饒運佳 嚴瑾 王文茜 朱冬梅 林濤 王潔 向小聰 陳竹 馮剛

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細胞研究所,四川 南充 637000)

惡性黑色素瘤(Metastatic melanoma,MM)是一種由皮膚和其他器官的黑色素細胞產(chǎn)生的腫瘤,是一種侵襲性和惡性程度很高的腫瘤[1]。外科手術(shù)治療仍是惡性黑色素瘤的首選治療方案[2],但手術(shù)治療無法解決黑色素瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題[3]。由于黑色素瘤對放化療并不敏感,因此放化療在黑色素瘤的治療中受到了很大的限制。因此,積極探索黑色素瘤新的治療方式是非常必要的。光熱治療(Photothermal therapy,PTT)是近年來新興的腫瘤療法。光熱治療主要是通過光敏劑將光能轉(zhuǎn)化成熱能,造成腫瘤局部高溫從而殺傷腫瘤細胞[4]。近年來,PTT在淺表腫瘤的治療中顯示出了良好的應(yīng)用前景。目前,光熱治療的研究方向主要集中在利用人工修飾的納米光敏劑介導(dǎo)光熱治療。納米尺寸的光敏劑可以通過粒徑依賴的高通透性和滯留效應(yīng) (Enhanced permeability and retention effect,EPR效應(yīng))被動靶向腫瘤組織;也可以通過連接靶向基團主動靶向腫瘤組織,從而富集在腫瘤組織深部,對腫瘤深部組織產(chǎn)生治療作用,其熱療的效果極大地優(yōu)于目前臨床所采用的傳統(tǒng)熱療。納米金粒子(Au)具有良好的光熱轉(zhuǎn)化效率,是一種理想的光熱治療材料。多巴胺可以在溫和的條件下包裹修飾納米金粒子,改善Au的生物相容性。同時,多巴胺本身也具有良好的光熱轉(zhuǎn)化效率,可以協(xié)同增強Au的光熱轉(zhuǎn)化效率。更重要的是多巴胺含有豐富的官能團,可以進一步接枝其他功能基團。因此,本研究中我們嘗試利用多巴胺修飾的納米金粒子(Au@PDA)作為光熱治療的光熱材料,探索其在體內(nèi)外對黑色素瘤細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 氯金酸溶液和檸檬酸鈉粉末均購于中國上海源葉生物科技有限公司,鹽酸多巴胺購買于美國Sigma公司,小鼠黑色素瘤細胞(B16F0)購于中國科學(xué)院上海細胞庫,胎牛血清和1640培養(yǎng)液均購于美國Thermo公司,0.25%胰酶購于美國Gibco公司,CCK-8試劑盒購于中國凱基生物科技發(fā)展有限公司,Annexin V/PI凋亡試劑盒購于中國南京諾唯贊生物科技股份有限公司,Mouse HMGB1 ELISA KIT購于中國廣州睿信生物科技有限公司,CD4一抗購買于美國ABcam公司,CD8一抗購于美國Cell signaling Technology公司,二抗購于中國賽維爾生物有限公司,其余化學(xué)試劑均為市售分析純。流式細胞儀(FACS Calibur,美國BD公司),納米粒度儀 Zeta 電位分析儀(DLS,ZS90,英國 Malvern 公司),透射電子顯微鏡 (TEM,Tecnai G2 F20S-TWIN,美國 FEI 公司),倒置顯微鏡(DMi8,德國Leica公司),光纖激光器(中國西安鐳澤電子科技有限公司),ICP-OES (ARCOS,德國Spectro公司),FLIR ONE紅外熱像儀(美國FLIR公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料的制備

1.2.1.1 Au的制備 ①氯金酸溶液工作液配制:取30.6 μL氯金酸溶液于5 mL去離子水中,混勻,避光。②檸檬酸鈉工作液配制:準確稱取檸檬酸鈉粉末1 g,溶于100 mL去離子水中,快速攪拌或超聲使檸檬酸鈉完全溶解。③Au的制備:取1 mL氯金酸工作液和5 mL檸檬酸鈉工作液溶解于100 mL去離子水中,攪拌混勻。100 ℃加熱使之快速沸騰2.5 min后,調(diào)至80 ℃,維持沸騰狀態(tài)5 min,溶液由透明變?yōu)榫萍t色,可得Au,室溫冷卻后,13000 rpm,離心20 min,棄去上清液。

1.2.1.2 Au@PDA的制備 ①Tris-HCl溶液配制:取Tris粉末2.42 g于2 L去離子水中,調(diào)pH為8.8,充分混勻。②將80 mg 鹽酸多巴胺和10 mL Au加入到480 mL的Tris-HCl溶液中,再蓋上保鮮膜,于45 ℃下充分攪拌2 h;先在5 000 rpm下離心10 min,再在離心力10 000 g下離心15～20 min,吸去上清液,去離子水洗去多余的多巴胺,可得多巴胺包裹的納米金粒子(Au@PDA)。

1.2.2 納米粒子的表征 將Au和Au@PDA樣品分散于乙醇中,并滴在銅網(wǎng)上,干燥噴金后通過TEM表征其形貌;將Au和Au@PDA的稀釋液體樣品置于比色皿中,使用納米粒度儀測試樣品水合粒徑和Zeta電位。

1.2.3 體外光熱性能考察 將制備好的Au和Au@PDA用去離子水配制成溶液,用ICP-OES對溶液中Au進行定量,使溶液中Au的濃度為0.2 g/L。取400 μL液體置于1.5 mL EP管中,用808 nm激光(1 W/cm2)照射10 min,然后關(guān)閉激光,恢復(fù)至室溫。用紅外熱像儀記錄照射后溶液溫度的變化。循環(huán)照射3次,觀察Au和Au@PDA粒子溫度變化,繪制溫度-時間變化曲線。每組實驗3個平行樣品。

1.2.4 細胞培養(yǎng)及分組 B16F0用含有10% FBS的1640培養(yǎng)基,37 ℃ 5% CO2條件進行培養(yǎng),每日觀察細胞生長狀態(tài),定期換培養(yǎng)基,當(dāng)細胞融合度達到80%～90%時,用0.25%胰酶消化傳代。將B16F0細胞加入含有2.5 μL的Au(Au為0.2 g/L)、Au@PDA(Au為0.2 g/L)、生理鹽水的培養(yǎng)基分別記為Au組、Au@PDA組、Control組。將Au組、Au@PDA組細胞培養(yǎng)6 h后,1 W/cm2的808 nm激光照射20 min,分別記為Au+NIR組和Au@PDA+NIR組。

1.2.5 體外對黑色素瘤生長的影響

1.2.5.1 細胞相容性實驗 5組B16F0細胞(每孔8×103個細胞)接種于96孔板中,分別在0、24和48 h使用CCK-8法測定細胞存活率。

1.2.5.2 細胞遷移檢測 5組B16F0細胞(每孔2×104個細胞)接種于12孔板中,培養(yǎng)36 h后,用20 μL的槍頭在孔板上劃3條直線,并用生理鹽水洗兩次后加入相應(yīng)的細胞培養(yǎng)液,分別于0、12 、24 h于顯微鏡下拍照,用Image J處理并計算細胞遷移率,細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5.3 細胞凋亡檢測 5組B16F0細胞(每孔2×104個細胞)接種于12孔板中,培養(yǎng)12 h后,向孔板中加入相應(yīng)的細胞培養(yǎng)液,光照48 h后,用Annexin V/PI凋亡試劑盒染色后,流式細胞儀分析。

1.2.5.4 HMGB1檢測 B16F0細胞(每孔1×104個細胞)接種于24孔板中,培養(yǎng)12 h后,向孔板中加入相應(yīng)的培養(yǎng)液,48 h后再次按照相同方法光照,光照后立即收集上清液用HMGB1試劑盒進行檢測。

1.2.6 動物實驗

1.2.6.1 實驗動物 選取30只SPF級6～8周齡的C57BL/6小鼠,雄性,體重約20 g,購于川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。本實驗所有實驗方案均符合川北醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理學(xué)要求。

1.2.6.2 動物模型的構(gòu)建及實驗過程 制備B16F0細胞懸液(2×106/100 μL),每只小鼠注射100 μL的細胞懸液于小鼠右側(cè)肩部。待小鼠腫瘤體積增長到150 mm3時,將小鼠隨機分成5組,每組6只,開始進行治療。實驗分組分為Control組、Au組、Au+NIR組、Au@PDA組和Au@PDA+NIR組。整個治療過程,每個療程間隔1天,處理方式給藥見表1。每組光熱治療均使用同一激光發(fā)射器,光線聚于明顯的腫瘤病灶處,距離光源的高度約為3.0 cm ,治療時間持續(xù)為20 min;每隔2天測量一次腫瘤的體積,腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2;在細胞造模處理荷瘤鼠18天后,處死小鼠取腫瘤組織拍照并稱重,具體治療流程見圖1。稱重后,小鼠的腫瘤組織用4 % 福爾馬林固定,石蠟包埋切片后進行免疫組化染色,觀察腫瘤組織中的浸潤T淋巴細胞。摘取小鼠的主要臟器(心肝脾肺腎),4 % 福爾馬林固定,石蠟包埋切片后進行常規(guī)HE染色。

圖1 5組小鼠治療過程示意圖

表1 5組小鼠處理方式

2 結(jié)果

2.1 納米粒子的基本理化性能 本研究成功制備了多巴胺包裹的納米金粒子,多巴胺能夠均勻地包裹納米金粒子。Au和Au@PDA均呈球狀(2A、B);DLS測試Au的水合粒徑為(10±3)nm,Au@PDA的水合粒徑為(120±40)nm(圖2C)。Zeta電位結(jié)果顯示,多巴胺修飾后并沒有顯著改變納米金粒子表面電荷,Au和Au@PDA的Zeta電位均在-20 mV左右(圖2D)。

圖2 多巴胺包裹的納米金粒子的基本性能圖

2.2 Au和Au@PDA光熱性能分析 體外的光熱性能實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過10 min的照射,Au溫度升至(40.8±0.1)℃,而Au@PDA溫度則升至(49.3±0.1)℃,Au和Au@PDA均具有良好且穩(wěn)定的光熱性能,光照后溫度可以顯著升高,但Au@PDA表現(xiàn)出比Au更好的光熱性能,見圖3。這表明多巴胺對金粒子的光熱性能起到了很好的協(xié)同作用,納米粒子在3個升溫降溫的周期中均保持了良好的光熱性能。

圖3 納米粒子的光熱性能(n=3)

2.3 體外對黑色素瘤細胞生長的影響

2.3.1 納米粒子的生物相容性和對黑色素瘤生長的抑制作用 遷移實驗結(jié)果顯示,Au@PDA+NIR組細胞遷移率顯著低于其他各組(P<0.05);Au+NIR組在12 h和24 h的遷移率,均高于Au@PDA+NIR組,而低于Control組、Au組和Au@PDA組(P<0.05),見圖4。CCK-8結(jié)果顯示,Au和Au@PDA在不光照的條件下,細胞存活率均高于80%,表現(xiàn)出了良好的生物相容性;在光照后,各組的細胞存活率顯著下降。其中Au@PDA+NIR組細胞存活率最低,光照后24 h細胞存活率僅為(35.4±0.4)%,48 h的存活率為(39.5±0.5)%,各時間點的存活率均明顯低于其他組(P<0.05);Au+NIR組的細胞存活率則降低到60%左右,見圖5。細胞凋亡的結(jié)果顯示,Au@PDA+NIR組細胞凋亡率最高;Au+NIR組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均高于Control組、Au組和Au@PDA組(P<0.05),見圖6。以上結(jié)果表明,Au@PDA和Au均能夠抑制B16F0細胞凋亡,但Au@PDA抑制B16F0細胞遷移和增殖能力更強。

圖4 納米粒子對B16F0細胞遷移能力的影響

圖5 納米粒子對B16F0細胞增殖能力的影響

2.3.2 光照對黑色素瘤細胞免疫原性的影響 在本研究中,我們對光照后B16F0細胞分泌的HMGB1進行了檢測,結(jié)果顯示,光熱治療組分泌的HMGB1明顯增加,其中Au@PDA+NIR組分泌的HMGB1最高,其次為Au+NIR組,均顯著高于其他各組(P<0.05),見圖7。

圖7 治療后B16F0細胞分泌HMGB1的統(tǒng)計結(jié)果(n=3)

2.4 體內(nèi)的抗腫瘤實驗

2.4.1 腫瘤體積和重量變化 動物實驗的結(jié)果顯示,在整個治療期間,Au@PDA+NIR組小鼠的腫瘤生長較緩慢,光照治療對該組小鼠的腫瘤生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用;Au+NIR組小鼠的腫瘤在前兩次治療中對腫瘤有較顯著的抑制,在第14天后,腫瘤迅速生長,Au+NIR已經(jīng)無法抑制腫瘤生長。在第18天處死小鼠后,取各組腫瘤的瘤塊進行稱重。相對于其余各組,Au@PDA+NIR組的腫瘤的重量為(0.5±0.1) g,其余各組的腫瘤體重均大于2 g,見圖8。表明Au@PDA+NIR組對體內(nèi)腫瘤的生長起到了顯著的抑制作用,且多巴胺的包裹對金粒子的光熱作用起到了顯著的協(xié)同增強作用。

圖8 納米粒子在體內(nèi)對小鼠黑色素瘤的生長抑制情況

2.4.2 體內(nèi)各組織的組織學(xué)染色結(jié)果 光熱治療能顯著地引起腫瘤組織的壞死,光照組的壞死組織明顯增多,見圖9。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果表明,Au@PDA+NIR組腫瘤組織浸潤的CD4+T細胞和CD8+T細胞最多,視野中陽性細胞數(shù)分別為(18±1)個和(9±1)個;Au+NIR組腫瘤組織浸潤的CD4+、CD8+T細胞在視野中陽性細胞數(shù)分別為(9±1)個和(6±1)個,均高于非光照組(P<0.05),見圖10,這表明光照激活了機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。小鼠主要臟器的HE染色結(jié)果顯示實驗組小鼠的主要臟器無顯著的結(jié)構(gòu)變化和炎癥反應(yīng)(圖11),提示Au@PDA和Au具有良好的生物相容性。

圖9 腫瘤HE染色結(jié)果(100×,標尺=250 μm)

圖10 腫瘤組織的CD4和CD8細胞情況

圖11 小鼠主要器官的HE染色圖像(100×,標尺=500 μm)

3 討論

納米金粒子主要包括球形納米金粒子和金納米棒和金納米籠等非球形納米金粒子[5],在這些納米金粒子中,非球形的納米粒子光熱轉(zhuǎn)化效率較高,但其制備過程復(fù)雜,所需的試劑毒性較強[6-7]。而制備球形納米金粒子僅需要用到檸檬酸鈉緩沖液,且制備過程簡單,安全性大大的優(yōu)于其他形貌的納米金粒子。但球形納米金粒子的不足之處在于光熱轉(zhuǎn)換效率不及非球形納米金粒子高。為了彌補球形納米金粒子光熱轉(zhuǎn)換效率不高的問題,我們選取同樣有具有光熱轉(zhuǎn)換能力的多巴胺進行修飾。一方面,多巴胺提高了球形納米金粒子的光熱轉(zhuǎn)換效率;另一方面,多巴胺含有豐富的官能團,為進一步接枝其他功能基團,為賦予納米金粒子更多的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)[8-9]。本研究中,我們采用簡單而溫和的方法成功地制備了Au@PDA和Au,兩種粒子形貌呈均勻的球形,PDA對Au的包裹均勻,未顯著改變Au的Zeta電位。光熱曲線顯示Au@PDA相較于Au升溫速度快,溫度更高,說明多巴胺的包裹對納米金粒子的光熱效應(yīng)起到了顯著的協(xié)同作用。CCK-8實驗證實Au和Au@PDA粒子具有良好的生物相容性,符合GB/T14233·2-2005標準中大于80%的要求[10]。在體內(nèi)的抗腫瘤實驗中,各臟器的HE染色結(jié)果也表明納米金粒子對各臟器無顯著的影響。

PTT是利用光熱傳導(dǎo)劑的光熱效應(yīng)將光能轉(zhuǎn)化為熱能,從而提高病灶周圍環(huán)境的溫度,高溫使細胞膜發(fā)生損傷,導(dǎo)致直接的細胞壞死[11-12],從而影響了細胞的增殖和遷移。同時,熱療也可以通過增加調(diào)亡相關(guān)基因的表達(如P53基因等)從而誘導(dǎo)細胞調(diào)亡[13]。本研究中,我們在體外細胞實驗中證實了Au和Au@PDA粒子為光敏劑的光熱治療顯著的誘導(dǎo)了黑色素瘤細胞的凋亡,抑制了黑色素瘤細胞的增殖和遷移。

近年來,文獻報道光熱治療還可以誘導(dǎo)腫瘤的免疫原性死亡,從而激活機體的抗腫瘤免疫[14]。大量文獻證實,光熱治療后的腫瘤部位抗原遞呈細胞和浸潤T細胞比例顯著增加,血清中抗腫瘤的炎性因子也有所增加[15-16]。目前,研究者認為光熱治療主要是通過誘發(fā)腫瘤細胞的免疫原性死亡(Immunogenic cell death,ICD),從而激活機體的免疫。ICD是指細胞在發(fā)生凋亡的同時,從非免疫原性細胞轉(zhuǎn)化為免疫原性細胞,并由此激發(fā)機體內(nèi)抗腫瘤的免疫殺傷效應(yīng)[17]。其發(fā)生的機理是細胞在凋亡后,釋放出損傷相關(guān)分子模式標志物,如鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin,CRT)、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、HMGB1和熱休克蛋白70(Heat Shock Proteins 70,HSP70)等,向免疫系統(tǒng)發(fā)出“eat me”的信號,誘導(dǎo)抗原遞呈細胞來吞噬這些死亡的腫瘤細胞,進而將這些信號遞呈給T細胞,激活T細胞,激發(fā)機體的免疫[18]。高遷移率蛋白B1(High mobility group protein B-1,HMGB1)是腫瘤免疫原性死亡的一種標志性蛋白[19]。在本研究中,我們檢測了光照后B16F0細胞HMGB1分泌情況。結(jié)果顯示,光照組的黑色素瘤細胞分泌的HMGB1顯著升高。這表明,Au@PDA和Au經(jīng)過光熱治療讓黑色素瘤細胞發(fā)生了免疫性死亡,進而激活了機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。動物實驗結(jié)果證實,光照組的腫瘤組織中的浸潤CD8+、CD4+T淋巴細胞的數(shù)量顯著增多。CD8+T淋巴細胞是具有細胞毒性的免疫細胞,其所介導(dǎo)的細胞毒T淋巴細胞反應(yīng)(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)是經(jīng)典的抑制腫瘤生長的免疫反應(yīng)[20-21]。CTL即可以分泌IFN-γ抑制腫瘤生長;又可以在識別腫瘤抗原后,通過分泌穿孔素、顆粒酶發(fā)揮直接殺傷腫瘤細胞的作用[22]。CD4+T淋巴細胞中TH1型細胞被證實具有抗腫瘤作用[23-24]。TH1型CD4+T細胞可以通過表達CD40L等膜分子和分泌IFN-γ等細胞因子活化巨噬細胞,也可產(chǎn)生IL-2等細胞因子促進TH1、CTL和NK等細胞的活化,增強抗腫瘤免疫反應(yīng)[25]。就本次實驗的結(jié)果來看,腫瘤的生長受到了顯著性的抑制。因此,我們更趨向認為腫瘤組織中的浸潤CD4+T細胞屬于TH1型CD4+T細胞。腫瘤組織中浸潤CD4+T細胞和CD8+T細胞數(shù)量的增加,這表明機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)被顯著的激活。

4 結(jié)論

本研究中我們成功地利用多巴胺包裹納米金粒子作為光敏劑,將其應(yīng)用到黑色素瘤的光熱治療中。實驗結(jié)果表明,Au@PDA不僅可以通過直接的熱能誘導(dǎo)B16F0的凋亡,抑制其增殖、遷移,生長;同時,光熱治療還可以通過誘導(dǎo)B16F0發(fā)生ICD反應(yīng),從而激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Au@PDA粒子在黑色素瘤治療中的具有良好的應(yīng)用前景,為黑色素瘤的治療提供了一種新的治療途徑。同時,黑色素瘤作為腫瘤免疫治療的一種模型腫瘤,也為光熱治療在其他實體瘤中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。