差異性（P＞0.05）。

表2 小鼠外周血CD11b+細(xì)胞表面耗竭分子PD-1、CD95 亞群百分比Tab 2 Percentages of PD-1 and CD95 subsets on CD11b + cells in peripheral blood of mice

圖3 小鼠外周血CD11b+細(xì)胞表面耗竭分子PD-1、CD95的表達(dá)情況Fig 3 The expression of PD-1 and CD95 on CD11b + cells in peripheral blood of mice

2.3 小鼠脾組織CD11b+細(xì)胞表面活化分子CD2、CD69 的表達(dá)情況

如圖4、表3 所示，小鼠脾組織CD11b+單核細(xì)胞比值于各組間沒有顯著差異（P＞0.05）。CTX+CFM-M 組、CTX+CFM-L 組CD11b+CD69+單 核細(xì)胞的百分比顯著高于CTX 組（P=0.043 4、P=0.003 0），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組CD11b+CD69+單核細(xì)胞的百分比顯著高于Control 組，且比值隨著CFM 的劑量遞增而降低，提示CFM 可改善環(huán)磷酰胺致小鼠脾組織CD11b+單核細(xì)胞表達(dá)水平低下的癥狀。與CTX組相比，CTX+CFM-M組CD11b+CD 2+單核細(xì)胞表達(dá)水平降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），CTX+CFM-H 組、CTX+CFM-L 組 和CTX+AP 組CD11b+CD2+單核細(xì)胞表達(dá)水平有上調(diào)的趨勢(shì)（P=0.999 9、P=0.940 1、P=0.999 3、P=0.998 0）。

表3 小鼠脾組織CD11b+細(xì)胞表面活化分子CD2、CD69 亞群百分比Tab 3 Percentages of CD2 and CD69 subsets on CD11b + cells in mouse spleen

圖4 小鼠脾組織CD11b+細(xì)胞表面活化分子CD2、CD69 的表達(dá)情況Fig 4 Expression of CD2 and CD69 on the surface of CD11b + cells in mouse spleen

2.4 小鼠脾組織CD11b+細(xì)胞表面耗竭分子PD-1、CD95 的表達(dá)情況

如圖5、表4 所示，脾組織CD11b+單核細(xì)胞上CD95 和PD-1 的表達(dá)水平趨勢(shì)相似，CTX+CFM-H 組、CTX+CFM-M 組、CTX+CFM-L 組及CTX+AP 組表達(dá)均高于CTX 組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 小鼠脾組織CD11b+細(xì)胞表面耗竭分子PD-1、CD95 亞群百分比Tab 4 Percentage of CD11b + cell surface depletion molecules PD-1 and CD95 subsets in mouse spleen

圖5 小鼠脾組織CD11b+細(xì)胞表面耗竭分子PD-1、CD95 的表達(dá)情況Fig 5 The expression of PD-1 and CD95 on the surface of CD11b + cells in mouse spleen

3 討論

免疫功能低下是影響疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素。CFM 是由扶芳藤、黃芪、紅參三味藥物組成，現(xiàn)代藥理研究表明，扶芳藤具有提高機(jī)體免疫功能、抗氧化、抗衰老等功效［14-18］，在臨床上，常用于治療腫瘤患者術(shù)后和AIDS 等免疫功能低下等相關(guān)疾病。但對(duì)免疫細(xì)胞和免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要探索研究。CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型是常用的免疫功能低下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，其免疫抑制作用與上調(diào)某些免疫負(fù)調(diào)控分子有關(guān)［19-21］。本課題組前期采用CTX 誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型發(fā)現(xiàn) CFM 不僅可以提高 NK 細(xì)胞百分比，同時(shí)可上調(diào)小鼠外周血CD3-CD49b+NK 細(xì) 胞 CD69+表 達(dá) 水 平［10］，具 有 增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的作用。

單核細(xì)胞作為機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇提呈給淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)［22，23］。本研究利用CTX 制備小鼠免疫模型，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量CFM 對(duì)免疫抑制小鼠脾及外周血CD11b+單核細(xì)胞表面活化分子CD2、CD69 及耗竭分子PD-1、CD95 表達(dá)水平變化情況，以期探討CFM 對(duì)免疫抑制小鼠單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

結(jié)果顯示，CFM 對(duì)恢復(fù)脾組織CD11b+單核細(xì)胞比值起到一定作用，但在外周血中各組CD11b+單核細(xì)胞比值沒有顯著的差異。耗竭相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)中，小鼠外周血及脾組織CD11b+單核細(xì)胞CD95 和PD-1 表達(dá)趨勢(shì)相似，組間沒有顯著的差異性；表面活化相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)中，與Control 組和CTX 組相比，所有藥物干預(yù)組脾組織 CD11b+CD2+單核細(xì)胞表達(dá)水平均有上調(diào)趨勢(shì)，與Control 組沒有顯著的差異。外周血各組間CD11b+CD2+單核細(xì)胞表達(dá)沒有顯著差異，提示CFM 可能具有恢復(fù)脾組織CD11b+CD2+單核細(xì)胞表達(dá)水平的作用。Control 組和CTX 組脾CD11b+單核細(xì)胞CD69 的表達(dá)組間沒有顯著變化，但所有藥物干預(yù)組的CD11b+單核細(xì)胞CD69 的表達(dá)值顯著高于Control組、CTX 組，且隨CFM 濃度梯度表達(dá)升高?，F(xiàn)代研究表明，CD69 具有免疫調(diào)節(jié)作用［24，25］，CD69 可以通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的平衡來恢復(fù)免疫功能。由此推測(cè)CFM 可能是通過提高CD69 的表達(dá)來恢復(fù)脾組織CD11b+單核細(xì)胞的比值?，F(xiàn)有研究對(duì)淋巴細(xì)胞CD69 研究較多，對(duì)單核細(xì)胞上CD69 的表達(dá)探索甚少，本研究充實(shí)了這一方面的發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，本研究初步明確了CFM 對(duì)單核細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，但其具體機(jī)制仍有待闡明。計(jì)劃從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及核轉(zhuǎn)錄因子角度開展進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

丁健：文章撰寫；陳果、李建明：樣本采集制備；李開齊、楊晨一：流式上機(jī)監(jiān)測(cè)；伍月榕：數(shù)據(jù)分析。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。