白麗萍 張穎慧 楊雪艷 白麗仙 馬志堅

(1.云南大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,云南 昆明 650021;2.玉溪市人民醫(yī)院兒科,云南 玉溪 653199;3.昆明市第一人民醫(yī)院急診科,云南 昆明 650031)

乙型病毒性肝炎(以下簡稱乙型肝炎)是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染常見的慢性病毒感染疾病[1],臨床上通常采用血清學(xué)標(biāo)志物對乙型肝炎進(jìn)行篩查,其中乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)具有較強的免疫性原,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗-HBs,從而與外周血中循環(huán)HBsAg和HBV顆粒進(jìn)行特異性中和反應(yīng),二者無法共存[2-3]。然而,臨床研究證實[4],HBV感染者可能存在HBsAg/抗-HBs雙陽性的異常情況,且機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)HBsAg與抗-HBs雙陽性可能會促進(jìn)肝纖維化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展[5]。目前的研究[6-7]認(rèn)為,HBsAg/抗-HBs均為陽性與HBsAg的核苷酸序列發(fā)生變異有關(guān),尤其是MHR、a決定簇突變,但由于患者感染HBV的基因型存在差異,導(dǎo)致國內(nèi)外研究結(jié)果對于HBsAg/抗-HBs雙陽患者HBsAg中氨基酸發(fā)生突變最常見位點存在差異。因此,本研究旨對HBsAg/抗-HBs雙陽性慢性HBV感染患者進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,并進(jìn)一步分析患者PreS的基因突變特征,以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年5月—2022年4月于云南大學(xué)附屬醫(yī)院門診定量檢測乙肝兩對半的438例慢性HBV感染患者為觀察對象,將202例HBsAg/抗-HBs同時陽性者作為觀察組,將236例HBsAg(+)/抗-HBs(-)的慢性HBV感染者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①HBV DNA >103IU/mL,HBsAg陽性。②臨床病理資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他病毒性肝炎。②合并免疫功能障礙。

1.2 主要儀器與試劑 ADV2400全自動生化分析儀(Simens,德國),熒光定量PCR儀(Roche,瑞士),ABI7300熒光定量PCR檢測儀(ABI,美國)。HBV核酸定量測定試劑盒(上海通派生物科技有限公司),病毒DNA/RNA提取試劑盒(ThermoFisher, 美國),ALT檢測試劑盒(Simens,德國),Premix Taq、PMD 19-T Vector Cloning Kit、E.coli JM109 Competent Cells及PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TaKaRa,日本)。

1.3 檢測HBsAg與抗-HBs 采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行HBsAg與抗-HBs檢測,檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒操作規(guī)程。判定標(biāo)準(zhǔn):HBsAg>0.05 IU/mL為陽性;抗-HBs>10 mIU/mL為陽性。

1.4 血清HBV DNA提取及檢測 采集血清樣本,提取HBV DNA,使用ABI7300熒光定量PCR檢測儀進(jìn)行定量檢測,檢測范圍為5×102～5×109IU/mL。

1.5 HBV DNA 的PreS/S 區(qū)PCR擴增與序列檢測 使用Expand High Fidelity PCR system進(jìn)行巢式PCR擴增,第一輪以HBV DNA為模板,第二輪以第一輪PCR產(chǎn)物為模板。PCR引物由上海生工合成,第一輪擴增引物:HBV Del-F-out:5′-GCCTCATTTTGYGGGTCACCATATTC-3′;HBV Del-F-in:5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3′; HBV-975:5′-AATTCGTTGACANACTTTCCAATCAAT。第一輪PCR反應(yīng)體系為:ExTaq 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、并無菌去離子水補足至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃變性10 s,55 ℃退火15s,72 ℃延伸90s,共39個循環(huán),最后72 ℃修復(fù)延伸5 min。第二輪PCR反應(yīng)體系為:ExTaq 25 μL、上下游引物各1 μL、并無菌去離子水補足至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸90 s,共39個循環(huán),最后72 ℃修復(fù)延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物目的條帶,并送至上海生工進(jìn)行測序,測序結(jié)果用CExpress、BioEdit等軟件進(jìn)行拼接,并于NCBI的GenBank中HBV野生株對比,確定基因型。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者年齡頻數(shù)分布 統(tǒng)計兩組不同年齡段患者人數(shù)結(jié)果顯示,觀察組HBV感染者在<10歲及高于80歲HBsAg陽性人群更多見,而對照組HBV感染者在20～49歲HBsAg陽性人群更多見,見圖1。

圖1 兩組患者年齡頻數(shù)分布折線圖

2.2 兩組患者臨床特征比較 與對照組比較,觀察組患者年齡更大、HBsAg<250 IU/mL比例和HBV基因C型比例更高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者臨床特征比較

2.3 兩組不同基因型患者臨床資料比較 成功擴增PreS/S并測序成功的觀察組樣本共132例,其中B型基因81例,C型基因51例;對照組樣本中B型基因110例,C型基因65例。對比兩組患者臨床資料,結(jié)果顯示,與觀察組比較,對照組HBV DNA更高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其他臨床資料兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 不同基因型患者臨床資料比較

2.4 兩組HBsAg氨基酸突變率比較 對比兩組患者氨基酸突變率發(fā)現(xiàn),B型基因患者中,與對照組比較,觀察組N末端區(qū)域突變率更高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),兩組患者C末端區(qū)域、MHR、a決定簇突變率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。C型基因患者中,與對照組比較,觀察組MHR、a決定簇及N末端區(qū)域突變率更高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 不同基因型患者HBsAg氨基酸突變率比較[n(×10-2)]

2.5 兩組PreS基因缺失突變特征 PreS基因缺失突變位點及缺失大小,見表4。132份觀察組樣本中,PreS基因缺失突變發(fā)生率為25.00%(33/132),其中81例B型基因患者PreS基因缺失突變14例(17.28%),51例C型基因患者中PreS基因缺失突變19例(37.25%),而在對照組中未發(fā)現(xiàn)PreS基因缺失突變與對照組比較,觀察組PreS基因缺失突變率更高(0/110vs33/81),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 PreS基因缺失突變位點及缺失大小

3 討論

HBV感染患者血清HBsAg/抗-HBs雙陽性在臨床HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測中不多見,目前機制尚不明確,多認(rèn)為與基因突變、免疫逃逸及不同血清亞型共感染有關(guān)[8]。有研究[9]證實,HBsAg/抗-HBs雙陽性與肝纖維化、母嬰阻斷失敗的發(fā)生密切相關(guān),可能是誘發(fā)肝癌的獨立危險因素。因此,對慢性HBV感染患者的臨床特征進(jìn)行分析,并探究其流行病學(xué)模式對于肝病防治具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示,HBsAg/抗-HBs雙陽性HBV感染者在<10歲及高于80歲HBsAg陽性人群多見,分析可能的原因為低齡兒童機體免疫功能尚未完善,隨著年齡的增長,免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟,抗HBs陽性率逐漸降低[10];對于老年人群,其易感染不同基因型HBV,且其免疫功能較年輕人群顯著降低,HBV S蛋白突變增加,抗HBs陽性率逐漸增加[11]。而HBsAg(+)/抗-HBs(-)患者在30～39歲HBsAg陽性人群更多見,分析可能的原因為上世紀(jì)90年代開始我國開始推廣新生兒HBV疫苗接種,極大的降低了新生兒的感染率,而20～49歲人群的獲益情況不佳,感染率明顯增加,隨著機體功能的變化,HBV感染者進(jìn)展為肝癌、肝硬化等導(dǎo)致其死亡,降低了抗HBs陽性率[12]。進(jìn)一步分析兩組患者的臨床特征發(fā)現(xiàn),觀察組患者年齡較對照組顯著增加,HBsAg>250IU/mL患者則較對照組顯著降低,與傅曉春等[13]的研究結(jié)果一致。兩組患者的臨床診斷結(jié)果顯示,觀察組乙肝攜帶者比例較對照組顯著增加,結(jié)合既往研究結(jié)果[14-15],我們推測抗-HBs對HBsAg具有部分中和作用,對HBsAg/抗-HBs雙陽性患者具有一定的保護(hù)效應(yīng)。此外,C型HBV感染者比例較對照組顯著增加,而有研究結(jié)果顯示,在我國南方城市C型HBV感染比例顯著高于B型人群[16],推測可能與基因突變位點相關(guān)。

目前的研究[17]認(rèn)為,血清中HBsAg/抗-HBs雙陽性與HBsAg突變,尤其是MHR和a決定簇有關(guān),HBsAg突變可引起抗原性改變,抑制HBsAg與HBs的結(jié)合,導(dǎo)致血清HBsAg/抗-HBs雙陽性。本研究中HBsAg/抗-HBs雙陽性患者HBV PreS/S區(qū)核苷酸替換突變率高于單陽患者,與B型基因比較,C型基因HBsAg突變率更高,且在B型基因患者中,單陽患者N末端區(qū)域突變顯著低于雙陽患者,而在C型基因患者中,雙陽患者M(jìn)HR、a決定簇及N末端區(qū)域氨基酸突變率均顯著高于單陽患者。a決定簇是S蛋白免疫優(yōu)勢區(qū),位于aa124～147[18],本研究C型基因患者突變位點位于a決定簇aa126位點,與國外研究存在差異,推測可能與觀察對象HBV基因型存在差異有關(guān)。研究[19]表明,C型基因在病毒復(fù)制水平上明顯高于B型基因,且更容易引起肝炎、肝硬化等。但HBsAg/抗-HBs雙陽患者比例較低,相關(guān)的免疫突變關(guān)系仍需進(jìn)行深入研究。HBsAg/抗-HBs雙陽性HBV感染患者中存在PreS基因缺失突變,PreS編碼的蛋白是病毒結(jié)合及免疫反應(yīng)的重要靶點,其突變?nèi)笔Э赡軐?dǎo)致肝損害加重[20]。本研究中雙陽HBV感染患者PreS基因缺失突變發(fā)生率為25.00%,且在B型和C型基因患者中存在顯著差異,而在單陽患者中未發(fā)現(xiàn)PreS基因缺失突變。但本研究納入的樣本量較少且數(shù)據(jù)來自單一中心,增加了選擇偏倚的風(fēng)險,尚需增加樣本數(shù)量及來源深入研究以得出更為可靠的結(jié)論。

4 結(jié)論

HBsAg/抗-HBs雙陽性HBV感染者在<10歲及高于80歲HBsAg陽性人群多見,提示HBsAg/抗-HBs雙陽性可能與HBsAg突變及PreS基因突變有關(guān)。