許勇泉，汪潔瓊，曹青青，汪 芳，陳震華，李曉麗，陳建新，馮智慧，尹軍峰

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；3. 廣州茶里集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 510000；4. 浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058

茶[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]是一種被廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)已成為全球消費(fèi)量最大的非酒精飲料之一[1]。綠茶屬于不發(fā)酵茶，依據(jù)殺青和干燥方式的差異可將其分為烘青綠茶、炒青綠茶、蒸青綠茶以及曬青綠茶等四類。其中，炒青綠茶采用炒干的方式制成。優(yōu)質(zhì)炒青綠茶往往呈現(xiàn)滋味鮮醇、回甘明顯、香氣高爽、持久度高的品質(zhì)特點(diǎn)。

針對(duì)炒青綠茶風(fēng)味品質(zhì)表征，前人有相關(guān)報(bào)道。如張翔等[2]研究構(gòu)建了蒙頂甘露茶滋味呈味分析圖，利用滋味活度值（Taste activity values，TAV）對(duì)基礎(chǔ)滋味物質(zhì)的呈味貢獻(xiàn)率進(jìn)行了探討。黎娜等[3]采用變溫滾炒與高溫足干提香結(jié)合方式對(duì)秋炒青綠茶的基礎(chǔ)理化和香氣成分進(jìn)行了表征。張銘銘等[4]基于頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（HS-SPME/GC×GC-TOFMS）表征了不同栗香特征炒青綠茶中的關(guān)鍵香氣組分。舒暢等[5]基于氣相色譜質(zhì)譜-嗅覺測(cè)量方法（GC-MS/GC-O）對(duì)新、陳龍井茶中關(guān)鍵差異香氣成分進(jìn)行了鑒定。王夢(mèng)琪等[6]采取頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME/GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，分析了龍井茶香氣成分產(chǎn)區(qū)差異。然而不同炒青綠茶之間風(fēng)味輪廓形成差異較大，導(dǎo)致其風(fēng)味差異形成的關(guān)鍵貢獻(xiàn)物質(zhì)尚不明確，甚至關(guān)于炒青綠茶非揮發(fā)性組分表征更是少之又少。因此，采用較新的技術(shù)手段表征不同炒青綠茶風(fēng)味品質(zhì)差異具有一定理論價(jià)值和產(chǎn)業(yè)意義。

目前提取香氣常用手段主要包括頂空固相微萃取（HS-SPME）[7]、攪拌棒吸附萃取（SBSE）[8]、同時(shí)蒸餾萃取法（SDE）[9]、減壓蒸餾萃?。╒DE）[10]、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)（SAFE）[11]、固相萃取（SPE）[12]及動(dòng)態(tài)頂空萃?。―HS）[13]。其中SPE 技術(shù)使用的吸附劑親脂性相同，如C18 鍵合二氧化硅或聚合物，選擇性高，使用方便，是一種較為理想的香氣萃取方式[14]。近幾年，非靶向代謝組學(xué)技術(shù)正成為一門新興研究分析手段，其主要側(cè)重于測(cè)量相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000 Da 的內(nèi)源性小分子化合物，近幾年在茶葉加工和深加工領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1,15,16]。

本試驗(yàn)基于液相色譜-四級(jí)桿-軌道高分辨質(zhì)譜儀（UHPLC-Q Exactive-MS）、GC-MS 和非靶向代謝組學(xué)分析技術(shù)分別對(duì)碧螺春、龍井、蒙頂甘露和毛尖等四種炒青綠茶的色澤、滋味和香氣品質(zhì)等進(jìn)行表征，旨在找出不同炒青綠茶風(fēng)味品質(zhì)形成的差異，以期為綠茶加工技術(shù)的提升及風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控提供一定科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

碧螺春（BLC）、龍井（LJ）、蒙頂甘露（MDGL）和信陽(yáng)毛尖（簡(jiǎn)稱毛尖茶，MJ）均為2023 年明前茶，采摘標(biāo)準(zhǔn)為單芽到一芽一葉；4 種茶葉均購(gòu)自京東茶葉旗艦店。

1.1.2 儀器設(shè)備

CM-36dG 色差計(jì)，柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；8890 GC-5977 GC/MSD 氣質(zhì)聯(lián)用儀，DB-5MS（30 m × 250 μm × 0.25 μm）色譜柱，DB-WAX（30 m × 250 μm × 0.25 μm）色譜柱，美 國(guó)J&W Scientific 公 司；UHPLC-Q Exactive-MS， 美 國(guó)Thermo Scientific 公 司；ACQUITY UPLC HSS T3 色 譜 柱（1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm）美國(guó)Waters公司；SPE小柱（LC-Si, 6 mL管，500 mg 填料），美國(guó)Supelco 公司；TurboVap氮?dú)鉂饪s儀，拜泰齊（Biotage）貿(mào)易（上海）有限公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.1.3 主要試劑

沒食子酸（GA）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、蘋果酸、L-谷氨酸，Sigma-Aldrich 公司；茶氨酸、檸檬酸、無(wú)水硫酸鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；綠原酸，上海源葉生物科技有限公司；奎寧酸，SUPELCO 公司；山奈酚，上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁，百靈威科技有限公司；癸酸乙酯，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲酸、乙腈、正構(gòu)烷烴（C8-C40）、甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）、戊烷，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用純水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 樣品制備

（1）用于非揮發(fā)性組分分析：分別準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.001 g）不同的炒青綠茶至50 mL 離心管中，添加25 mL 75%甲醇/水溶液，搖晃均勻保證茶葉浸沒溶液，于70℃水浴鍋水浴30 min 取出，中間每10 min 搖晃一次。迅速取出冰水浴冷卻至室溫，離心（8 000 r/min，10 min，4℃）；取上清液置于1.5 mL 離心管，二次離心（14 000 r/min，10 min，4℃）；吸取上清液于液相小瓶中，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

（2）用于揮發(fā)性組分分析：分別準(zhǔn)確稱取6 g（精確至0.001 g）不同的炒青綠茶至500 mL三角瓶中，倒入300 mL 沸水，蓋上塞子，沖泡4 min，迅速用300 目紗布過(guò)濾，隨后使用20 mL 沸水潤(rùn)洗瓶子以收集殘留茶湯，冰水浴迅速冷卻至室溫，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 感官品質(zhì)審評(píng)

4 種炒青綠茶的感官評(píng)估由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所5 名專業(yè)人員完成，包括3 名男性和2 名女性。整個(gè)評(píng)估遵循茶葉感官審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 23776—2018）制定的準(zhǔn)則。評(píng)估指標(biāo)包括與茶湯色澤、滋味、香氣相關(guān)的術(shù)語(yǔ)和評(píng)分。采取百分制評(píng)分準(zhǔn)則。

1.4 色差測(cè)定

經(jīng)1.2 獲得的茶湯采用色差儀分別測(cè)定色差，L值，表示亮度；a值表示紅綠度，其中正值表示紅色，負(fù)值表示綠色；b值表示黃藍(lán)色，其中正值表示黃色，負(fù)值表示藍(lán)色。檢測(cè)光源為D65，觀察者角度為10°。

1.5 非揮發(fā)性組分測(cè)定

1.5.1 組分測(cè)定

基于Wang 等[15]建立的方法。色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱；柱溫為40℃，進(jìn)樣器溫度為10℃。流動(dòng)相A 相為0.1%甲酸/水，B 相為純乙腈；進(jìn)樣量為4 μL，流速為0.3 mL/min。流動(dòng)相洗脫梯度為：0 ～ 1 min 時(shí)B 相比例為5%，2 min 時(shí)比例線性增加至10%，6 min 線性增加至35%，8.5 ～ 9.5 min時(shí)為100%，10.0 ～ 12.0 min 時(shí)回落至5%。質(zhì)譜條件：負(fù)離子掃描，質(zhì)譜電壓3.1 kV；電噴霧電離，MS 和ddMS2 分別為70 000 和35 000。毛細(xì)管和輔助燃?xì)饧訜崞鞯臏囟确謩e設(shè)定為320℃和300℃，護(hù)套和輔助氣體流速分別設(shè)定為45 和10；質(zhì)譜掃描范圍為66.7 ～ 1 000 Da。

1.5.2 質(zhì)量控制樣品（QC）

實(shí)驗(yàn)QC 樣本由不同樣品提取物均等混合而成，主要用于判斷跑樣過(guò)程中儀器和樣品的穩(wěn)定性。

1.5.3 物質(zhì)鑒定

使 用Compound Discoverer? 2.0 結(jié) 合mzCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mzcloud.org）以及 ChemSpider 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.chemspider.com/）對(duì)不同炒青茶樣本中檢測(cè)的質(zhì)譜峰進(jìn)行初步校正（包括解卷積、峰提取、峰對(duì)齊等）和鑒定，結(jié)合非靶向代謝組學(xué)分析篩選出關(guān)鍵差異代謝物，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]和已有標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.6 揮發(fā)性組分測(cè)定

1.6.1 揮發(fā)性組分的提取

基于Feng 等[19]的方法，部分修改。在1.2.1中的茶湯中添加10 μL 的癸酸乙酯（1 mg/mL），混勻，使用60 mL 溶劑體系戊烷和MTBE 以4 ∶1的比例分次萃取3 次。將3 次萃取后的有機(jī)層合并，采用無(wú)水硫酸鈉干燥。干燥后的溶液通過(guò)氮吹儀濃縮至1 mL。將上述茶樣香氣提取物慢慢滴加至活化[加入6 mL 戊烷和MTBE 混合物（V∶V= 1 ∶1）]后的SPE 柱中，用10 mL 戊烷和MTBE 混合物（V∶V= 1 ∶1）洗脫，溫和的氮?dú)饬鲗⑾匆簼饪s至50 μL。通過(guò)在氣味測(cè)試條中嗅聞一滴來(lái)評(píng)估提取到的香氣濃縮液與原始樣品的茶葉浸泡液差異，以保證制備的濃縮液的氣味特征無(wú)顯著失真現(xiàn)象。隨后吸取3 μL濃縮液至進(jìn)樣口進(jìn)樣。

1.6.2 GC-MS 分析

（1）GC 條件。色譜柱為DB-5MS 和DBWAX。柱溫為40℃，進(jìn)樣口溫度為250℃，流速為1.2 mL/min，柱壓為9.147 psi。分流模式：不分流進(jìn)樣。載氣為高純氦氣（99.999%）。DB-5MS 色譜柱升溫程序：初始溫度為40℃，保持2 min，然后以35 ℃/min 的速率升溫至170 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 的速率將溫度升至250 ℃，保持2 min；DB-WAX 色譜柱升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min的速率升至170 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率將溫度升高至230 ℃，保持2 min。

（2）MS 條件。離子化方式為電子電離，電子能量為70 eV，掃描范圍為40 ～ 400 m/z，離子源溫度為230 ℃。

1.6.3 物質(zhì)鑒定

揮發(fā)性物質(zhì)鑒定使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所圖書館（98 L）和MassHunter 工作站未知物分析軟件完成。其中線性保留指數(shù)（RI）按照Alasalvar 等[20]的方法進(jìn)行計(jì)算，使用正構(gòu)烷烴C7 ～ C40 作為外部參考。為了量化不同炒青綠茶中每種香氣物質(zhì)的濃度（以mg/kg 表示），采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各個(gè)化合物的相對(duì)濃度。

Ci表示樣品中任一香氣物質(zhì)的濃度（mg/kg）；Cis表示內(nèi)標(biāo)的濃度（mg/kg）；Ai表示任一香氣物質(zhì)的峰面積；Ais表示內(nèi)標(biāo)的峰面積。

1.6.4 相對(duì)氣味活度值（rOAVs）計(jì)算

為更好地評(píng)估關(guān)鍵香氣物質(zhì)在整個(gè)茶葉香氣品質(zhì)中的貢獻(xiàn)，使用rOAVs 表示[1]。

Ci表示樣品中任一香氣物質(zhì)的濃度（mg/kg），OTi表示任一香氣物質(zhì)在水中的閾值（mg/kg）。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 26 軟件進(jìn)行單因素方差分析，SIMCA 14.1 用于化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，Origin 2021以及Adobe Illustrator 2021 用于繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同炒青綠茶的感官品質(zhì)與色差分析

4 種炒青綠茶的感官品質(zhì)差異較大（表1 和圖1）。BLC 外形纖細(xì)、卷曲成螺，滿身披毫，色澤銀綠；LJ 扁平光滑，勻整度高，顏色偏黃；MDGL 條索緊細(xì)勻卷，細(xì)嫩多毫；MJ 緊秀圓直，勻凈度高（圖1a）。沖泡后差異較為顯著。MJ嫩黃綠明亮，L值較高，a和b值較低，感官審評(píng)得分較高，為92 分；BLC 和MDGL 其次，達(dá)90.5 分；LJ 得分最低，色澤明亮，a值較低，b值較高，逐漸偏紅偏黃（圖1b-d，表1）。MJ和BLC 滋味較佳，其次為L(zhǎng)J，MDGL 相對(duì)較差。MJ 呈現(xiàn)較為明顯的花香，帶栗香，香氣品質(zhì)較佳；其次是BLC 和MDGL，呈現(xiàn)明顯的嫩香，稍帶豆香或花香；LJ 豆香顯著，帶花果香，感官得分較低。整體上來(lái)看，BLC 和MJ 品質(zhì)較佳，MDGL 和LJ 次之。

圖1 不同炒青綠茶的色差圖Figure 1 Plot of colour difference of different stir-fried green teas

2.2 不同炒青綠茶的非揮發(fā)性組分

2.2.1 總輪廓分析

4 種炒青綠茶共有1700 種物質(zhì)被檢出，化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果如圖2a ～ 圖2d?；谄钚《朔?判別分析（PLS-DA）模型，發(fā)現(xiàn)4 種炒青綠茶得到較好的分離，R2X(cum) = 0.807，R2Y(cum) = 0.994，Q2(cum) = 0.914，擬合效果較好，表明不同炒青綠茶間非揮發(fā)性組分差異顯著（圖2a）。圖2b 為載荷散點(diǎn)圖，圖中位于四周的物質(zhì)被認(rèn)定為關(guān)鍵差異物質(zhì)。隨后200次驗(yàn)證試驗(yàn)（圖2c）進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠性和準(zhǔn)確性?；诖_立好的模型，投影中可變的重要性（VIP）大于1 被用來(lái)篩選主要的差異貢獻(xiàn)物質(zhì)（圖2d）。隨后基于mzCloud 和ChemSpider 數(shù)據(jù)庫(kù)、相關(guān)文獻(xiàn)以及標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)篩選出的物質(zhì)進(jìn)一步鑒定，確定56 種非揮發(fā)性組分（表2）。其中，黃酮醇和黃酮醇/黃酮苷（16種）、有機(jī)酸及其衍生物（9 種）、兒茶素二聚體（9 種）、黃烷-3-醇（8 種）、糖類及其衍生物（5 種）、氨基酸及其衍生物（4 種）、酚酸（4 種）、生物堿（1 種）。黃酮醇和黃酮醇/黃酮苷占比較高，比例接近1/3；其次是有機(jī)酸及其衍生物；兒茶素二聚體、黃烷-3-醇在14.29% ～ 16.07%；剩下的4 種物質(zhì)的種類占比均在9%以下（圖2e）。從豐度上來(lái)看，4 種炒青茶中黃烷-3-醇類物質(zhì)的總豐度占所有物質(zhì)的比例均較高，為45.83% ～ 46.82%；其次為有機(jī)酸及其衍生物（19.00% ～ 20.66%），其余占比較?。▓D2f ～ 圖2i）。值得注意的是，MJ 中糖類及其衍生物的總豐度達(dá)到10%以上，豐度占比相較其他茶樣高。

圖2 不同炒青綠茶中非揮發(fā)性代謝物分析Figure 2 Analysis of non-volatile metabolites in different roasted green teas

續(xù)表

2.2.2 關(guān)鍵差異組分

為進(jìn)一步找出導(dǎo)致不同炒青綠茶的關(guān)鍵滋味品質(zhì)貢獻(xiàn)物質(zhì)，篩選出VIP＞4 的12 種物質(zhì)，結(jié)果如圖3 所示。從圖3 可看出，主要是黃酮醇和黃酮醇/黃酮苷、有機(jī)酸及其衍生物以及黃烷-3-醇等物質(zhì)占比較大。其中，BLC 中沒食子兒茶素-3,5-雙沒食子酸酯（EGCDG）的豐度較其他三種茶樣明顯要高。其作為一種特殊的兒茶素類化合物，主要存在于某些茶的鮮葉中，且含量很少[21]，推測(cè)是構(gòu)成該茶滋味尚鮮爽的關(guān)鍵物質(zhì)。KIM 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，上述物質(zhì)被鑒定為迄今為止最有效的淋巴酪氨酸磷酸酶活性抑制劑。而相比其他三種茶樣，LJ 中沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、山奈酚-3-半乳糖苷蕓香糖苷、檸檬酸以及沒食子兒茶素（GC）等代謝物的豐度明顯較高，且均達(dá)到顯著差異水平（p＜ 0.05），推測(cè)這些呈現(xiàn)苦、澀和酸味的物質(zhì)協(xié)同構(gòu)成了該茶滋味尚鮮爽的品質(zhì)特點(diǎn)；而4-O-甲基水楊酸、EGCDG 的豐度較低。MDGL 中3-O-沒食子?？鼘幩岷驮ㄇ嗨谺1 的豐度相對(duì)較高，但并未達(dá)到顯著水平（p＞ 0.05），其對(duì)該茶呈現(xiàn)醇正滋味具有一定的貢獻(xiàn)作用。相比其他三種茶，MJ 中1,3,6-三酰基葡萄糖的豐度較高。該物質(zhì)是一種可水解的單寧，由沒食子酸（及其聚合物衍生物）的羧基與單糖（最常見的是葡萄糖）的羥基縮合而成，研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對(duì)綠茶澀味具有重要貢獻(xiàn)[23]，這可能是該茶湯滋味較鮮醇的原因。

圖3 不同炒青綠茶中關(guān)鍵非揮發(fā)性代謝物對(duì)比Figure 3 Comparison of key non-volatile metabolites in different stir-fried green teas

上述結(jié)果表明，從關(guān)鍵差異物質(zhì)的豐度對(duì)比來(lái)看，LJ 相比其他三種茶的代謝差異最大，其滋味品質(zhì)方面的差異可通過(guò)幾種關(guān)鍵的代謝物如GCG、山奈酚-3-半乳糖苷蕓香糖苷、檸檬酸以及GC 等代謝物較為明顯地區(qū)分，這可能是其茶湯滋味尚鮮爽的關(guān)鍵貢獻(xiàn)物質(zhì)。BLC 和MJ 則可分別通過(guò)EGCDG 和1,3,6-三酰基葡萄糖進(jìn)行區(qū)分。

2.3 不同炒青綠茶的揮發(fā)性組分

2.3.1 總輪廓分析

香氣對(duì)茶葉的風(fēng)味品質(zhì)形成以及感官品質(zhì)評(píng)估都具有較大影響。基于GC-MS 分析，4 種炒青綠茶中共鑒定出91 種香氣物質(zhì)（表3）。就香氣類別而言，BLC、LJ、MDGL 和MJ 中分別鑒定出59 種、71 種、49 種和62 種香氣物質(zhì)，其中醇類、醛類和酮類占比較大（圖4a）。醇類和酮類是花香產(chǎn)生的原因，而醛類主要有助于柑橘味和青草味的生成[14,24]。就香氣濃度而言，BLC 中檢出的香氣物質(zhì)總濃度最少，僅7.05 mg/kg；而在LJ、MDGL 和MJ 中檢出的總香氣濃度依次增加，分別達(dá)到16.07 mg/kg、17.11 mg/kg 和20.09 mg/kg，其中醇類、酸類和吡咯類及其衍生物占比較大（圖4b）。

表3 4 種炒青綠茶中揮發(fā)性物質(zhì)鑒定結(jié)果Table 3 Identification of volatile substances in four kinds of stir-fried green tea

續(xù)表

圖4 不同炒青綠茶中揮發(fā)性代謝物分析Figure 4 Analysis of volatile metabolites in different stir-fried green teas

為進(jìn)一步篩選出導(dǎo)致不同炒青茶香氣差異的主要貢獻(xiàn)組分，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果如圖4c ～ 圖4f。首先基于已有的所有香氣數(shù)據(jù)建立PLS-DA 模型，其中R2X（cum）= 0.964，R2Y（cum）= 0.998，Q2（cum）= 0.987，表明模型擬合效果良好；同時(shí)從圖4c 可看出，不同炒青茶間也得到很好地區(qū)分。載荷散點(diǎn)圖（圖4d）中位于坐標(biāo)軸四周的物質(zhì)對(duì)茶樣香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)更大，如乙酸丁酯（9，果味，青草）在BLC的香氣形成中貢獻(xiàn)較大；苯甲醇（66，苦杏仁，果味）、2-戊酮（5，果味，香蕉）、鄰氨基苯甲酸甲酯（80，甜）、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）（62，花香，木香）、茉莉酮（69，木質(zhì)，草本，花香，柑橘）、2-羥基-5-甲基苯乙酮（78，甜，重花香，草本）等則在LJ 貢獻(xiàn)較大；丙醇（8，刺鼻，果味）、反-2-辛烯醛（34，脂肪，堅(jiān)果）、順-2-戊烯-1-醇（28，霉味，堆肥）、丁酸（53，汗味）、2-甲基丙醇（11，麥芽）等在MDGL 中貢獻(xiàn)較大；而α-松油醇（57，花香，柑橘）、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯（24，果香）、異丁酸異戊酯（19，果味）、異戊醇（20，麥芽）、4-甲基-2-戊酮（7，果香）則在MJ 中貢獻(xiàn)較大。圖4e 通過(guò)200 次驗(yàn)證未出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證圖4c 模型的可靠性。隨后基于VIP＞1（圖4f）篩選出47 種主要的香氣差異物質(zhì)。

2.3.2 關(guān)鍵差異物質(zhì)

基于2.3.1 中篩選出的47 種香氣物質(zhì)，結(jié)合香氣濃度和閾值計(jì)算不同炒青綠茶中相應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)香氣活度值（rOAVs），結(jié)果如表4所示。rOAVs 可以更好地評(píng)估某些關(guān)鍵香氣成分在不同炒青綠茶香氣體系中的重要貢獻(xiàn)，其數(shù)值大于1 表示其在香氣體系中的貢獻(xiàn)較大。結(jié)合表4 和rOAVs＞1，BLC、LJ、MDGL 及MJ 中分別檢出10、11、14、13 種符合篩選條件的物質(zhì)，這些物質(zhì)在不同炒青綠茶香氣品質(zhì)的形成中貢獻(xiàn)較大。其中不同炒青綠茶中某些特定的香氣物質(zhì)貢獻(xiàn)突出，其rOAVs 超過(guò)10。如4 種炒青綠茶中的茉莉酸甲酯、吲哚、茉莉酮和壬醛，BLC 和LJ 中的香豆素和庚醛，LJ 和MJ 中的(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）等，這些物質(zhì)可能是導(dǎo)致不同炒青茶香氣輪廓差異的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。

表4 4 種炒青茶中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)篩選（VIP ＞ 1）Table 4 Screening of key aroma substances in four types of stir-fried green tea（VIP ＞ 1）

續(xù)表

一般來(lái)說(shuō)，茶葉中各個(gè)香氣成分種類、含量以及比例不同，會(huì)形成綠茶不同風(fēng)格的香氣特點(diǎn)，最典型的香型有清香、花香和烘炒香等。其中清香屬性主要來(lái)源于殺青過(guò)程中低沸點(diǎn)香氣物質(zhì)的揮發(fā)、高沸點(diǎn)香氣物質(zhì)的顯現(xiàn)以及脂肪酸氧化裂解后反應(yīng)產(chǎn)物的生成；花果香主要來(lái)源于熱作用下萜烯醇類以及多酚氧化酶作用產(chǎn)物的生成；烘炒香主要來(lái)源于美拉德反應(yīng)過(guò)程中氮氧化合物及其衍生物的生成[25]。為更好地比較不同炒青綠茶中的關(guān)鍵差異物質(zhì)，進(jìn)一步篩選4 種炒青茶中rOAVs＞5 的香氣物質(zhì)（圖5），這些物質(zhì)被鑒定為本研究中導(dǎo)致不同炒青茶香氣輪廓差異的關(guān)鍵物質(zhì)。從圖中可看出，相比MDGL 和MJ，BLC 中香豆素（16.382，木屑狀、杏仁糊狀）和庚醛（8.115，柑橘，脂肪）等物質(zhì)的rOAVs 較為突出，參與了BLC 豆香和果香屬性的形成，從而構(gòu)成了該茶嫩香與稍帶豆香的感官品質(zhì)。陳合興[26]研究發(fā)現(xiàn)，香豆素是造成不同等級(jí)碧螺春春茶香氣品質(zhì)差異的關(guān)鍵貢獻(xiàn)物質(zhì)之一。相比其他三種茶，LJ 中的庚醛（10.262，柑橘，脂肪）、香豆素（27.527，木屑狀、杏仁糊狀）、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）（90.902，花香，木香）、(E,E)-2,4-庚二烯醛（5.523，脂肪，花香）、正己醇（7.086，青草味，杏仁糖味）等物質(zhì)的rOAVs 明顯更高；其中庚醛閾值較低，僅為0.002 8 mg/kg（表4），推測(cè)其可能參與LJ 中果香氣味的形成。張銘銘等[4]研究也發(fā)現(xiàn)庚醛是導(dǎo)致不同栗香特征的炒青綠茶的關(guān)鍵差異香氣物質(zhì)之一。具有較低閾值（0.003 4 mg/kg）的香豆素可能參與構(gòu)成了LJ 中豆香氣味的形成。Mistuya Shimoda 等[27]在研究不同等級(jí)綠茶的香氣成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成烘烤香的香豆素是形成綠茶典型香氣的主要成分之一。Ryoko Baba 等[28]基于SAFE 結(jié)合GC-MS、GC-O 發(fā)現(xiàn)香豆素是構(gòu)成龍井茶特征香氣成分的關(guān)鍵貢獻(xiàn)物質(zhì)之一。(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）和(E,E)-2,4-庚二烯醛則可能參與LJ 中花香屬性的形成。王夢(mèng)琪等[8]研究發(fā)現(xiàn)，(E,E)-2,4-庚二烯醛和芳樟醇及其氧化物在西湖龍井茶中含量較高。而正己醇可能參與了LJ 茶清香氣味的形成。這些關(guān)鍵香氣物質(zhì)共同形成了LJ 豆香顯、帶花果香的感官品質(zhì)。

圖5 不同炒青綠茶中關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)活度值Figure 5 Relative activity values of key volatile substances in different stir-fried green teas

相比其他三種茶，MDGL 中的(E,Z)-庚二烯醛（9.900，脂肪，油炸）、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）（5.523，花香，木香）的rOAVs明顯更高，推測(cè)其可能參與構(gòu)成MDGL 花香氣味的形成，構(gòu)成了MDGL 中嫩香帶花香的感官屬性。董燕靈等[29]研究發(fā)現(xiàn)蒙頂甘露中順式芳樟醇（176.11%）、β-紫羅蘭酮（163.92%）、反式芳樟醇（116.79%）、橙花叔醇（101.24%）和反-橙花叔醇（86.57%）等物質(zhì)相對(duì)含量較高，該結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果不太一致，這可能與香氣萃取方式、茶葉樣品的類型以及檢測(cè)方法等因素有關(guān)。MJ 相比其他三種茶，其中的茉莉酮（198.124，木質(zhì)，草本，花香，柑橘）、異戊酸異戊酯（9.868，果味，甜味）、吲哚（343.814，花香，樟腦丸）、茉莉酸甲酯（168.394，花，草本，甜）、壬醛（69.423，柑橘，肥皂）、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）（98.118，花香，木香）等物質(zhì)的rOAVs 更突出。其中，茉莉酮是綠茶中呈現(xiàn)花香和木質(zhì)風(fēng)味的關(guān)鍵香氣化合物[30]。吲哚被報(bào)道具有花香和樟腦丸氣味，被鑒定為綠茶和烏龍茶中具有高OAV 的重要香氣化合物[30,31]。茉莉酸甲酯是茶葉中α-亞麻酸在脂氧合酶催化下氧化降解產(chǎn)生的代表性香氣物質(zhì)[32]。壬醛被鑒定為綠茶茶湯中呈花香或果香的物質(zhì)[33]。芳樟醇氧化物的甜香和花香不是來(lái)自芳樟醇自身的氧化，而是來(lái)自新鮮茶葉中芳樟醇氧化物的糖苷形式[34]。劉健軍等[35]也研究發(fā)現(xiàn)，信陽(yáng)毛尖茶中壬醛、芳樟醇氧化物等香氣物質(zhì)含量較高。由此推測(cè)茉莉酮、吲哚、茉莉酸甲酯、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）、壬醛等參與了MJ 中花香屬性的形成，異戊酸異戊酯、壬醛參與了MJ 中果香屬性的形成，這幾種物質(zhì)協(xié)同構(gòu)成了MJ 花香顯、帶栗香的感官品質(zhì)。

綜上結(jié)果可得出，茉莉酸甲酯、吲哚、茉莉酮和壬醛均是構(gòu)成四種炒青茶中花果香屬性的關(guān)鍵主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。此外，基于4 種茶中主要香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)的rOAVs 比較分析，發(fā)現(xiàn)相比其余三種茶樣，庚醛、香豆素、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）、(E,E)-2,4-庚二烯醛、正己醇等主要構(gòu)成了LJ 豆香顯、帶花果香的感官品質(zhì)；(E,Z)-2,4-庚二烯醛、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）等主要構(gòu)成了MDGL 嫩香帶花香的感官品質(zhì)；茉莉酮、異戊酸異戊酯、吲哚、茉莉酸甲酯、壬醛、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）等主要構(gòu)成了MJ花香顯、帶栗香的感官品質(zhì)。相比MDGL 和MJ，香豆素和庚醛等主要構(gòu)成了BLC 嫩香稍帶豆香的感官品質(zhì)。上述研究結(jié)果與表1 的審評(píng)結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本研究基于UHPLC-Q-Exactive-MS、GC-MS以及非靶向代謝組學(xué)等分析手段，對(duì)BLC、LJ、MDGL 以及MJ 等單芽到一芽一葉加工成的炒青綠茶的感官和風(fēng)味品質(zhì)輪廓進(jìn)行表征。結(jié)果表明，不同類型的炒青綠茶風(fēng)味品質(zhì)差異較大。感官品質(zhì)方面，BLC 和MJ 品質(zhì)較佳，MDGL 和LJ 次之。GCG、山奈酚-3-半乳糖苷蕓香糖苷、檸檬酸以及GC 等關(guān)鍵滋味代謝物可能參與LJ 茶湯尚鮮爽的滋味輪廓構(gòu)成，可明顯區(qū)別于其他炒青綠茶。而BLC 和MJ 則可分別通過(guò)EGCDG 和1,3,6-三?；咸烟沁M(jìn)行區(qū)分。茉莉酸甲酯、吲哚、茉莉酮和壬醛是構(gòu)成4種炒青茶中花果香屬性的共有貢獻(xiàn)物質(zhì)。其中庚醛、香豆素、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）、(E,E)-2,4-庚二烯醛、正己醇等主要構(gòu)成了LJ豆香顯、帶花果香的感官品質(zhì)。(E,Z)-2,4-庚二烯醛、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）等主要構(gòu)成了MDGL 嫩香帶花香的感官品質(zhì)。茉莉酮、異戊酸異戊酯、吲哚、茉莉酸甲酯、壬醛、(Z)-芳樟醇氧化物（吡喃型）等主要構(gòu)成了MJ 花香顯、帶栗香的感官品質(zhì)。相比MDGL 和MJ，香豆素和庚醛等主要構(gòu)成了BLC 嫩香稍帶豆香的感官品質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果可為炒青綠茶風(fēng)味輪廓圖的建立提供一定的理論支撐，進(jìn)一步完善綠茶的風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控理論體系，指導(dǎo)綠茶的加工與生產(chǎn)。