王涵芝 駱詩靈 瞿思穎 柯歡笑 蕭凡清 李心悅 王琳 趙宏利*

宮腔粘連（IUA）是由于子宮內(nèi)膜基底層受損導致纖維組織形成，間質(zhì)組織消失，組織間橋跨越子宮壁的各個方向，形成粘連［1-2］。IUA 患者常出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、子宮內(nèi)膜薄、反復流產(chǎn)，甚至可發(fā)生不孕［3-4］。IUA 的發(fā)病率1.7%～45.5%［5］，嚴重影響女性的生理心理健康。研究認為腎虛血瘀是IUA 主要的病機，治法為補腎活血［6］。趙宏利主任醫(yī)師提出IUA“通補奇經(jīng)法”的治療，創(chuàng)立中藥復方“厚胞湯”。臨床上常用網(wǎng)絡(luò)藥理學來進行相關(guān)機制探討［7-9］，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接，對厚胞湯進行靶標預測、功能富集，篩選出與IUA 相關(guān)的活性成分、闡釋其作用機制。

1 材料與方法

1.1 厚胞湯成分靶點信息 使用Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫［10］（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）檢索出所有中藥化合物和靶點，從而了解其功能和作用機制，選取得分＞20 分納入。經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫［11］校正，去掉非人類靶點。

1.2 IUA 靶點 在GeneCards［12］（https：//www.genecards.org/）、NCBI［13］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 以及DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）三個數(shù)據(jù)庫以“Intrauterine adhesion”為關(guān)鍵詞進行人類基因檢索［14］。其中，GeneCards 數(shù)據(jù)庫通過對得分的中位值篩選，選出更加相關(guān)的靶點。

1.3 韋恩圖 通過venny2.1 軟件，將檢測出的藥物靶點和病變靶點加以結(jié)合，以獲得共有靶點，并利用這些靶點來預測厚胞湯對IUA 的影響，從而實現(xiàn)作用通路的分析。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過將疾病及藥物的409 個共有靶點輸入到數(shù)據(jù)庫String［15］中，并且將“生物種類”選擇為“Homo sapiens”，達到0.9 以上的可信度，就可以構(gòu)造出一個PPI 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

1.5 拓撲分析 將PPI 網(wǎng)絡(luò)插入到Cystoscape 3.8.0［16］中，應(yīng)用NetworkAnalyzer 開展相關(guān)的拓撲分析，并且結(jié)合基因的degree 排序，從而確定出得分高于平均水平的基因成為重要靶點，構(gòu)建相關(guān)圖。

1.6 GO 富集分析 通過對藥物疾病共同靶點進行的GO 生物過程、分子功能和細胞組分的富集分析。且利用String 數(shù)據(jù)庫，對校正P＜0.05 的相關(guān)項目進行篩選。采用R 4.0.3 軟件，設(shè)計并引入clusterProfiler、enrichplot和ggplot2 包，創(chuàng)建柱狀圖，從而實現(xiàn)圖像的精確呈現(xiàn)。

1.7 KEGG 通路富集 通過KEGG 通路的富集分析方法，把藥和疾病的共同靶點進行測定，并應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫，篩選校正P＜0.05 的項目。采用R 4.0.3 軟件配置的clusterProfiler 包，并描繪柱狀圖來進行深入研究。

1.8 成分、疾病、通路、靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過將Cytoscape3.8.0 中的成分、疾病、通路和靶點網(wǎng)絡(luò)文件輸入，可以更加直接揭示中醫(yī)藥活性成分在治療疾病流程中的多種作用機制，從而更好地了解其作用特征。

1.9 分子對接 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中的AKT1（PDB ID：4GV1），TP53（PDB ID：1JSP），CREBBP（PDB ID：7XI0），SRC（PDB ID：4U5J），JUN（PDB ID：5AEP）靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)，用Pymol 2.1 軟件，將蛋白分子加載到AutoDock Tools-1.5.6 軟件中，對蛋白添加Gasteiger 電荷，并添加氫原子，并將原子設(shè)置為AD4 類型，保存為pdbqt 文件。化合物結(jié)構(gòu)（Linoleic-Acid，Lysine，Melanin，Sebiferic-acid，Trigonelline）均來自PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通過Chem3D 將化合物轉(zhuǎn)換為mol2 格式，并導入AutoDock Tools-1.5.6 軟件，設(shè)置好旋轉(zhuǎn)鍵，保存為pdbqt 文件。受體為五個蛋白靶點，五個化合物作為小分子配體，Grid Box 設(shè)置為40 ?x40 ?x40 ?，對接中心分別設(shè)為（AKT1：x=-26.449，y=2.715，z=16.133；TP53：x=2.407，y=11.751，z=40.92；CREBBP：x=4.231，y=-0.035，z=-18.851；JUN：x=32.391，y=13.273，z=-4.235；SRC：x=1.902，y=-37.006，z=10.763），Grid Spacing 設(shè)為0.375，AutoDock vina 進行批量分子對接，最后對結(jié)果進行評估。使用Pymol2.1 可視化物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合關(guān)系，2D 蛋白與小分子相互作用圖采用Discovery Studio 2019.01 軟件中的protein-ligand interction 模塊。對接算法采用Lamarckian 遺傳算法（最大值2,500 萬次能量評估，最高次數(shù)為2,000，交叉率0.8，突變率0.02，獨立對接運行100 次）的基礎(chǔ)研究，并通過結(jié)合自由能分析最終的對接分子。然后再根據(jù)化合物的對接分數(shù)，來確定所篩選的化合物中是否存在活性成分。

2 結(jié)果

2.1 厚胞湯成分靶點信息篩選 經(jīng)匯總刪重后，化合物成分個數(shù)分別是阿膠3 個；柏子仁8 個；補骨脂14個；川牛膝3 個；當歸83 個；枸杞子46 個；龜板6個；卷柏4 個；鹿角2 個；桑葚14 個；熟地黃4 個；菟絲子1 個；王不留行3 個；澤蘭4 個。去除重復及無效值后共得到1,868 個靶點。

2.2 IUA 靶點與韋恩圖的構(gòu)建 GeneCards 檢索到1,363 個靶點；NCBI 115 個靶點；DisGeNET 24 個靶點。把數(shù)據(jù)庫合并去重后，共得到1,842 個IUA 相關(guān)基因。通過將厚胞湯靶點與IUA 靶點輸入Venny 2.1 中，獲得409 個兩者共有的靶點（見圖1）。

圖1 厚胞湯-IUA交集靶點韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓撲分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)由409 個節(jié)點和1,466 條邊組成，其平均度值為7.17。（見圖2-3）。經(jīng)過把PPI 引入Cystoscape 3.8.0 中，采用NetworkAnalyzer相關(guān)的工具展開拓撲分析，從而甄選出106 個關(guān)鍵的靶點，并且將排序前二十個靶點用R 4.0.3 進行繪制（見圖4）。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖A

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖B

圖4 拓撲分析圖（橫坐標為每個靶點度值）

2.4 GO 富集分析 通過引入string 數(shù)據(jù)庫，將藥物疾病的共有靶點完成GO 富集，包括生物過程、分子功能、細胞組分，并且篩選出校正P＜0.05 的項目，共富集到3,785 條生物過程，128 項分子功能相關(guān)，241 項細胞組成相關(guān)。經(jīng)分析，厚胞湯改善IUA 的細胞成分為囊泡腔、膜筏、膜微域、膜區(qū)、分泌顆粒腔、細胞頂端部分、頂端質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、血小板α 顆粒、細胞質(zhì)囊泡腔等；生物過程包含對藥物、上皮細胞增殖、脂多糖、氧水平、細菌來源分子、上皮細胞增殖的調(diào)節(jié)、氧水平降低、活性氧代謝過程、營養(yǎng)水平、腺體發(fā)育等的反應(yīng)；分子功能包括調(diào)節(jié)受體配體、信號受體激活、細胞因子、生長因子等活性，并與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素樣蛋白連接酶、細胞因子受體、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合（見圖5）。

圖5 GO富集分析圖

2.5 KEGG 通路富集 通過KEGG 通路富集分析共有靶點，過濾后，富集到總共184 條信號通路。主要包括PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號通路等（見圖6）。

圖6 KEGG通路富集圖

2.6 成分—疾病—通路—靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用Cytoscape3.8.0 導入成分、疾病、通路和靶點，繪制出一張完整的通路網(wǎng)絡(luò)圖，展示出厚胞湯的活性成分在治療IUA 過程中的特性（見圖7）。

圖7 成分—疾病—通路—靶點網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對接 在分子對接中，結(jié)合能越低，親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 表示兩個分子間有明顯的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，多數(shù)化合物與靶點蛋白匹配度良好且存在較好的結(jié)合作用，綜合表現(xiàn)最好的是Melanin 化合物。Melanin 除與TP53外，剩余對接均＜ -7.0，其中Melanin-JUN 結(jié)合能最小，為-10.8 kcal/mol，提示化合物與靶點間具有較強的親和力。將對接后化合物與蛋白形成的復合物應(yīng)用Pymol2.1 軟件進行可視化，得到化合物與蛋白的結(jié)合模式，根據(jù)結(jié)合模式可以觀察到化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基（見圖8）。Melanin 與JUN 蛋白活性口袋的VAL-863、MET-929、VAL-911、ALA-880、LEU-983 氨基酸形成較強的疏水相互作用，與GLY-993、LEU-855、LEU-932 氨基酸形成氫鍵相互作用，對穩(wěn)定小分子有著重要貢獻。

圖8 JUN-Melanin分子對接

3 討論

IUA 的發(fā)病率逐年遞增，損害患者的生殖健康。此外，該病呈現(xiàn)高復發(fā)率的特點，臨床上宮腔鏡下粘連分離術(shù)可恢復宮腔體積和形狀，但再粘連的復發(fā)率達3%～24%［17］。因此，放置宮內(nèi)節(jié)育器、導尿管球囊、透明質(zhì)酸凝膠等宮腔鏡術(shù)后輔助治療應(yīng)運而生，但仍有14%～48%婦女在治療后粘連復發(fā)［18-19］。因此，探索宮腔鏡下IUA 分離術(shù)后有效的輔助治療方法有助于女性健康。

厚胞湯是趙宏利主任醫(yī)師在中醫(yī)理論指導下，結(jié)合多年臨床實踐自擬的中藥復方［20］。該湯由當歸、川牛膝、王不留行、龜板、鹿角片、阿膠珠等藥材組成，方中龜板填任脈以為靜攝，鹿角走督脈以為溫煦，當歸入沖脈以為宣補，共同補養(yǎng)奇經(jīng)，補中有動；當歸補血和血，其氣最雄，川牛膝活血下行，其勢甚健，疏通奇經(jīng)瘀滯，通中有補［21］。IUA 病因多由手術(shù)損傷引起，即屬于中醫(yī)“不內(nèi)外因”之“金刃”直接損傷胞宮沖任，病機為“金刃傷胞，奇經(jīng)受損，瘀血內(nèi)阻”，治以補助通，以通為補，通補結(jié)合，共奏通補奇經(jīng)。經(jīng)過本課題組的前期研究，發(fā)現(xiàn)厚胞湯能夠顯著提升子宮內(nèi)膜厚度和容積，同時還能夠改善子宮動脈血液供應(yīng)情況、提升黃體中期內(nèi)膜整合素αvβ3 同時下調(diào)增生期子宮內(nèi)膜相關(guān)因子的表達，臨床上常用該方提高子宮內(nèi)膜容受性從而有效防治IUA 松解術(shù)后的再粘連并改善相關(guān)癥狀［22-23］。為進一步探究厚胞湯的作用機制，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學，剖析厚胞湯防治IUA 的關(guān)鍵作用靶點與可能作用機制。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學預測厚胞湯治療IUA 的潛在機制。挖掘Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫獲得藥物作用靶點1,868 個，挖掘3 個數(shù)據(jù)庫獲得IUA 靶點1,842 個，獲得交集靶點409 個。應(yīng)用String 構(gòu)建PPI，對Cystoscape行拓撲篩出106 個關(guān)鍵靶點，占總靶點數(shù)的25.9%，前20 個關(guān)鍵靶點為CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、PIK3R1、CTNNB1、HSP90AA1、MAPK14、RXRA、EGFR、ESR1、GRB2、MYC、NR3C1、TNF、SMAD3、CREB1、FOS、NCOA2。經(jīng)過String 數(shù)據(jù)庫的GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)厚胞湯可通過DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素樣蛋白連接酶、RNA 聚合酶II、細胞因子受體、激素受體等，并調(diào)節(jié)受體配體、信號受體激活、細胞因子、生長因子等活性改善IUA 相關(guān)癥狀，及其主要通路可能與PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號通路等相關(guān)。

TGF-β1 被認為是纖維化的中心介質(zhì)，IUA 患者和動物模型中子宮內(nèi)膜纖維化面積增加，同時作為纖維化標志物的TGF - β1 表達異常上調(diào)［24］，中藥可通過TGF- β1 / Smad 通路減輕IUA 大鼠子宮內(nèi)膜纖維化［25］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K / AKT）信號通路被報道可被TGF - β1 激活調(diào)節(jié)成纖維細胞反應(yīng)，且有研究表明KLB 蛋白可通過激活PI3K/Akt 通路增強基質(zhì)細胞增殖和細胞纖維化，從而促進IUA 的發(fā)生發(fā)展［26］，F(xiàn)ENG 等也證明補腎活血湯可激活PI3K/Akt 通路［27］。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)與幾種氧化劑在衰老過程中發(fā)生非酶促反應(yīng)的結(jié)果，RAGE 與肺纖維化過程和肺泡穩(wěn)態(tài)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者的AGE-RAGE 比值增加［28］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種炎性細胞因子，持續(xù)的炎癥會導致纖維化［29］。

Melanin 可參與抗炎、清除自由基、增強免疫功能等生理、病理活動［30］。研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨汁黑色素能通過改善腎組織的氧化應(yīng)激，減輕腎基質(zhì)間的纖維化通過介導PPAR-γ/TGF-β 代謝通路［31］。分子對接結(jié)果提示Melanin-JUN 對接良好，推測Melanin 在厚胞湯治療IUA 發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的研究表明厚胞湯中CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、TNF、SMAD3 等可能是治療IUA 的潛在生物標志物，厚胞湯通過PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 等信號通路調(diào)節(jié)纖維化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，本研究對厚胞湯治療IUA 進行了初步的理論探討。未來通過在細胞和動物模型中的實驗驗證來進一步補充厚胞湯對IUA 的作用機制研究。