張朝升，徐子云，范玉純，農(nóng)敏玉，黃佳怡，蔣利和，，

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣西 百色 533000；2.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣西 百色 533000）

肝細(xì)胞癌（HCC）在全球癌癥發(fā)病率中排名第五，在癌癥相關(guān)死亡率中排名第三［1，2］。盡管近年來(lái)手術(shù)、射頻消融、動(dòng)脈化療栓塞、靶向治療和新興的免疫療法在治療上取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但HCC 患者的生存率仍有待進(jìn)一步提高，而且大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，所以大多數(shù)患者預(yù)后不佳［3-5］。此外用于監(jiān)測(cè)和診斷早期肝細(xì)胞癌的有用生物標(biāo)記物仍然不足，因此，人們不斷尋求新的預(yù)后標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)，以改善肝癌患者的預(yù)后。

Pre-mRNA 加工因子18（pre-mRNA processing factor 18，PRPF18， 別名PRP18，HPRP18），在脂肪、大腦等組織中廣泛表達(dá)。在裂殖酵母中，PRP18具有內(nèi)含子特異性剪接功能，其與G1～S 細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)［6］。PRPF18在mRNA 的剪接中發(fā)揮重要作用。PRPF18與U5 snRNP 相關(guān)，并在前mRNA剪接的催化步驟Ⅱ中發(fā)揮重要作用，以穩(wěn)定外顯子末 端 與U5 snRNA 環(huán)1 的 相 互 作 用［7，8］。有 報(bào) 道 表明，PRPF18的表達(dá)與肺腺癌無(wú)疾病存活相關(guān)［9］，可作為子宮內(nèi)膜癌的潛在靶點(diǎn)［10］。但是PRPF18在肝癌中的作用迄今未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)分析了PRPF18在肝癌中的表達(dá)情況，并對(duì)其預(yù)后以及藥物敏感性的相關(guān)性進(jìn)行了分析。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了敲低PRPF18對(duì)MHCC97H 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及凋亡能力的影響，為肝癌的臨床診斷和藥物開(kāi)發(fā)提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 MHCC97H、HepG2 肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，LO2 人正常肝組織細(xì)胞受贈(zèng)于廣西大學(xué)吳黎川老師。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM 培養(yǎng)基（英國(guó)原裝進(jìn)口，批號(hào)D6429），胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gemini 公司，批號(hào)900-108），青霉素-鏈霉素雙抗（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)P1400），磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)P1020），Lipofectamine 3000（美國(guó)賽默飛公司，批號(hào)L3000015），無(wú)菌無(wú)酶水（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)R1600），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)賽默飛公司，批號(hào)K16225），Universal SYBR Green Master（美國(guó)羅氏公司，批號(hào)04913914001），細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）（美 國(guó)MCE 公 司，批 號(hào)HY-K0301），0.1%草酸銨結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1063），4%多聚甲醛組織固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)P1110），Hoechst 33342 試劑（上海碧云天公司，批號(hào)C1025），線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（jc-1）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)M8650）等。

1.1.3 儀器 生物安全柜（美國(guó)賽默飛公司），CO2培養(yǎng)箱（上海力新儀器有限公司），移液器（美國(guó)賽默飛公司），低溫冰箱（青島海爾公司），通風(fēng)櫥（深圳觀瀾設(shè)備廠），微型紫外分光光度計(jì)（北京天根公司），PCR 基因擴(kuò)增儀（德國(guó)艾本德公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)羅氏公司），低溫高速離心機(jī)（北京大龍公司），常溫低速離心機(jī)（上海安亭儀器廠），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（江蘇卓輝生物科技有限公司），多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)伯托科技公司），實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰公司），倒置顯微鏡和倒置熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 癌癥基因組圖譜（TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov/）是 一 個(gè) 公 共 數(shù) 據(jù)庫(kù)［11］，通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載374 例肝癌樣品和50例肝正常組織樣品的RNA 測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。

TCGA 向公眾開(kāi)放，所有數(shù)據(jù)都已同意用于分析，并獲得了道德認(rèn)可。本研究基于開(kāi)源數(shù)據(jù)，嚴(yán)格遵守?cái)?shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)布指南和訪問(wèn)策略，不受其他道德規(guī)范的約束。

1.2.2PRPF18在肝細(xì)胞癌中的差異分析 使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載33 種癌癥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Perl 軟件進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換和基因表達(dá)量提取，最后使用R 軟件“ggpubr”包分析PRPF18在泛癌中的差異表達(dá)。使用R 軟件“l(fā)imma、ggplot2、ggpubr”包分析PRPF18在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)，并進(jìn)行可視化處理。

1.2.3PRPF18的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)性分析 基 于UALCAN 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//ualcan.path.uab.edu/）通過(guò)使用Kaplan-Meier 曲線評(píng)估在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中PRPF18對(duì)肝癌患者生存的影響。將肝癌患者的PRPF18的表達(dá)量分為高、低表達(dá)兩組是以PRPF18的表達(dá)值的中位值為界。其中P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) MHCC97H、HepG2、LO2 這三種細(xì)胞使用含有10%的FBS 及1%的青鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將其放置于含5%CO2的37 °C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［12］。

1.2.5PRPF18分組 實(shí)驗(yàn)分為兩組：對(duì)照組（無(wú)意義 序 列，未 敲 低PRPF18）；siPRPF18組（敲 低PRPF18）；陽(yáng)性對(duì)照組（確定已知為陽(yáng)性）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 RNA 提取和定量實(shí)時(shí)PCR 總RNA 提取依據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)（Axygen， suzhou，China）進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄cDNA 的完成使用Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。通過(guò)Roche FastStart Universal SYBR Green Master （Rox）來(lái)完成定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。基因的相對(duì)表達(dá)通過(guò)2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，對(duì)照為GAPDH。引物來(lái)自于生工生物（中國(guó)上海）。GAPDH的引物序列是：（F： 5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’； R： 5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’）.PRPF18的 引 物 序 列 是：（F：5’-TGACAAAAGGGTTTACTTGGGTG-3’；R：5’-CTCATTGACGAAGGAAATGGCT-3’）。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用qRT-PCR 驗(yàn)證PRPF18在肝癌中的表達(dá)水平，選取MHCC97H 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 按照Lipofectamine 3000 試劑說(shuō)明書(shū)，將siPRPF18和對(duì)照在MHCC97H 細(xì)胞約70%的細(xì)胞密度時(shí)轉(zhuǎn)染至其中，轉(zhuǎn)染后48 h 通過(guò)qRT-PCR 評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。siRNA 的序列是：（F： 5’-GGCUACAAGCCUAUAAAUGTT-3’；R： 5’-CAUUUAUAGGCUUGUAGCCTT-3’）。

1.2.8 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（4×103/孔）均勻鋪于96 孔板中且轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h 后［13］，將CCK-8 試 劑 加 入96 孔 板 中，每 孔10 μL，并將其置于培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96 孔板在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值［14］。

1.2.9 克隆形成實(shí)驗(yàn) MHCC97H 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔1.0×103個(gè)細(xì)胞鋪于6 孔板中。生長(zhǎng)14 d 后用組織細(xì)胞固定液、甲醇、10%龍膽紫固定及染色，ImageJ 分析，計(jì)數(shù)［14］。

1.2.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 當(dāng)接種的MHCC97H 在轉(zhuǎn)染48 h 后細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用10 μL槍頭在6 孔板底部畫(huà)一條直線，PBS 緩沖液清洗，顯微鏡鏡下拍照，然后將培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，24 h 后再次拍照［14］。

1.2.11 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的MHCC97H 細(xì)胞用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋至1×105/mL，將200 μL 細(xì)胞懸液加入上室（Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)，上室鋪基質(zhì)膠），600 μL 含10%FBS 的培養(yǎng)基加入下室。24 h 后，用結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察。

1.2.12 Hoechst33342 實(shí) 驗(yàn) 通 過(guò)Hoechst 33342 染色（Beyotime Biotechnology， Shanghai， China）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到6 孔板中，在培養(yǎng)基中加入1 mL Hoechst 33342 染料孵育30 min，避光，然后用PBS 洗滌兩次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.13 線粒體膜電位測(cè)定 采用JC-1 試劑盒（Beyotime Biotechnology， Shanghai， China）檢 測(cè) 膜 電位。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6 孔板中，用JC-1 試劑盒進(jìn)行染色，避光，然后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.14PRPF18藥物敏感性的分析 基于藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（GDSC，https：//www.cancerrxgene.org/）通過(guò)使用R 包“pRRophetic”來(lái)評(píng)估PRPF18高低表達(dá)組間的藥物敏感性，來(lái)預(yù)測(cè)肝癌患者的可用藥物。

1.2.15 統(tǒng)計(jì)分析 使用R v4.0.4 軟件、SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism5 軟件進(jìn)行分析、繪圖。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PRPF18 在肝癌中高表達(dá)

使 用Perl 和R 軟 件 評(píng) 估PRPF18在TCGA 泛癌中的表達(dá)［15］，結(jié)果顯示，PRPF18在CHOL、ESCA、STAD 等腫瘤組織中高表達(dá)，在COAD、GBM、KICH、KIRC、PCPG、PRAD、READ 等腫瘤組織中低表達(dá)［16］，尤其在肝癌中，PRPF18的表達(dá) 顯著升高［17］（圖1A、B）。PRPF18的表達(dá)量在qRT-PCR 中的結(jié)果顯示，PRPF18的表達(dá)水平在HepG2，MHCC97H 中均比正常細(xì)胞LO2 高（圖1C），結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026；P=0.036）。

圖1 PRPF18 的表達(dá)Fig 1 Expression of PRPF18

2.2 PRPF18 的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)性

根據(jù)PRPF18表達(dá)的中位數(shù)，將肝癌患者分為PRPF18高表達(dá)組和PRPF18低表達(dá)組。如圖2 所示，GEPIA 2 網(wǎng) 站Kaplan-Meier 生 存 分 析 顯 示［18］，PRPF18高表達(dá)患者比低表達(dá)患者的預(yù)后更差（圖2）。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

MHCC97H 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，轉(zhuǎn)染效率使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖3），siPRPF18 組的mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組相比降低（P=0.016）。

圖3 PRPF18 轉(zhuǎn)染后mRNA 相對(duì)表達(dá)水平Fig 3 The transfection efficiency of PRPF18 in hepatocellular carcinoma cells

2.4 敲低PRPF18 抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞抑制（P=0.005）（圖4A）。與對(duì)照組相比，siPRPF18 組細(xì)胞在克隆形成實(shí)驗(yàn)中顯示克隆減少（P=0.006）（圖4B）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低PRPF18可以有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。率升高，72 h、96 h 的細(xì)胞OD 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖4 敲低PRPF18 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig 4 Effect of silencing PRPF18 on the proliferation ability of HCC cells

2.5 敲低PRPF18 抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力

根據(jù)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察到siPRPF18 組肝癌細(xì)胞的劃痕愈合率與對(duì)照組相比明顯降低（P=0.025）（圖5A）。 通 過(guò)Transwell 遷 移 實(shí) 驗(yàn)［19］，siPRPF18 組肝癌細(xì)胞在縱向遷移能力方面與對(duì)照組相比顯著降低（P=0.000 2）（圖5B）。這些結(jié)果表明，敲低PRPF18可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力。

圖5 敲低PRPF18 對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響Fig 5 Effect of silencing PRPF18 on migration of HCC

2.6 敲低PRPF18 對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

siPRPF18 組細(xì)胞侵襲數(shù)目與對(duì)照組相比減少（P=0.005）（圖6）。結(jié)果表明，敲低PRPF18抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.7 敲低PRPF18 可降低肝癌細(xì)胞線粒體膜電位， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡

通過(guò)研究PRPF18對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，使用Hoechst 33342 染色染料檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示siPRPF18 組細(xì)胞凋亡明顯高于對(duì)照組（圖7A）。在線粒體膜電位的檢測(cè)中，對(duì)照組線粒體膜電位明顯高于siPRPF18 組（圖7B）。

2.8 藥物敏感性分析

在GDSC 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選，找出了對(duì)于PRPF18在抗肝癌藥物中敏感性差異最大的兩種藥物。結(jié)果顯示，PRPF18高表達(dá)組患者對(duì)替吡法尼和舒尼替尼有更高的敏感性（圖8）。可能有助于替吡法尼和舒尼替尼的致敏治療。

圖8 PRPF18 的藥物敏感性分析Fig 8 Drug senstivity analysis of PRPF18

3 討論

PRPF18對(duì)肝癌以及肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響研究較少，在本研究中，首先使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析PRPF18在肝癌中的差異表達(dá)及預(yù)后［20］。結(jié)果顯示，PRPF18在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)量顯著高于正常組織。預(yù)后的相關(guān)分析中，PRPF18高表達(dá)組肝癌患者的生存較低表達(dá)組要差。此外，通過(guò)qRT-PCR 也驗(yàn)證了PRPF18在MHCC97H，HepG2中的表達(dá)水平比人正常肝組織細(xì)胞LO2 中的表達(dá)水平要高。所以，PRPF18在肝癌中高表達(dá)且對(duì)肝癌患者的生存預(yù)后緊密相關(guān)。

CCK-8 實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明敲低PRPF18抑制MHCC97H 細(xì)胞增殖，劃痕實(shí)驗(yàn)表明敲低PRPF18抑 制MHCC97H 細(xì) 胞 的 遷 移，Transwell 實(shí)驗(yàn)表明敲低PRPF18抑制MHCC97H 細(xì)胞的遷移和侵襲。Hoechst 實(shí)驗(yàn)和線粒體膜電位檢測(cè)顯示，敲低PRPF18促進(jìn)MHCC97H 細(xì)胞凋亡。

藥物敏感性分析顯示，PRPF18高表達(dá)患者對(duì)替吡法尼和舒尼替尼更敏感（P＜0.001）。替吡法尼是一種特異性法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。有研究發(fā)現(xiàn)，與一些抗腫瘤藥物聯(lián)用時(shí)，耐受性良好。替吡法尼可以抑制多種信號(hào)通路中的酪氨酸激酶，如Raf 激酶［21，22］，可以減緩肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。舒尼替尼是一種口服低分子量抑制劑，它能夠抑制多個(gè)靶點(diǎn)的酪氨酸激酶活性，如VEGF-R1 和RET 等［23］；通過(guò)減少腫瘤血管生成，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［24］；通過(guò)聯(lián)合使用舒尼替尼和射頻消融，可以明顯抑制肝癌的生長(zhǎng)［25］。因此，通過(guò)分析PRPF18與抗癌藥物敏感性之間的關(guān)系，可為探索替吡法尼和舒尼替尼在肝癌患者中的治療以及減少耐藥反應(yīng)提供參考。

綜上所述，PRPF18在肝癌中高表達(dá)且對(duì)肝癌患者有預(yù)后價(jià)值，敲低PRPF18抑制MHCC97H 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)楹罄m(xù)肝癌靶向治療提供相應(yīng)的理論支持。但是這項(xiàng)研究仍然有一些局限性，未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，需要后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

張朝升、徐子云、范玉純：研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，張朝升、徐子云：文章撰寫(xiě)，農(nóng)敏玉、黃佳怡：校對(duì)草稿；蔣利和：全面指導(dǎo)研究，實(shí)驗(yàn)校對(duì)，論文撰寫(xiě)指導(dǎo)，經(jīng)費(fèi)資助。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。