張磊　華利忠　郝飛　劉蓓蓓　孫葉茂　馮志新　邵國青

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征一直是影響?zhàn)B豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病，通過對1個PRRSV陰性豬場母豬突發(fā)大量流產(chǎn)的病例進(jìn)行抗體和病原檢測，細(xì)菌分離鑒定和MIC測定，然后制定和實施防控措施和評價指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）50份流產(chǎn)母豬PRRSV抗體檢測陽性率100%；（2）母豬血清、流產(chǎn)物、睪丸去勢液及保育豬組織樣本，PRRSV陽性率分別為90.0%、80.0%、100.0%及85.7%，但所有樣本CSFV、PRV、PPV及SIV病原均為陰性；（3）4份PRRSV陽性樣本經(jīng)ORF3、ORF5及Nsp2測序和比對，結(jié)果均與NADC30同源性最高；（4）保育豬組織樣本分離到鏈球菌和副豬嗜血桿菌，MIC測定結(jié)果顯示氟苯尼考和阿莫西林對上述2種分離菌最敏感；（5）控制措施實施后的3個月，母豬的流產(chǎn)率從發(fā)病期的43.6%，下降至3.6%，斷奶7 d內(nèi)配種率從發(fā)病期的63.3%上升至87.5%，哺乳仔豬和保育豬的死亡率分別從發(fā)病期的28.4%和38.8%下降至3.8%和4.7%。通過對該病例的診斷和疫情分析，采用滅活苗免疫接種和藥物保健綜合防控措施可快速取得效果，為規(guī)?；N豬場的PRRSV暴發(fā)防控提供參考。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；病原檢測；最小抑菌濃度；防控；評價

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）21-0182-06

自非洲豬瘟于2018年進(jìn)入中國后，對中國的養(yǎng)豬業(yè)有著深遠(yuǎn)的影響［1-2］，尤其是在生物安全方面得到了前所未有的改善，同時也有利于豬場其他疫病的防控。然而，隨著對非洲豬瘟疫病關(guān)注度不斷提升，對豬繁殖與呼吸綜合征（別稱豬藍(lán)耳?。┑年P(guān)注度逐漸下降，但并不意味著豬場豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病率也在下降，還是有很多豬場在控制非洲豬瘟的情況下仍受藍(lán)耳病干擾，從長遠(yuǎn)角度講，豬場仍應(yīng)該把豬繁殖與呼吸綜合征作為豬場首要防控對象之一，因為豬繁殖與呼吸綜合征是豬場最大的成本漏洞，也是最大的安全漏洞［3-4］。尤其是近年來，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）類NADC30毒株的傳播越發(fā)嚴(yán)重［5］。本研究詳細(xì)介紹了一PRRSV陰性豬場因突發(fā)PRRSV類NADC30毒株感染而暴發(fā)母豬流產(chǎn)，并造成細(xì)菌繼發(fā)感染，導(dǎo)致仔豬死亡率增加的病例，對該病例的診斷、防控措施及評價，做了詳細(xì)的闡述與分析，對臨床PRRSV的防控，具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

PRV抗體檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司；PRRSV抗體檢測試劑盒及豬瘟抗體檢測試劑盒，購自JNT公司；PCV2抗體檢測試劑盒，購自法國Synbiotics公司。

DL2000 DNA Marker、Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）、PrimeScriptTM One step RT-PCR Kit Ver，均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.2 發(fā)病情況

江蘇某豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬野毒雙陰性規(guī)?；N豬場（該豬場不免疫PRRSV疫苗，PRRSV病原抗體雙陰性，能繁母豬3 600頭），于2020年12月始，懷孕母豬陸續(xù)出現(xiàn)輪轉(zhuǎn)性隔頓不吃的現(xiàn)象，體溫正常（除個別達(dá)40 ℃外），發(fā)病率30%以上。采集血液送第三方進(jìn)行非洲豬瘟檢測，結(jié)果為陰性。不久出現(xiàn)大批母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)現(xiàn)象，同時，死胎和木乃伊胎數(shù)量也急劇上升。至2021年1月，保育豬陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)燒（普遍39.5 ℃以上）、少食、消瘦、呼吸困難、皮膚發(fā)紅、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀，伴有少數(shù)神經(jīng)癥狀。保育豬于發(fā)病初期使用替米考星、延胡索酸泰妙菌素等抗生素拌料用藥，未達(dá)到明顯效果。

1.2.1 樣本采集流產(chǎn)胎兒及發(fā)病豬病原檢測

（1）母豬樣本采集：選擇50頭流產(chǎn)的母豬，采集血樣、分離血清、立即冷鏈保存，送往實驗室，進(jìn)行抗體檢測。同時采集流產(chǎn)胎兒樣本5份，摘取其肺臟、脾臟、腹股溝淋巴結(jié)、腦等組織。

（2）哺乳仔豬去勢液采集：早產(chǎn)母豬分娩的哺乳仔豬的公豬，在去勢時采集睪丸去勢液5份。

（3）保育豬樣本采集：選擇有呼吸道臨床癥狀的保育豬7頭，剖檢，采集脾臟、淋巴結(jié)、肺臟、腦等組織。

所有樣本采集后立即冷鏈保存，送往實驗室，進(jìn)行抗體和/或病原檢測及細(xì)菌分離鑒定。

1.3 抗體檢測

50份母豬血清樣本，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，進(jìn)行PRRSV、CSFV、PRV（gE）及PCV2抗體檢測。

1.4 病原檢測

病原檢測樣本分為4種：（1）母豬血清樣本：上述50份母豬血樣，隨機(jī)選擇20份；（2）流產(chǎn)物：每個流產(chǎn)樣本混合成1個流產(chǎn)混合物，共5份；（3）睪丸去勢液5份；（4）發(fā)病保育豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)混樣，共7份。上述樣本按照病毒基因組DNA/RNA抽提按TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。所提取的核酸，按照試劑盒說明書，進(jìn)行PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PPV及SIV病原檢測。

1.5 PRRSV測序及比對

為明確豬場感染的PRRSV的毒株類型，選擇PRRSV陽性的睪丸去勢液及保育豬組織樣本各2份，進(jìn)行ORF3、ORF5序列及Nsp2基因序列分析，PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，所獲得的ORF3、ORF5和Nsp2基因序列和國內(nèi)外報道的代表毒株用生物信息學(xué)軟件DNAStar和MEGA 6.06進(jìn)行同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.6 細(xì)菌分離鑒定

對于采集的7份保育豬肺樣，接種TSB培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，挑選可疑菌落，單克隆后進(jìn)行16S RNA的鑒定。

1.7 藥敏實驗

將分離鑒定獲得的細(xì)菌分離株，各選擇其中1個株，根據(jù)美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）推薦的微量稀釋方法測定各種抗菌藥物對分離菌的MIC測定。具體方法：將培養(yǎng)好的菌液采用TSA培養(yǎng)基調(diào)至0.5個麥?zhǔn)蠞岫葐挝贿M(jìn)行測定。細(xì)菌培養(yǎng)物放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄結(jié)果。其中，藥敏試驗所使用的抗生素包括：氟苯尼考（粉劑）、替米考星（粉劑）、替米考星（包被劑1）、替米考星（包被劑2）、阿莫西林1、阿莫西林2、喹烯酮、延胡索酸泰妙菌素、復(fù)合磺胺、土霉素等10種抗生素。

1.8 綜合防控措施

發(fā)病豬場采用免疫接種和藥物保健綜合防控措施。

（1）疫苗免疫。使用PRRSV滅活疫苗進(jìn)行免疫，免疫方案為：后備母豬，經(jīng)產(chǎn)母豬公豬全群免疫浙江美保龍生物技術(shù)有限公司的蘭立定牌豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗4 mL，2周后二免2 mL；之后經(jīng)產(chǎn)母豬和公豬每3個月免疫1次，每次2 mL；二免后3個月還沒有配種的后備母豬在配種前再免疫1次，免疫劑量為2 mL。仔豬15日齡免疫1 mL，斷奶后加強(qiáng)免疫1次，免疫劑量2 mL，具體方案詳見表1。

（2）藥物治療和預(yù)防。采用20%泰萬菌素 1.5 g/kg 料的劑量：添加半個月，其后3個月，每月10 d，繼續(xù)使用20%泰萬菌素0.8 g/kg料劑量添加進(jìn)行保健。保育豬用藥方案主要針對細(xì)菌感染，在斷奶后采用氟苯尼考和阿莫西林進(jìn)行保健，具體方案詳見表1。

1.9 生產(chǎn)成績統(tǒng)計對比分析

根據(jù)豬場的報表，以母豬和仔豬的生產(chǎn)成績?yōu)閰?shù)，分別統(tǒng)計了發(fā)病前3月（2020年9—11月，標(biāo)記為T0）、發(fā)病期間3月（2020年12月至2021年2月，標(biāo)記為T1），疫情轉(zhuǎn)歸后期（2021年3—5月，標(biāo)記為T2）3個時間段母豬的流產(chǎn)率，斷奶7 d內(nèi)配種率及仔豬的存活率，以此來評估實施的防控方案的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 母豬抗體檢測結(jié)果

50份母豬血樣，按試劑盒說明書進(jìn)行抗體檢測，由表2可知，PRRSV、CSFV、PCV2、PRVgE抗體陽性樣本分別為50、48、42、0份，陽性率分別為100.0%、96.0%、84.0%及0.0%。從抗體檢測結(jié)果可知，豬場原本PRRSV陰性母豬的PRRSV抗體全面轉(zhuǎn)陽。

2.2 病原檢測結(jié)果

由病原檢測結(jié)果（表3）可知，母豬血清、流產(chǎn)物、睪丸去勢液及保育豬組織樣本，PRRSV陽性數(shù)分別為18、4、5、6份，陽性率分別為90.0%、80.0%、100.0%及85.7%。除此之外，睪丸去勢液和保育豬組織分別檢測到1份和3份PCV2陽性樣本，陽性率分別為20.0%及42.9%。至于CSFV、PRV、PPV及SIV，所有樣本檢測結(jié)果均為陰性。

2.3 PRRSV陽性樣本ORF3、ORF5及測序比對結(jié)果

將本研究選擇的4株P(guān)RRSV陽性樣本毒株分別命名為JS05-1-1、JS05-1-2、JS05-1-3及JS05-1-4。將所得序列與各PRRSV參考毒株相關(guān)序列進(jìn)行比對分析，由表4可知，發(fā)現(xiàn)所得ORF3、 ORF5序列均與NADC30毒株的氨基酸序列同源性相對最高，所得Nsp2（高變區(qū)）序列相對經(jīng)典毒株不連續(xù)缺失393 bp，與NADC30毒株的缺失位置、長度一致。根據(jù)構(gòu)建的進(jìn)化樹得出所有的樣品序列均與NADC30毒株在同一進(jìn)化分支，由圖1可知，屬于類NADC30毒株。

2.4 細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗

7份肺臟樣本，共分離出5株分離株，經(jīng)16sRNA鑒定和比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中3株為副株嗜血桿菌，2株為鏈球菌。選擇1株鏈球菌和1株副豬嗜血桿菌分離菌，進(jìn)行MIC測定，由表5可知，豬鏈球菌對氟苯尼考（≤ 60 mg/L）和其中一種阿莫西林（≤ 60 mg/L）較為敏感，副豬嗜血桿菌對氟苯尼考（≤ 60 mg/L）、替米考星粉劑（≤ 60 mg/L）、阿莫西林較為敏感（≤ 60 mg/L），對延胡索酸泰妙菌素中等敏感（≤ 250 mg/L）。

2.5 控制方案實施前后生產(chǎn)成績對比分析

根據(jù)豬場的生產(chǎn)報表，選擇母豬流產(chǎn)率、斷奶 7 d 內(nèi)配種率、產(chǎn)房死亡率及保育死亡率這幾個參數(shù)，用于評估控制方案實施前后的效果。由統(tǒng)計結(jié)果（表6）可知，母豬的流產(chǎn)率從原來的1.3%上升至43.6%，轉(zhuǎn)歸后改善至3.6%；斷奶7 d內(nèi)配種率從原來的92.5%下降至63.3%，轉(zhuǎn)歸后改善至87.5%。仔豬方面，哺乳仔豬死亡率從原來的2.1%急速上升至28.4%，最后恢復(fù)到3.8%；保育豬的死亡率從原來的3.5%急速上升至38.8%，最后恢復(fù)至4.7%。

3 討論與結(jié)論

目前，養(yǎng)豬從業(yè)者將非洲豬瘟的生物安全防控措施放在首位，在此背景下，豬繁殖與呼吸綜合征潛入到很多豬場。因此，當(dāng)下乃至今后一段時期，防控非洲豬瘟同時，仍需重視豬繁殖與呼吸綜合征的防控工作。楊漢春認(rèn)為非洲豬瘟防控背景下，豬繁殖與呼吸綜合征在我國仍呈散發(fā)和地方性流行，豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性，類NADC-30毒株廣泛流行，感染豬群普遍生長不良和生產(chǎn)性能不佳［6］。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計，2013年以來，類NADC-30毒株在我國出現(xiàn)后，高致病性藍(lán)耳病檢出率有所降低，但NADC30-like新毒株檢出率增加，已在我國大部分省份流行。2016—2017年間，Guo等從52個臨床樣本中共分離到18株P(guān)RRSV，通過對ORF5和部分Nsp2基因的比較和系統(tǒng)發(fā)育分析 83.3%（15/18）的菌株屬于PRRSV NADC30-like毒株［7-8］。本病例就是一個PRRSV陰性豬場，突然感染PRRSV類 NADC 30毒株引起的母豬廣泛性流產(chǎn)，以及繼發(fā)仔豬細(xì)菌性的混合感染，造成了巨大的損失。

在診斷方面，本病例采集了睪丸去勢液進(jìn)行仔豬繁殖與呼吸綜合征的補(bǔ)充檢測，睪丸去勢液是指閹割2～5日齡新生仔公豬時收集的血清血滲出液［9］，該樣品易于在臨床條件下采集，并且可檢測更多的仔豬，改進(jìn)了PRRSV的監(jiān)測方法［10］。使用睪丸去勢液進(jìn)行PRRSV病原檢測的方法，自2017年首次報道后，就開始在養(yǎng)豬業(yè)內(nèi)廣泛應(yīng)用。采集豬群中新生仔豬的睪丸去勢液混樣進(jìn)行PRRSV的病原檢測，并用于評估豬群中豬繁殖與呼吸綜合征的動態(tài)，該可行性研究成為越來越多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)［11］。本研究中使用睪丸去勢液混樣進(jìn)行PRRSV病原檢測，同時對采集的血清進(jìn)行平行檢測比較，初步顯示去勢液混樣可以作為臨床樣品用于監(jiān)測PRRSV病原的豬群，且具有有效、實用、可靠和成本低的優(yōu)點(diǎn)。

豬繁殖與呼吸綜合征的防控仍需要以嚴(yán)格的生物安全措施為主，輔以定期的疫病監(jiān)測機(jī)制。而豬場生物安全的重點(diǎn)工作中，外部生物安全是豬群是否會感染的關(guān)鍵，內(nèi)部生物安全是豬繁殖與呼吸綜合征等傳染病發(fā)生時緊急處置是否能成功的關(guān)鍵，因此豬場內(nèi)部的豬流動、車輛流動、人員流動、物資進(jìn)出、飼料進(jìn)場、空氣傳播、媒介傳播、飲水監(jiān)測都應(yīng)有相應(yīng)的監(jiān)管制度［12］。

在抗生素選擇方案上，選擇泰萬菌素是因為其具有高效、廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，且具有劑量依賴性，能減少豬繁殖與呼吸綜合征病毒血癥或縮短病毒血癥周期，減少感染豬的死亡數(shù)量和減輕病豬的臨床癥狀［13-14］。豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌是規(guī)?；i場常見的2種細(xì)菌性疾病，由于這2種細(xì)菌耐藥性的廣泛存在，在治療時需要借助實驗室診斷更加科學(xué)準(zhǔn)確地使用藥物加以防控，對于豬繁殖與呼吸綜合征不穩(wěn)定場，其重點(diǎn)仍在于對豬繁殖與呼吸綜合征的控制［15］。定期對豬場進(jìn)行疫病檢測，了解豬群健康狀態(tài)，調(diào)整疫苗免疫程序和藥物保健程序。

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收稿日期：2023-01-17

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專項（編號：2019YFE0107300）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（編號：CX（22）1011）。

作者簡介：張 磊（1989—），男，山西長治人，博士研究生，助理研究員，主要從事動物傳染病防治研究，E-mail：zhangleisxcz@163.com；共同第一作者：華利忠（1982—），男，江蘇無錫人，博士，副研究員，主要從事動物傳染病防治研究，E-mail：steven828@126.com。

通信作者：邵國青，博士，研究員，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail：gqshaonj@163.com。