李文靜　任立瑞　方文生　靳茜　顏冬冬　李園　王秋霞　曹坳程

摘要：為明確乙蒜素和嘧菌酯對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）和刺盤孢屬（Colletotrichum spp.）4種病原真菌的毒力效果，同時擴大乙蒜素的防治譜，篩選新的殺菌劑組合物，為枯萎病和立枯病等植物病害的防治提供更多的選擇，在室內(nèi)離體條件下，使用菌絲生長速率法先測定了乙蒜素和嘧菌酯對4種病原真菌的作用效果，并得到相應的毒力回歸方程。結(jié)果表明，80%乙蒜素乳油對4種病原真菌的EC50分別為15.507、31.357、15.991、35.454 mg/L；250 g/L嘧菌酯懸浮劑對4種病原真菌的EC50分別為13.142、1 039.924、12.116、0.023 mg/L。隨后在室內(nèi)離體條件下采用 Colby法進一步評價乙蒜素和嘧菌酯對4種病原真菌的混用效果，結(jié)果表明，乙蒜素和嘧菌酯混合使用對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢和刺盤孢屬4種病原真菌表現(xiàn)出加成的作用效果。最后，對乙蒜素和嘧菌酯部分混配組合進行室內(nèi)離體葉片試驗，進一步驗證乙蒜素和嘧菌酯的混配效果，結(jié)果表明，與單獨使用乙蒜素或嘧菌酯相比，乙蒜素和嘧菌酯混合使用對病原菌的防治效果顯著增加。這一試驗結(jié)果表明乙蒜素和嘧菌酯復配能夠擴大殺菌劑的防治譜，同時也篩選出了新的殺菌劑組合，為多種病害的科學防治提供更為有效的藥劑使用參考。

關(guān)鍵詞：乙蒜素；嘧菌酯；病原菌；Colby法；復配；增效

中圖分類號：S481+.9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）21-0113-06

乙蒜素是一種有機硫類殺菌劑，是我國在1960年研制成功的一種植物源農(nóng)藥新品種。它具有高效、廣譜、無公害的特點，能抑制多種真菌和細菌的生長繁殖，而且它的成本和價格與其他殺菌劑相比較低。因此乙蒜素是一種極具市場潛力的殺菌劑，具有良好的發(fā)展前景。對乙蒜素的研究主要集中于病原菌的室內(nèi)毒力測定及田間防效［1-4］、乙蒜素與其他藥劑的復配效果和乙蒜素抑制菌株生長作用的機制等［5-10］。乙蒜素可有效抑制水稻、棉花、玉米、西瓜、黃瓜等多種作物上的病害，例如水稻稻瘟病、棉花立枯病、玉米大小斑病、西瓜蔓枯病、黃瓜苗期綿疫病等。

嘧菌酯是一種甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥，它能夠有效地抵御多種病害，包括白粉病、銹病、網(wǎng)斑病、霜霉病和稻瘟病等，其作用范圍極其廣泛，且抗病能力強［11］。

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）主要會引起植物的枯萎病，如黃瓜枯萎病、番茄枯萎病等；立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）容易引起作物的立枯病和根腐病，如番茄立枯病、棉花立枯病和黃瓜立枯病等；新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）會導致植物葉斑病和根腐病，如草莓葉斑病和根腐病等；刺盤孢屬（Colletotrichum spp.）會引起植物的炭疽病，如大白菜炭疽病等。

嘧菌酯對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢和刺盤孢屬4種病原菌的毒力均有相關(guān)報道［12-18］；乙蒜素對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和刺盤孢屬3種病原菌的毒力均有相關(guān)報道［19-21］，而對新擬盤多毛孢的毒力目前沒有相關(guān)報道。

抗藥性的產(chǎn)生會導致藥劑防效降低，因此不能長期使用某一藥劑防治這些病害。鑒于此，為擴大殺菌劑的防治譜、篩選殺菌劑新組合、更有效地防治多種病害，本研究在室內(nèi)離體條件下使用菌絲生長速率法測定乙蒜素和嘧菌酯及其復配劑對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢和刺盤孢屬4種病原菌的毒力；進一步采用Colby法評價乙蒜素和嘧菌酯對4種病原真菌的混用效果，并選擇其中較好的處理組合進行離體葉片試驗，目的是為了獲得新型、高效、低毒的藥劑組合，為病害的科學防治提供更多的藥劑使用參考，并為新的復配藥劑的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試藥劑見表1。

1.2 供試培養(yǎng)基及菌株

供試PDA培養(yǎng)基成分：馬鈴薯浸粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂 14.0 g，pH值為5.6 ± 0.2。以1 L蒸餾水為例，稱取39.0 g PDA培養(yǎng)基，攪拌加熱至完全溶解，分裝于100 mL錐形瓶中，121 °C高壓滅菌15 min，備用。

供試菌株：尖孢鐮刀菌采集自北京市昌平區(qū)金六環(huán)基地的黃瓜病株，病原菌的分離純化在實驗室中進行，并將其儲存在PDA斜面上于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，?jīng)鑒定，該病菌為尖孢鐮刀菌；立枯絲核菌采集自北京市順義區(qū)的番茄病株，分離純化方法同上，經(jīng)鑒定，該病菌為立枯絲核菌；新擬盤多毛孢采集自河北省保定市草莓種植基地（連續(xù)種植草莓20年以上）的草莓根腐病樣本，分離純化方法同上，經(jīng)鑒定為新擬盤多毛孢［22］；刺盤孢屬采集自湖南省百合病株，分離純化方法同上，經(jīng)鑒定，該病菌為刺盤孢屬。所有菌株均在筆者所在實驗室保存。

1.3 試驗時間及地點

試驗時間：2021年5—11月；所有試驗均在筆者所在實驗室完成。

1.4 試驗方法

1.4.1 乙蒜素和嘧菌酯對4種菌株的毒力測定 使用菌絲生長速率法測定4種病原真菌對乙蒜素和嘧菌酯的敏感性。如表2所示，每種藥劑設置5個濃度。本試驗均在無菌環(huán)境下進行：首先，配制一系列濃度梯度的含藥PDA平板；其次，從活化菌落的邊緣取1個直徑為5.0 mm的菌餅，菌絲面朝下，每皿接種1個菌餅，注意打孔器打在同一圓周上；再次，對照不加藥劑但加等量蒸餾水，其他操作均同上，每個處理重復3次；最后，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，4～7 d后測量菌落直徑，并計算各藥劑處理對菌絲生長的抑制率。

菌絲生長抑制率的計算公式如下：

抑制率=（對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑）/（對照菌落平均直徑-菌餅直徑）×100%。

1.4.2 Colby法評價藥劑混用效果 根據(jù)得到的乙蒜素和嘧菌酯的毒力回歸方程，2個藥劑各選取2個合適的濃度（本研究以理論EC50和EC70為例），共4個藥劑混配組合進行混配。操作方法同“1.4.1”節(jié)，計算不同濃度混配藥劑對4種菌株的存活率和理論存活率的影響。

存活率=[1-（處理菌落直徑平均值-菌餅直徑）/（對照菌落直徑平均值-菌餅直徑）]×100%；

E0＝X1·X2·…·Xn／100（n-1）。

其中：E0為混劑的理論存活率；n為混用殺菌劑的數(shù)量；Xn為施用第n種殺菌劑后菌株的存活率。E為混劑使用后實際存活率，當E0-E＜-5%時，表明存在拮抗作用；當-5%≤E0-E≤5%時，表明存在加成作用；當E0-E＞5%時，表明存在增效作用［23-24］。

1.4.3 離體葉片法評價藥劑混用效果 選擇Cobly法中乙蒜素與嘧菌酯復配得到的較好的處理組合，采用離體葉片法進一步驗證乙蒜素和嘧菌酯復配對立枯絲核菌的防治效果。于黃瓜葉片背面均勻噴灑配制好的藥液，待藥液自然風干后，將各處理葉片葉背向上，放置于培養(yǎng)皿中保濕，其中對照處理只含蒸餾水不含藥劑，每個處理8張葉片，重復3次。將直徑為5.0 mm的菌餅接種于葉片背面。接種完成后置于人工氣候箱，在28 ℃、相對濕度為65%的條件下培養(yǎng)7 d。

防效計算公式如下：

病情指數(shù)=0×A+1×B+3×C+5×D+7×E+9×F/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×9×100；

防治效果=1-處理組平均病情指數(shù)/對照組平均病情指數(shù)×100%。

其中，A、B、C、D、E、F分別代表各級葉片數(shù)，詳見表3。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS、Excel和DPS軟件處理試驗數(shù)據(jù)，得到各藥劑對供試菌株的EC50、毒力回歸方程的斜率、卡方值和P值。使用單因素方差分析，對離體葉片的病情指數(shù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種病原菌菌株對單劑藥劑的室內(nèi)毒力

乙蒜素對4種菌株的室內(nèi)毒力試驗結(jié)果（表4）表明，80%乙蒜素乳油對尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、新擬盤多毛孢、刺盤孢屬4種菌株的EC50分別為15.507、31.357、15.991、35.454 mg/L，其中對尖孢鐮刀菌和新擬盤多毛孢的EC50較小，表明80%乙蒜素乳油對它們的抑制效果較好；250 g/L嘧菌酯懸浮劑對4種菌株的EC50分別為13.142、1 039.924、12.116、0.023 mg/L，其中250 g/L嘧菌酯懸浮劑對刺盤孢屬的抑制效果較好，相比于其他菌株，對立枯絲核菌的EC50最大，說明250 g/L嘧菌酯懸浮劑對立枯絲核菌的抑制效果最差。

2.2 Colby法對乙蒜素和嘧菌酯混用效果的評價

2.2.1 乙蒜素和嘧菌酯混用對尖孢鐮刀菌的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對尖孢鐮刀菌的抑制率為30%～50%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對尖孢鐮刀菌的抑制率為40%～50%，各濃度組合對尖孢鐮刀菌的抑制率在60%～75%之間。Colby法檢驗結(jié)果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對尖孢鐮刀菌的聯(lián)合作用類型屬于加成作用（圖1-a）。

2.2.2 乙蒜素和嘧菌酯混用對立枯絲核菌的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對立枯絲核菌的抑制率為35%～100%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對立枯絲核菌的抑制率為36%～60%，各濃度組合對立枯絲核菌的抑制率在57%～100%之間。Colby法檢驗結(jié)果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對立枯絲核菌的聯(lián)合作用類型屬于加成作用（圖1-b）。

2.2.3 乙蒜素和嘧菌酯混用對新擬盤多毛孢的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對新擬盤多毛孢的抑制率為52%～68%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對新擬盤多毛孢的抑制率為45%～56%，各濃度組合對新擬盤多毛孢的抑制率在76%～98%之間。Colby法檢驗結(jié)果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對新擬盤多毛孢的聯(lián)合作用類型屬于加成作用；其中乙蒜素濃度為40 mg/L，嘧菌酯濃度為 12.5 mg/L 時混用，對新擬盤多毛孢的抑菌效果增效明顯（圖1-c）。

2.2.4 乙蒜素和嘧菌酯混用對刺盤孢屬的抑制效果 在處理劑量下80%乙蒜素乳油對刺盤孢屬的抑制率為77%～84%，250 g/L嘧菌酯懸浮劑對刺盤孢屬的抑制率為46%～80%，各濃度組合對刺盤孢屬的抑制率在94%～99%之間。Colby法檢驗結(jié)果表明，當乙蒜素和嘧菌酯混用時，對刺盤孢屬的聯(lián)合作用類型屬于加成作用；其中乙蒜素濃度為 32 mg/L，嘧菌酯濃度為0.04 mg/L時混用，對刺盤孢屬的抑菌效果增效明顯（圖1-d）。

2.3 離體葉片法對乙蒜素和嘧菌酯混用效果評價

2.3.1 對尖孢鐮刀菌的活性 對乙蒜素與嘧菌酯復配中得到的增效效果較好的組合進行黃瓜葉片離體試驗，評價乙蒜素與嘧菌酯復配對尖孢鐮刀菌的防治效果。試驗結(jié)果（表5，圖2-a）表明，乙蒜素與嘧菌酯復配后防治效果顯著增加。單獨使用濃度為5 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為37.18%，單獨使用濃度為16 mg/L的乙蒜素時，防治效果為33.33%，但兩者混配使用時，防治效果可達57.69%；單獨使用濃度為5 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為37.18%，單獨使用濃度為40 mg/L的乙蒜素時，防治效果為53.85%，但兩者混配使用時，防治效果可達78.21%，這表明乙蒜素與嘧菌酯復配后對尖孢鐮刀菌的離體防控效果顯著增加。

2.3.2 對立枯絲核菌的活性 對乙蒜素與嘧菌酯復配中得到的增效效果較好的組合進行黃瓜葉片離體試驗，評價乙蒜素與嘧菌酯復配對立枯絲核菌的防治效果。試驗結(jié)果（表5，圖2-b）表明，乙蒜素與嘧菌酯復配后防治效果顯著增加。單獨使用濃度為100 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為17.50%，單獨使用濃度為32.00 mg/L的乙蒜素時，防治效果為21.25%，但兩者混配使用時，防治效果可達60.00%；單獨使用濃度為100 mg/L的嘧菌酯時，防治效果為17.50%，單獨使用濃度為 53.33 mg/L 的乙蒜素時，防治效果為72.50%，但兩者混配使用時，防治效果可達83.75%，這表明乙蒜素與嘧菌酯復配后對立枯絲核菌的離體防控效果顯著增加，這與室內(nèi)試驗結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

在實際生產(chǎn)中，為避免長期使用單一藥劑產(chǎn)生抗藥性，常常將多種藥劑混用來延緩抗藥性并提高防效［25］。研究表明，藥劑混配具有一定的增效作用，同時可以降低藥劑使用量和使用次數(shù)，從而降低藥劑使用成本［26-27］。嘧菌酯是一種高效、廣譜的殺菌劑，乙蒜素也具有高效、廣譜、無公害的特點，兩者作用機制不同，且無交互抗性。嘧菌酯可以與多種藥劑進行復配，但目前乙蒜素與嘧菌酯復配僅在防治番茄黃葉枯萎病方面有過報道，可參考性不足［28］。

本研究測定了乙蒜素和嘧菌酯及其復配劑對4種病原真菌的室內(nèi)毒力。單一藥劑試驗結(jié)果表明，80%乙蒜素乳油對尖孢鐮刀菌和新擬盤多毛孢的抑制效果較好，其EC50分別為15.507、15.991 mg/L；250 g/L嘧菌酯懸浮劑對刺盤孢屬的抑制作用極好，其EC50為0.023 mg/L，嘧菌酯在用量極低的情況下對刺盤孢屬就可以達到極好的效果。與單劑相比，乙蒜素和嘧菌酯復配使用對4種病原真菌的抑制作用均有一定程度的增加，復配藥劑的效果顯然更好。離體葉片試驗結(jié)果表明，與單一藥劑相比，乙蒜素與嘧菌酯的混合使用顯著提高了對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的防治效果。

本試驗進行了乙蒜素與嘧菌酯單劑及其復配劑對4種病原真菌的室內(nèi)毒力測定，二者對4種病原真菌均具有良好的抑制作用，且復配劑的抑菌效果優(yōu)于單劑。這一試驗結(jié)果表明乙蒜素與嘧菌酯復配能夠擴大殺菌劑的防治譜，同時也篩選出了新的殺菌劑組合，為多種病害的科學防治提供了更為有效的藥劑參考，并為開發(fā)防治相關(guān)病害復配藥劑提供了重要的理論依據(jù)和科學支撐。但本試驗為室內(nèi)離體試驗結(jié)果，田間使用效果尚不明確，有待于進一步深入研究。

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收稿日期：2023-02-04

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團隊項目（編號：BAIC01-2022）；河北省土傳病害綠色防控技術(shù)創(chuàng)新中心項目（編號：2021K04）。

作者簡介：李文靜（1999—），女，河南濮陽人，碩士研究生，主要從事殺菌劑和土壤熏蒸劑乙蒜素的應用相關(guān)研究。E-mail：wjlxhzyl@163.com。

通信作者：曹坳程，博士，研究員，主要從事土壤消毒使用技術(shù)和外來入侵植物防控研究。E-mail：caoac@vip.sina.com。