喻潔，楊秋怡，易嘉寧，曾杰

[湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院） 乳甲外科，湖南 長沙 410005]

方法：采用Transwell 實驗檢測miR-204-5p 過表達和敲低對PTC 細胞系TPC-1 細胞的侵襲能力影響；通過miRDB 網(wǎng)站預(yù)測miR-204-5p 下游靶基因，并采用Western blot 實驗、Transwell 實驗、GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C。

結(jié)果：Transwell 實驗結(jié)果顯示，過表達miR-204-5p 的TPC-1 細胞侵襲能力明顯降低，而miR-204-5p 抑制的TPC-1 細胞侵襲能力明顯增強（均P＜0.05）。miRDB 網(wǎng)站預(yù)測顯示，TNFRSF12A 可能為miR-204-5p 下游靶基因；Western blot 結(jié)果顯示，過表達miR-204-5p 的TPC-1 細胞TNFRSF12A 表達下調(diào)，而miR-204-5p抑制的TPC-1細胞TNFRSF12A表達上調(diào)；過表達TNFRSF12A的TPC-1細胞侵襲能力明顯增強，TNFRSF12A抑制的TPC-1 細胞的侵襲能力明顯降低；TNFRSF12A 可逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 對TPC-1 細胞侵襲能力的影響（均P＜0.05）。GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，TNFRSF12A 在PTC 組織中高表達。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，TNFRSF12A 是miR-204-5p 的靶基因。

結(jié)論：miR-204-5p可靶向結(jié)合TNFRSF12A mRNA的3'UTR抑制TNFRSF12A的表達，而PTC細胞中miR-204-5p表達下調(diào)，削弱了其對TNFRSF12A 表達的抑制，從而導(dǎo)致PTC 細胞侵襲能力增強。

甲狀腺癌是全球最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，已成為惡性腫瘤第8 位，為女性第4 位高發(fā)癌癥，嚴重加重全球衛(wèi)生負擔(dān)，而甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌的主要形式，約占所有甲狀腺癌患者的80%～85%[1]。PTC 的主要特征之一是能夠侵入鄰近結(jié)構(gòu)，例如淋巴管。大約有10%的患者在初診時已經(jīng)具有轉(zhuǎn)移病灶。盡管大多數(shù)PTC 在生物學(xué)行為上表現(xiàn)良好，但由于其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，仍嚴重威脅人類健康。隨著對PTC 分子發(fā)病機制的深入研究，從基因水平探討PTC 的分子機制，分析PTC 發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的改變，尋找更加有效的治療靶點，對PTC 的預(yù)防及治療至關(guān)重要。

microRNA（miRNA）是一類小型非編碼RNA，能夠識別特定目標mRNA 的3' 非翻譯區(qū)域（3'UTR），并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進靶mRNA 的降解或抑制翻譯過程而發(fā)揮負調(diào)控基因表達的作用。細胞內(nèi)主要信號通路往往與關(guān)鍵miRNA 分子相互協(xié)調(diào)作用，促進腫瘤發(fā)展。Su 等[2]發(fā)現(xiàn)miR-200a 通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF 信號通路促進宮頸癌細胞增殖；Kim 等[3]發(fā)現(xiàn)miR-155 能驅(qū)動腫瘤細胞的增殖，其表達情況與乳腺癌患者的生存密切相關(guān)；Larson等[4]通過高通量的檢測技術(shù)在前列腺癌中建立了與腫瘤惡性進展相關(guān)的基因和miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；Chou 等[5]發(fā)現(xiàn)在肺癌中EGFR 信號可以通過Ras/ERK/Myc 信號通路誘導(dǎo)miR-7 的表達，而miR-7 通過其靶點EGFR 影響Akt 信號通路的活性；Nourmohammadi 等[6]發(fā)現(xiàn)在食道癌中miR-200c 可以通過Akt 信號通路使腫瘤對化療產(chǎn)生耐藥性；miR-21是一種致癌的miRNA，Dan 等[7]發(fā)現(xiàn)其在體外與乳腺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)，而體內(nèi)高水平的miR-21預(yù)示著乳腺癌患者預(yù)后不良，而下調(diào)miR-21 的表達可以改善乳腺癌的疾病進展。由此可見，miRNA分子參與了腫瘤細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控功能，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后起到了關(guān)鍵性的作用。

通過前期查閱文獻、數(shù)據(jù)[8]和筆者在PTC 細胞中相關(guān)分子表達驗證發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 在PTC 中呈低表達，并可能作為關(guān)鍵分子在PTC 中發(fā)揮重要作用。因此，本研究進一步探討miR-204-5p 對PTC侵襲能力影響的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

選用PTC 細胞系TPC-1 細胞，根據(jù)細胞培養(yǎng)要求選用1640 培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1%谷氨酰胺，將細胞放置于5% CO2（v/v）的培養(yǎng)箱中孵育，設(shè)置溫度為37 ℃。

1.2 qRT-PCR實驗

收集細胞樣本后，用TRIzol 法提取各組細胞總RNA，核酸定量儀檢測RNA 的純度和濃度。按照Invitrogen 公司“用于qRT-PCR 的M-MLV 第一鏈合成系統(tǒng)”操作說明，取1～3 μg 總RNA 建立20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。繼之，使用Invitrogen 公司的“Platinum SYBR Green qPCRSuperMix-UDG with ROX”試劑盒和ABI 7500 Fast Real-time PCR 擴增儀進行熒光擴增。

1.3 Western blot實驗

電泳膠由上層膠（濃縮膠）和下層膠（分離膠）組成，下層膠可根據(jù)不同分子量大小配置濃度不一，可分為15%、12%、10%、8%不等，上層膠濃度為5%。將配備好的膠嵌入電泳槽中，向槽內(nèi)加滿1x 電泳液，取出玻璃槽中的梳子，分別加入待測樣本，在待測樣本臨近孔中加入1 μL Protein Marker，然后繼續(xù)在電泳盒中加入電泳液。接通電源即開始電泳。然后通過轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜后顯影。將A、B顯影液按1∶1 體積提前配備好，將PVDF 膜浸潤顯影液后，通過Bio-Rad 蛋白顯影成像系統(tǒng)進行曝光處理。根據(jù)曝光后蛋白條帶的清晰程度可手動調(diào)節(jié)曝光程序和曝光時間。

1.4 Transwell 侵襲實驗

在24 孔板下室加入500 μL 含10%FBS 培養(yǎng)基。然后用鑷子將Transwell 小室置于24 孔板內(nèi)。每孔加入200 μL 細胞懸液到Transwell 上室中。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后可進行固定染色。取出Transwell 小室，吸走培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭Matrigengel 和上室內(nèi)的細胞。在24 孔板干凈的孔中加入4%多聚甲醛600 μL，將小室放入后固定20～30 min。棄去固定液，將小室在盛有PBS 的6 cm 皿中刷洗1 遍。用0.1%結(jié)晶紫染色5～10 min，PBS 刷洗3 遍，除去未與細胞結(jié)合的結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側(cè)，將非特異性結(jié)合于小室上表面的染料擦掉，以便后續(xù)鏡檢。適當風(fēng)干后，在10 倍顯微鏡下選取5 個視野觀察細胞并計數(shù)。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過miRDB 網(wǎng)站預(yù)測miR-204-5p 與TNFRSF12A 3'UTR 結(jié)合位點，然后分別構(gòu)建TNFRSF12A 3'UTR野生型和突變型質(zhì)粒，過表達miR-204-5p 和加入miR-204-5p 抑制劑后，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分別測量野生型和突變型TNFRSF12A 3'UTR 的熒光值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

每次實驗都進行3 次重復(fù)，統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。研究結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析或t檢驗統(tǒng)計不同組間的差異。實驗結(jié)果可視化分析用Graphpad軟件。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-204-5p對PTC細胞侵襲能力的影響

Transwell 實驗結(jié)果顯示，過表達miR-204-5p后，TPC-1 細胞的侵襲能力減弱（圖1A），而抑制miR-204-5p 表達后，TPC-1 細胞的侵襲能力增強（均P＜0.05）（圖1B）。

2.2 miR-204-5p下游靶基因分析

通過生物信息學(xué)分析，TNFRSF12A 可能為miR-204-5p 調(diào)控的靶點，且可能為PTC 預(yù)后標志物[8]。有研究[9]顯示，TNFRSF12A 與血管生成相關(guān)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，血管生成對腫瘤的生長和進展至關(guān)重要。同時Tanaka 等[10]報道了血管生成和抗血管生成因子之間的平衡與PTC 的明顯侵襲相關(guān)，提示了血管生成在PTC 中的重要性。故推測這兩者與PTC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。為了進一步驗證miR-204-5p 對TNFRSF12A 的調(diào)控，用Western blot 實驗檢驗了過表達或抑制miR-204-5p 后PTC 細胞中TNFRSF12A 的表達情況，結(jié)果表明：過表達miR-204-5p 后TPC-1 細胞中TNFRSF12A 表達降低，抑制miR-204-5p 后TPC-1 細胞中TNFRSF12A 表達升高（均P＜0.05）（圖2A-B）。進一步功能實驗表明：TNFRSF12A 可增強TPC-1 細胞侵襲能力，而敲低TNFRSF12A 后TPC-1 細胞的侵襲能力減弱（均P＜0.05）（圖2C-D）。同時，逆轉(zhuǎn)實驗表明過表達TNFRSF12A 可部分逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 對TPC-1 細胞侵襲能力的影響（均P＜0.05）（圖2E）。同時，GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn） 分析也表明TNFRSF12A 在PTC 組織中高表達（圖2F）。

圖2 miR-204-5p 下游靶基因分析 A：過表達miR-204-5p 后TPC-1 細胞TNFRSF12A 蛋白表達水平降低；B：加入miR-204-5p 抑制劑后TPC-1 細胞TNFRSF12A 蛋白表達水平增高；C：TPC-1 細胞過表達TNFRSF12A 后侵襲能力增強；D：TPC-1 細胞敲低TNFRSF12A 后侵襲能力減弱；E：TNFRSF12A 可逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 降低TPC-1 侵襲能力的作用；F：GEPⅠA 數(shù)據(jù)庫分析表明TNFRSF12A在PTC組織中高表達

2.3 miR-204-5p對ATNFRSF12A的調(diào)控關(guān)系分析

為了在分子水平驗證miR-204-5p 對TNFRSF12A的調(diào)控，進一步分析miR-204-5p 在TNFRSF12A 3'UTR 的潛在結(jié)合位點（圖3A），使用雙熒光素酶報告實驗對該靶點功能進行了檢測，結(jié)果表明，過表達miR-204-5p 降低了轉(zhuǎn)染野生型TNFRSF12A 3'UTR TPC-1 細胞中的熒光素酶活性，而加入miR-204-5p 抑制劑增加了轉(zhuǎn)染野生型TNFRSF12A 3'UTR TPC-1 細胞中熒光素酶的活性（均P＜0.05），而對突變型TNFRSF12A 3'UTR 無明顯影響（均P＞0.05）（圖3B）。

圖3 miR-204-5p 對ATNFRSF12A 的調(diào)控關(guān)系分析 A：與miR-204-5p 相作用的野生型及突變型TNFRSF12A 3'UTR 序列；B：雙熒光素酶實驗驗證轉(zhuǎn)染野生型或突變型TNFRSF12A 3'UTR后，過表達或加入miR-204-5p抑制劑對TPC-1細胞的影響

3 討 論

根據(jù)全球數(shù)據(jù)[11]表示，在過去的30 年間，甲狀腺癌的發(fā)病呈爆發(fā)式增長，而PTC 約占所有甲狀腺癌病例的85%左右。在碘缺乏或碘過量飲食的國家，它也是最常見的甲狀腺癌亞型[12]。PTC 可發(fā)生在任何年齡[13-14]，其發(fā)病的平均年齡為40 歲，且發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，女性更為多見，比例為2∶1～4∶1[15]。PTC 的發(fā)病機制及原因尚不明確，可能與放射線接觸史[16]、碘缺乏或遺傳等因素[17]相關(guān)。進一步研究和探索PTC 發(fā)病的分子機制和潛在的治療靶點對PTC 的預(yù)防和治療有重要意義。

miRNA 通過抑制細胞質(zhì)中mRNA 的翻譯和（或）降解，以及改變細胞核中基因表達，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。miRNA 的失調(diào)已經(jīng)被證實與多種疾病的發(fā)生與進展密切相關(guān)，與遺傳分析相比，關(guān)于miRNA 作為PTC 生物標志物的應(yīng)用的研究有很多。目前，已經(jīng)有研究證實，與正常甲狀腺組織相比，PTC 始終與特定miRNA（例如miR-146b，miR-221 和miR-222）的過表達有關(guān)。這些miRNA 的表達顯然與指示腫瘤侵襲性的特征有關(guān)，例如甲狀腺癌侵犯、復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移和BRAFV600E 突變等[19-20]。

筆者通過對相關(guān)的測序進行分析，篩選出了潛在研究靶點（miR-204-5p、miR-7-2、miR-146b、miR-222），然后通過在PTC 癌組織和細胞中進行驗證，最終確定miR-204-5p 為研究對象，并通過侵襲實驗驗證了miR-204-5p 對PTC 細胞的影響，進一步證實了miRNA 在PTC 進展中的作用。由于目前研究的局限性，其他三種miRNA 在PTC 中的作用及分子機制仍需進一步實驗證實。

結(jié)合到下游基因3'UTR 區(qū)域以此抑制下游基因的表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制是miRNA 調(diào)控的最主要分子機制。以此為基礎(chǔ)，結(jié)合相應(yīng)的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，本研究篩選出了TNFRSF12A 可能作為miR-204-5p 調(diào)控靶點。 TNFRSF12A， 也被稱為Fn14，它是TNF 受體超家族中包含細胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域的最小個體。有研究報道TNFRSF12A 在肝癌、肺癌等惡性腫瘤中表達升高，其水平的升高與臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[21-22]，TNFRSF12A 也被認為是促進前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的一個重要因素[23]，但它與PTC 的相關(guān)研究較少。本研究中發(fā)現(xiàn)TNFRSF12A 在PTC 組織中高表達，結(jié)合miR-204-5p在PTC 組織中低表達，預(yù)示著miR-204-5p 可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制TNFRSF12A。本研究結(jié)果也證實了miR-204-5p 能通過結(jié)合TNFRSF12A 3'UTR 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其表達。

總之，miR-204-5p/TNFRSF12A 軸PTC 的侵襲與進展中起了重要作用，機制為PTC 細胞中miR-204-5p 表達下調(diào)，削弱了對TNFRSF12A 表達的抑制，從而導(dǎo)致PTC 細胞侵襲能力增強。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：曾杰實驗設(shè)計、實驗指導(dǎo)、審核和修改論文；喻潔、楊秋怡負責(zé)文獻查閱、實驗實施、數(shù)據(jù)收集和處理；喻潔、易嘉寧負責(zé)數(shù)據(jù)分析和解釋；喻潔負責(zé)手稿寫作。