程鈴 陳蓉 李朝今 曾力楠

(1.三六三醫(yī)院藥劑科,四川 成都 610000;2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院藥劑科,四川 成都 610041)

膠質(zhì)瘤是一種起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顱內(nèi)腫瘤,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,其治療方式主要有手術(shù)切除,并加以結(jié)合放療或化療,但治療效果欠佳,易出現(xiàn)復(fù)發(fā)等情況[1]。因此,尋找治療膠質(zhì)瘤的藥物具有重要意義。山茶花具有調(diào)胃、理氣、散於等功效[2]。有研究顯示,山茶花揮發(fā)油對宮頸癌細(xì)胞Hela、肝癌細(xì)胞HepG2的增殖有抑制作用,且呈劑量和時間依賴性[3]。然而,關(guān)于山茶花提取物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響與機制尚不清楚。據(jù)報道,在膠質(zhì)瘤中miR-526b-3p表達(dá)降低,其表達(dá)與分級、KPS評分及較差的預(yù)后有關(guān),過表達(dá)miR-526b-3p能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinaseB,AKT)信號通路是經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,PI3K、AKT磷酸化后能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)過程[5]。研究顯示,青藤堿酯衍生物可通過抑制PI3K/AKT信號通抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[6]。本研究以膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088為研究對象,探究山茶花提取物是否能夠通過調(diào)控miR-526b-3p/PI3K/AKT信號通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 山茶花購于浙江省大洋山,75%乙醇購于北京伊塔生物科技有限公司,山茶花提取物使用乙醇提取法進(jìn)行提取。膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基來源于美國的Hyclone公司,Lipofectamine 2000試劑盒來源于美國Invitrogen公司,模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-526b-3p模擬物(miR-526b-3p)、抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-526b-3p抑制物(anti-miR-526b-3p)、引物購于廣州銳博生物科技有限公司,MTT試劑盒、Transwell、BCA試劑盒、ECL試劑購于北京索萊寶公司,基質(zhì)膠Matrigel購于美國BD公司,細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP9)抗體、磷酸化的PI3K(p-PI3K)抗體、磷酸化的AKT(p-AKT)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于英國Abcam公司,羊抗兔IgG二抗、Trizol試劑盒、TaqMan MicroRNA試劑盒、熒光定量試劑盒購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 細(xì)胞分組 膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),在5% CO2環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),對應(yīng)溫度為37 ℃。收集對數(shù)期SW1088細(xì)胞接種6孔板中,將山茶花提取物濃度為30、60、120 mg/L處理細(xì)胞,分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組,以正常培養(yǎng)SW1088細(xì)胞作為對照組;按照脂質(zhì)體法將miR-NC、miR-526b-3p轉(zhuǎn)染SW1088細(xì)胞中,分別記為miR-NC組、miR-526b-3p組;將anti-miR-NC、anti-miR-526b-3p轉(zhuǎn)染至SW1088細(xì)胞中,加入高劑量山茶花提取物,分別記為anti-miR-NC+高劑量組、anti-miR-526b-3p+高劑量組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染以Lipofectamine 2000試劑盒作為參照,細(xì)胞培養(yǎng)48 h進(jìn)行實驗。

1.3 qRT-PCR檢測miR-526b-3p相對表達(dá)量 利用Trizol試劑分離各組SW1088細(xì)胞中總RNA,RNA濃度、純度檢測后,借助TaqMan MicroRNA試劑盒,將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,用熒光定量試劑盒進(jìn)行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μL的2×TransStart?Green qPCR SuperMix,正、反引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,RNase-Free H2O補充至20 μL。以U6做內(nèi)參基因,使用2-△△CT計算miR-526b-3p相對表達(dá)量。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖活性 將SW1088細(xì)胞收集起來,接種在96孔板中,并依據(jù)1.2法處理后培養(yǎng)48 h時,加入5 mg/mL(20 μL)的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔內(nèi)加150 μL的二甲基亞砜溶液,結(jié)晶完全溶解后,借助酶標(biāo)儀于490 nm處,對細(xì)胞吸光度值(A)進(jìn)行檢測。

1.5 細(xì)胞遷移及侵襲檢測遷移和侵襲能力 遷移實驗:以Transwell進(jìn)行檢測,將各組SW1088細(xì)胞實驗中未含血清的完全培養(yǎng)基收集起來,其細(xì)胞密度對應(yīng)3×105個/mL,分別在Transwell上室、下室加細(xì)胞懸液、含血清的完全培養(yǎng)基,劑量分別對應(yīng)100、500 μL,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室,將未遷移的細(xì)胞輕輕擦掉,多聚甲醛固定細(xì)胞、結(jié)晶紫染色,時間分別為30、20 min,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移數(shù)量。侵襲實驗:按比例將基質(zhì)膠Matrigel、培養(yǎng)基稀釋,再取50 μL鋪于Transwell上室,凝固5 h之后,后續(xù)的實驗步驟同遷移實驗一致。

1.6 Western blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平 收集各組SW1088細(xì)胞在PBS內(nèi)洗2次,加蛋白裂解試劑進(jìn)行裂解細(xì)胞,BCA試劑盒進(jìn)行檢測定量,以10% SDS-PAGE將蛋白樣品分離,半干法轉(zhuǎn)膜,室溫下以脫脂奶粉封閉培養(yǎng),時間為2 h,分別加CyclinD1(1:600)、MMP2(1:600)、MMP9(1:600)、p-PI3K(1:800)、p-AKT抗體(1:800),4 ℃條件下,過夜孵育,第二日室溫下孵育帶有標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1:3000),時間為2 h,使用ECL試劑顯色,曝光。使用Image-J軟件分析蛋白條帶密度值,以GAPDH做內(nèi)參基因。其中p-PI3K、p-AKT抗體只檢測對照組、高劑量組、anti-miR-NC+高劑量組、anti-miR-526b-3p+高劑量組。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度山茶花提取物提高miR-526b-3p表達(dá) 與對照組相比,低劑量組、中劑量組、高劑量組SW1088細(xì)胞中miR-526b-3p相對表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度山茶花提取對miR-526b-3p表達(dá)的影響

2.2 不同濃度山茶花提取物抑制SW1088細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與對照組相比,低劑量組、中劑量組、高劑量組SW1088細(xì)胞中A值降低,細(xì)胞遷移數(shù)量及侵襲數(shù)量減少(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度山茶花提取物對SW1088細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 不同濃度山茶花提取物抑制SW1088細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá) 與對照組相比,低劑量組、中劑量組、高劑量組SW1088細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 不同濃度山茶花提取物對CyclinD1, MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

表3 不同濃度山茶花提取物對CyclinD1, MMP2 and MMP9蛋白表達(dá)水平

2.4 miR-526b-3p抑制SW1088細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 miR-526b-3p組SW1088細(xì)胞中miR-526b-3p相對表達(dá)量高于miR-NC組,細(xì)胞A值、細(xì)胞遷移數(shù)量、細(xì)胞侵襲數(shù)量,以及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平均低于miR-NC組(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 miR-526b-3p對SW1088細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及對CyclinD1, MMP2 and MMP9蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 anti-miR-526b-3p可以減弱山茶花提取物對SW1088細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 anti-miR-526b-3p+高劑量組SW1088細(xì)胞中miR-526b-3p相對表達(dá)量低于anti-miR-對照組+高劑量組,細(xì)胞A值、細(xì)胞遷移數(shù)量、細(xì)胞侵襲數(shù)量,以及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平均高于anti-miR-對照組+高劑量組(P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 CyclinD1,MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

表5 anti-miR-526b-3p對SW1088細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及對CyclinD1, MMP2 和 MMP9蛋白表達(dá)水平的影響

2.6 PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)情況 高劑量組、anti-miR-NC+高劑量組SW1088細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平較對照組降低(P<0.05);anti-miR-526b-3p+高劑量組SW1088細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平較anti-miR-NC+高劑量組升高(P<0.05)。見圖4、表6。

圖4 PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)情況

表6 PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)情況

3 討論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的惡性腫瘤,與基因突變、遺傳因素及環(huán)境因素有關(guān),其發(fā)病率相對較低,但病死率、復(fù)發(fā)率高,治療效果仍不理想[7]。雖然目前膠質(zhì)瘤治療模式多樣,但是患者預(yù)后生存期限并未顯著提高[8]。近年的研究顯示,天然藥物在治療腫瘤上顯現(xiàn)出獨特優(yōu)勢[9],如毛蕊花糖苷呈劑量效應(yīng)關(guān)系抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲,及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。另有研究發(fā)現(xiàn),蘆薈大黃素能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,阻滯周期在S期[11]。白頭翁皂苷D具備抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞有遷移、侵襲的作用,且能有效加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程[12]。山茶花有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等藥理活性[13-14]。本研究結(jié)果顯示,不同濃度山茶花提取物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲發(fā)揮良好的抑制作用。CyclinD1蛋白是特異性的周期蛋白,與細(xì)胞生長分化有關(guān),將細(xì)胞周期從G1期加速轉(zhuǎn)向S期,繼而使細(xì)胞增殖進(jìn)程加快[15]。MMP2、MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶,其作用包括參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解過程,并加快腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲進(jìn)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn),山茶花提取物能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平,且劑量依賴性,說明山茶花提取抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,可能與降低CyclinD1、MMP2、MMP9有關(guān)。

研究顯示,在肝癌細(xì)胞中miR-526b-3p表達(dá)降低,其過表達(dá)能靶向抑制TNKS2進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]。據(jù)報道,miR-526b-3p在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低,上調(diào)miR-526b-3p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管形成[18]。還有研究發(fā)現(xiàn),miR-526b-3p可通過下調(diào)IGF2BP1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,山茶花呈劑量依賴性增加miR-526b-3p表達(dá)量,提示山茶花提取物可能調(diào)控miR-526b-3p表達(dá)。將過表達(dá)miR-526b-3p轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,miR-526b-3p表達(dá)上調(diào),膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均被抑制。另外,在高劑量山茶花提取物干預(yù)的基礎(chǔ)上,下調(diào)miR-526b-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)高劑量山茶花提取物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,提示山茶花提取可能調(diào)控miR-526b-3p表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)展。PI3K/AKT信號通路能調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程,如增殖、遷移、侵襲等,進(jìn)而參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展[20]。文獻(xiàn)報道,PI3K/AKT信號通路激活受到抑制,也會對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲產(chǎn)生抑制作用[21]。在本研究中,高劑量山茶花提取物降低p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá),將anti-miR-526b-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加高劑量山茶花提取后,p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)上調(diào),說明PI3K/AKT信號通路與山茶花提取調(diào)控miR-526b-3p影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)展的有關(guān)。

4 結(jié)論

山茶花提取物可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,作用機制可能與miR-526b-3p/PI3K/AKT信號通路有關(guān)。關(guān)于山茶花提取物與PI3K/AKT信號通路對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具體研究作用需要后一步實驗研究。