李健　李曦　農(nóng)艷豐

摘要：堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育及抵抗非生物脅迫過程中具有重要作用。本研究通過RACE技術(shù)，獲得了全長1 317 bp的芒果bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因（MibZIP46）。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，MibZIP46與同樣是漆樹科的阿月渾子的bZIP親緣關(guān)系最為接近，同源性最高，與甜橙的同源性次之。構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒pCZN 1-MibZIP46，經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白以包涵體的形式表達，經(jīng)鎳柱純化，獲得高純度（90%）的目的蛋白并成功進行Western blotting鑒定；MibZIP46蛋白的亞細胞定位分析結(jié)果表明，融合的目的蛋白在煙草葉片細胞中定位于細胞核；實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl、15% PEG和0.1 mmol/L ABA脅迫處理，均能不同程度誘導(dǎo)MibZIP46的表達。本研究為進一步挖掘利用芒果的抗逆相關(guān)基因提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芒果；堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；基因表達；脅迫處理

中圖分類號：S667.701文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）21-0029-07

轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對各種環(huán)境脅迫下的調(diào)節(jié)和生物過程中起著至關(guān)重要的作用，是決定脅迫條件下植物能否存活和產(chǎn)量高低的關(guān)鍵因素［1］。堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族成員是真核生物中最多樣和最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，是一類獨特的轉(zhuǎn)錄因子，具有bZIP結(jié)構(gòu)域和2個結(jié)構(gòu)特征：亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和堿性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域［2］。bZIP蛋白在植物界中廣泛存在，參與種子萌發(fā)、花朵發(fā)育、植物衰老、非生物脅迫反應(yīng)和脫落酸（ABA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程［3］。擬南芥及其他植物的bZIP 類轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員大致分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S類共10個亞家族，bZIP46基因?qū)儆赟亞族，主要是參與逆境脅迫和糖類信號代謝，但目前有關(guān)bZIP46 基因的具體功能還鮮有報道。目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一些植物的bZIP基因能夠增強其植株對非生物脅迫的耐受性，在擬南芥中，AtbZIP24和AtbZIP1是植物對非生物脅迫耐受性的正調(diào)節(jié)因子［4-5］；在水稻中，OsbZIP23和OsbZIP72增加了對非生物脅迫的耐受性［6-7］。GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性和抗凍性［8］；GmbZIP1增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽、低溫和干旱的耐受性，并提高了轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱性［9］；ZmbZIP72賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽和干旱耐受性和ZmABP9增強了轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性和耐旱性［10-11］。

干旱脅迫響應(yīng)基因一般被劃分成ABA依賴型基因和非ABA依賴型基因［12］。ABA依賴型基因先與ABRE、MYB、NAC和MYC等順式作用元件結(jié)合，然后通過啟動含有此類元件下游基因的表達來提高植物的抗旱性。ABA可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)大量重排基因的表達，例如擬南芥有超過10％的基因可以響應(yīng)ABA，數(shù)量遠遠超過生長素和赤霉素等其他激素。響應(yīng)ABA的這些基因在增強植物的抗旱能力上起著關(guān)鍵的作用，一些植物的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因已被證實是ABA依賴型基因，這類基因?qū)BA較為敏感，通過調(diào)控其表達量來參與ABA信號途徑［13］。

芒果（Mangifera indica L.）原產(chǎn)于熱帶，是深受大眾喜愛的一種水果，我國是僅次于印度的世界第二大芒果生產(chǎn)國。廣西是我國最大的芒果生產(chǎn)基地，芒果產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為廣西的重要農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，種植芒果是許多當(dāng)?shù)剞r(nóng)民主要的收入來源。芒果雖然相對于廣西種植的其他果樹來說其抗旱性較強，但由于廣西處于石山地區(qū)，大部分芒果種植于缺乏灌溉條件且地勢較陡的山地和旱坡地上，整個生育期所需的水分只能依靠自然降水來供應(yīng)。芒果在不同生育階段都有可能受到干旱的影響，干旱常常威脅著芒果的正常生長及發(fā)育，嚴(yán)重制約了芒果產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。芒果抗旱基因的挖掘，對于實現(xiàn)芒果抗旱分子育種這一目標(biāo)具有重要的參考意義。

本研究以臺農(nóng)1號芒果為材料，通過cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)獲得了1個芒果的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因（MibZIP46），對基因序列進行生物信息學(xué)分析，在大腸桿菌中進行原核表達并純化了表達的蛋白，進行了免疫印跡，同時采用實時熒光定量PCR分析其在不同脅迫處理（15% PEG、0.1 mmol/L ABA、200 mmol/L NaCl）下的表達模式，以期為深入研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料采自百色學(xué)院實驗基地種植的臺農(nóng)1號芒果品種，采集其頂端嫩葉后用干凈的濕布清洗表面雜質(zhì)，置于冰盒中并迅速轉(zhuǎn)移至實驗室，用蒸餾水沖洗干凈，吸干水分后立即提取總RNA。

1.2 試驗時間及地點

試驗于2021年5月至2022年1月在百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院試驗地及實驗室進行。

1.3 總RNA提取和cDNA的合成

將芒果葉片樣品用液氮研磨后，采用Trizol法提取總RNA，并使用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 引物設(shè)計和PCR擴增

根據(jù)NCBI上其他植物的bZIP基因序列，BLAST同源基因，比對分析后確定同源保守區(qū)間，嘗試設(shè)計多對簡并引物（表1）。

以cDNA為模板，使用Phanta Maxfidelity DNA Polymerase（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行擴增。PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，45～55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，39個循環(huán)；72 ℃5 min。并對擴增出的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測獲得單一明亮條帶，切膠回收后以F端引物測序。根據(jù)確認的基因序列，分別設(shè)計目的基因的5′RACE和3′ RACE巢式PCR引物（表2）。

采用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的3′ Full Race Core Set with PrimeScript RTase進行3′ RACE，SMARTer RACE 5′/3′ Kit進行5′ RACE。將5′ RACE、3′ RACE序列及已驗證的核心序列進行拼接，獲得MibZIP46基因的全長。根據(jù)RACE獲得的預(yù)測基因序列，設(shè)計全長擴增引物：MibZIP46-F為ATGGGATCTTACATGAACTTC、MibZIP46-R為TTACCAAGGACCTGTCAGTG。將擴增出來的PCR產(chǎn)物切膠回收，將該產(chǎn)物加A尾后連接T載體（pMD19-T），轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR檢測陽性克隆，并測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

獲得的MibZIP46基因經(jīng)測序獲得序列后進行相關(guān)分析。其中MibZIP46推導(dǎo)的氨基酸序列的基本理化性質(zhì)用ExPASy（http：//expasy.org/tools/）在線工具進行分析；用HMM（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）分析其跨膜結(jié)構(gòu)；用Protscale工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的疏水性；在NCBI上進行蛋白序列比對，以及用Motif Scan和SMART軟件分析MibZIP46蛋白的主要功能域；MibZIP46與其他植物的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因的系統(tǒng)進化樹則用MEGA 6軟件來構(gòu)建。

1.6 MibZIP46蛋白的原核表達、純化及免疫印跡鑒定

以pCZN1為原核表達載體，提取重組菌株 PMD-MibZIP46 和pCZN1的質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后將MibZIP46和載體片段連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（DE3）細胞中，重組菌株在液體LB培養(yǎng)基中用 0.2 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于15 ℃誘導(dǎo)過夜。經(jīng)超聲波處理器VCX750（美國Sonics & Materials公司）處理（脈沖5 s，暫停5 s，20 min）裂解，然后離心細胞裂解物以沉淀細胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的微量離心管中，用鎳柱進一步純化，然后收集洗滌分級并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。用于進行免疫印跡（Western blotting）的一抗為His單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠抗體（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），稀釋倍數(shù)為2 000倍。將膜置于Fluor Chem HD2 （protein simple）中曝光1～10 min，通過電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯影。

1.7 MibZIP46蛋白的亞細胞定位

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時表達體系，以pSuper1300-GFP為載體，在煙草葉片上進行MibZIP46蛋白的亞細胞定位分析［14］。將目的基因序列連接到pSuper1300-GFP載體上，得到重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，鑒定合格后的農(nóng)桿菌經(jīng)擴大培養(yǎng)合格后侵染煙草，侵染后的煙草于培養(yǎng)室（28 ℃）培養(yǎng)2～3 d后，用激光共聚焦顯微鏡觀察共表達部位。

1.8 不同脅迫處理下MibZIP46基因的表達分析

以不同脅迫處理（15% PEG、0.1 mmol/L ABA、200 mmol/L NaCl）的芒果頂部完全葉的cDNA為模板，處理方法參照文獻［15］。以芒果MiActin1為內(nèi)參基因，設(shè)計熒光定量引物，上游引物序列：5′-TCCTTATGTGATTGGCCGGG-3′，下游引物序列：5′-TGCCTCCTACCTCCGTAGTG-3′，進行熒光定量PCR試驗［16］。所用儀器為LightCycler 480 System（Roche Diagnostics）熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系為cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，滅菌蒸餾水補足至總體積為20 μL，各樣品均重復(fù)3次。參照Niu 等的方法進行熒光定量PCR反應(yīng)及計算［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆

首先對基因的保守片段進行克隆，測序結(jié)果經(jīng)與其他植物的bZIP基因序列比對，確認為目的基因的序列。隨后將3′ RACE第2輪擴增獲得的單一條帶切膠回收，并測序（測序引物為MibZIP46-3GSP2），5′ RACE結(jié)果也獲得了單一明亮條帶后，將5′ RACE、3′ RACE序列及已驗證的核心序列進行拼接，獲得預(yù)測MibZIP46基因的全長參考序列（共1 317 bp），再次以cDNA為模板，用上述引物對進行同樣的PCR擴增，獲得大小相符的單一特異性條帶（圖1）。

將PCR產(chǎn)物切膠回收，將該產(chǎn)物加A尾后連接T載體（pMD19-T），轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并將陽性克隆進行PCR檢測（圖2）。將3個陽性克隆送去測序（測序引物為通用引物M13-47和M13-48）。測序結(jié)果經(jīng)比對有1個克隆與預(yù)測的基因序列相符。

2.2 基因的生物信息學(xué)分析

克隆獲得的MibZIP46基因全長為1 317 bp，為完整的開放閱讀框，共編碼438個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為47.32 ku，等電點為9.69，屬于堿性蛋白；Protscale工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的疏水性最大值為1.578，最小值為-2.767，無明顯疏水區(qū)（圖3）。用HMM（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）進一步分析顯示其不含跨膜結(jié)構(gòu)（圖4）。用WoLF PSORT亞細胞定位預(yù)測顯示MibZIP46蛋白定位于細胞核的概率較大。用SOSMI signal在線軟件分析得出MibZIP46蛋白不含信號肽；SOPMA預(yù)測的MibZIP46二級結(jié)構(gòu)中，該蛋白含有134個α-螺旋、8個β-轉(zhuǎn)角、248個無規(guī)則卷曲和48個延伸鏈，分別占30.59%、1.83%、56.62%和10.96%。

在NCBI上使用CD-Search工具來鑒定該基因序列的保守結(jié)構(gòu)域表明，該基因包括coiled coil結(jié)構(gòu)域，DNA結(jié)合位點，多肽結(jié)合位點以及bZIP超家族的特異位點。

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

用MEGA 6軟件構(gòu)建的MibZIP46基因與其他的bZIP核苷酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析（圖5），發(fā)現(xiàn)MibZIP46與同樣是漆樹科的阿月渾子的bZIP親緣關(guān)系最為接近，同源性最高，與甜橙的同源性次之，是bZIP基因家族成員；與巨桉、桃金娘、酸棗等禾木本植物的bZIP也有很近的親緣關(guān)系；與鷹嘴豆、四季豆、油菜、白樺、擬南芥等植物的親緣關(guān)系則相對較遠。

2.4 MibZIP46蛋白的原核表達、純化及Western blotting鑒定

2.4.1 原核表達載體的構(gòu)建 以“1.3”節(jié)中的cDNA為模板，在上下游引物分別添加NdeⅠ和XbaⅠ位點進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)測序確定序列正確后進行膠回收純化，目的片段與pCZN 1質(zhì)粒用NdeⅠ和XbaⅠ分別進行雙酶切，經(jīng)膠回收純化后再用DNA連接試劑盒進行連接，獲得重組質(zhì)粒，命名為pCZN 1-MibZIP46。將pCZN 1-MibZIP46經(jīng)NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切驗證，從結(jié)果（圖6）可以看出酶切后所得的2條條帶符合預(yù)期的條帶，表明原核表達載體構(gòu)建成功。

2.4.2 蛋白表達、純化與Western blotting鑒定 SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白以包涵體的形式表達（圖7）。原核表達的MibZIP46蛋白經(jīng)超聲波破碎后用鎳柱進行純化，純度明顯提高，最后用PEG 20000對蛋白進行包埋濃縮處理，獲得濃度較高的蛋白，且純度超過90%（圖8）。純化的目的蛋白也成功進行Western blotting鑒定，蛋白分子量與理論分子量一致（圖9），表明已得到符合要求的蛋白。

2.4.3 MibZIP46的亞細胞定位分析 構(gòu)建的融合表達載體和空載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，注射煙草下表皮，培養(yǎng)2～3 d后，即可制成玻片在激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號的分布。結(jié)果顯示：融合的MibZIP46蛋白在煙草葉片細胞核中觀察到綠色熒光（圖10），表明MibZIP46定位于細胞核。

2.4.4 不同處理下MibZIP46基因的表達分析 實時熒光定量分析結(jié)果表明，在200 mmol/L NaCl處理下，芒果葉片中MibZIP46在12 h時表達量已經(jīng)急劇增加，達到對照的5.6倍，到24 h時達到最高，為對照的12.25倍，隨后隨著脅迫時間的延長又比峰值顯著降低，但也仍是對照的2～3倍（圖11-a）。在15% PEG脅迫下，MibZIP46的表達水平隨著脅迫時間的延長逐漸增加，在48 h時達到峰值，達到對照的12.36倍，在72 h也依舊維持在較高水平（圖11-b）。而對于0.1 mmol/L ABA的脅迫處理，則是在12 h時MibZIP46的相對表達量已經(jīng)達到頂峰，為對照的21.02倍，隨后逐漸下降，但也仍維持在高于對照5倍以上的水平（圖11-c）。

3 討論與結(jié)論

干旱缺水是很多國家和地區(qū)作物生產(chǎn)面臨的重大問題，是制約全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的重要因素，解決干旱缺水對作物造成危害，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)是保障國家農(nóng)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的需要，其中最有效、最經(jīng)濟的途徑是培育抗旱性強的作物品種，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用分子育種協(xié)助傳統(tǒng)的雜交育種可加速育種的進程縮短育種年限，但是想要取得重大突破仍具有許多難點。為了應(yīng)對干旱等環(huán)境脅迫，植物通過感應(yīng)并整合錯綜復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)來協(xié)調(diào)其體內(nèi)脅迫應(yīng)答基因的表達，形成了應(yīng)對干旱等環(huán)境脅迫的形態(tài)生理和生物化學(xué)的一系列策略［18］。植物適應(yīng)干旱等逆境脅迫時，其機制非常復(fù)雜，通常是多基因共同控制的。隨著研究技術(shù)的進步，特別是高通量測序技術(shù)的發(fā)展，許多干旱脅迫誘導(dǎo)型基因已在各植物物種中被成功鑒定出，也使得通過遺傳和分子操作來提高作物抗逆性的目的變得更容易實現(xiàn)［19］。

轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達的調(diào)節(jié)因子，是提高作物抗逆性和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因在很多植物上已經(jīng)被證實能夠提高其對干旱、寒冷、高鹽等環(huán)境的耐受能力。bZIP基因家族已經(jīng)在擬南芥、水稻、大豆、高粱等植物基因組中被全面鑒定或預(yù)測［20-23］。bZIP基因是一個較為龐大的基因家族，經(jīng)過長期的進化過程，它們在功能上具有多樣性，但它們推定的蛋白質(zhì)依然共享許多保守的基序［24］。本研究克隆的芒果MibZIP46基因，含有植物bZIP基因家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，并且與同為漆樹科的阿月渾子的bZIP基因同源性最高，顯示了其在進化過程中具有高度的保守性。

相對于原核表達中使用最為廣泛的pET系表達載體，pCzn1質(zhì)粒是具有低溫誘導(dǎo)特色的原核表達載體，攜帶冷激蛋白cspA基因啟動子，能夠在11 ℃低溫誘導(dǎo)，促進蛋白溶解，增加可溶性蛋白表達概率。雖然本研究將誘導(dǎo)的溫度降到了15 ℃，目的蛋白依舊以難溶的包涵體形式表達，使蛋白的純化變得困難［25］。由于蛋白質(zhì)沉積和清除之間的不平衡，細菌包涵體的形成是常見的［26］。IPTG的濃度、培養(yǎng)和誘導(dǎo)的溫度及時間都可能影響重組蛋白的表達模式，而且在很多情況下，篩選和優(yōu)化這些條件仍然不能消除包涵體的形成［27］。盡管本研究也努力優(yōu)化了其表達條件，但重組蛋白仍以包涵體的形式積累，經(jīng)過一系列的純化步驟，也獲得了純度較高的目的蛋白。pCzn1質(zhì)粒帶有His 標(biāo)簽，His-Tag 分子量較小，對蛋白結(jié)構(gòu)幾乎無影響，Western blotting分析結(jié)果也表明目的蛋白能夠特異識別His抗體，可被有效檢測。

以往的研究中，不少蛋白往往定位在不同的亞細胞結(jié)構(gòu)里，此類蛋白可能在不同細胞器間存在穿梭過程，MibZIP46蛋白的亞細胞定位顯示其定位于細胞核，這與在其他植物上的研究一致，表明該蛋白主要在細胞核里發(fā)揮穩(wěn)定的生物學(xué)功能［28-29］。當(dāng)然，本研究的亞細胞定位分析是在煙草細胞內(nèi)進行的，芒果細胞里不同蛋白間的特異性相互作用有可能影響到其定位模式，但就目前來講，多數(shù)的研究表明其主要定位于細胞核。

植物的許多抗逆相關(guān)基因可以被干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫所誘導(dǎo)。有研究表明，在干旱和高鹽脅迫下，這類基因的表達顯著上調(diào)［30］。本研究中MibZIP46在15% PEG處理模擬干旱及 200 mmol/L 高鹽脅迫下，均能顯著誘導(dǎo)其表達，但其出現(xiàn)峰值的時間有差異，且隨脅迫時間的延長，其表達趨勢不一，在高鹽脅迫下，其表達水平在短期內(nèi)已急劇增加，24 h時已經(jīng)達到頂峰，而15% PEG模擬干旱脅迫下則是脅迫后期才表現(xiàn)出較高的表達量，說明MibZIP46對高鹽的反應(yīng)較為敏感，應(yīng)對干旱脅迫時其調(diào)控周期相對較長，可能也是觸發(fā)的反饋機制有差異導(dǎo)致的。本研究中，外源ABA可強烈誘導(dǎo)MibZIP46的表達，且在短期（12 h）內(nèi)其表達量已經(jīng)達到頂峰，在其他時間段也依舊保持了較高的表達水平，表明MibZIP46可能受ABA依賴性應(yīng)激信號途徑控制，是ABA依賴型基因。

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收稿日期：2023-03-15

基金項目：廣西自然科學(xué)基金（編號：2018GXNSFBA050026）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（編號：2019KY0743、2020KY19025）。

作者簡介：李 ?。?986—），男，廣西百色人，博士，研究方向為植物抗逆生理與分子生物學(xué)。E-mail：337375159@qq.com。

通信作者：農(nóng)艷豐，碩士，高級實驗師，研究方向為植物生物技術(shù)。E-mail：1477078570@qq.com。