鄧文楷　彭艷　楊成　李婷婷　潘貴英

摘要：植物MYB家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物脅迫反應中起著重要作用。基于全基因組分析，對建蘭（Cymbidium ensifolium）MYB家族成員進行鑒定和生物信息學分析，并分析相關(guān)基因在不同鹽脅迫類型下的表達情況。結(jié)果表明，從建蘭基因組中共鑒定出136個CeMYB轉(zhuǎn)錄因子，包括27個1R-MYB、102個R2R3-MYB、5個3R-MYB和2個4R-MYB。通過與擬南芥MYB進行系統(tǒng)發(fā)育得到20個基因簇，表明這些CeMYB可能具有多種生物學功能。亞細胞定位、染色體定位及保守域顯示，136個CeMYB分布在18條染色體上，大多數(shù)CeMYB位于細胞核中，且具有典型的氨基酸序列重復；基序預測分析表明，多個保守元件主要位于CeMYB的N端，表明它們的功能相對保守。轉(zhuǎn)錄組表達分析表明，S13亞家族的CeMYB61和CeMYB89可能是調(diào)控鹽脅迫的關(guān)鍵基因，qRT-PCR驗證進一步表明，CeMYB61、CeMYB89在不同組織中表現(xiàn)為根系>假鱗莖>葉片>花序，其表達水平、模式與植株Na+濃度分布一致，證實CeMYB61、CeMYB89是建蘭耐受鹽脅迫的指示基因。研究為進一步探索MYB基因的潛在機制及鹽脅迫下候選基因的挖掘提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：建蘭；MYB轉(zhuǎn)錄因子；鹽脅迫；基因組；qRT-PCR

中圖分類號：S682.310.1文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）21-0019-10

建蘭（Cymbidium ensifolium）是中國栽培歷史悠久的傳統(tǒng)蘭花種類之一，因其香氣馥郁、花姿優(yōu)美等優(yōu)點具有較高的觀賞價值，深受消費者喜愛［1］。水分、溫度等環(huán)境皆會影響建蘭的生長發(fā)育及體態(tài)建成［2］，且近期研究表明，由于野外氮沉降或室內(nèi)施肥方式導致的鹽脅迫已成為影響蘭花生長與栽培的重要非生物因素［3］。在綠色植物中，鹽對植物體的影響可貫穿植物生長史的各個發(fā)育時期，研究表明鹽脅迫可對葉綠體光化學反應產(chǎn)生不利影響［4］，導致氣孔關(guān)閉、胞間CO2濃度增加，此外可導致離子穩(wěn)態(tài)失衡、激素代謝紊亂及DNA突變等［5］。在非生物脅迫反應中發(fā)掘候選基因和剖析信號機制，是應對植物非生物脅迫的關(guān)鍵策略。

MYB家族是數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛分布于高等植物的基因組中；MYB家族的共同特征是具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在其N末端由1～4個不完整的重復序列構(gòu)成［6］。這些重復序列包含3個保守的色氨酸殘基并編碼3個α-螺旋和1個與DNA結(jié)合的螺旋-轉(zhuǎn)角折疊結(jié)構(gòu)［7］。而C末端區(qū)域是一個高度不一致的激活域，從而廣泛調(diào)控MYB的功能表達［8］。根據(jù)MYB不完全串聯(lián)重復序列（R）的數(shù)量和位置，可將MYB家族成員分為4個亞家族，即1R-MYB蛋白（含有1個R結(jié)構(gòu)域）、R2R3-MYB蛋白（含有2個R結(jié)構(gòu)域）、R3-MYB 蛋白（包含3個R結(jié)構(gòu)域）和4R-MYB蛋白（包含4個R1和/或R2結(jié)構(gòu)域）［9］。一般來說，具有2個重復序列的MYB成員是高等植物中的主要形式（即R2R3-MYB），同一植物的不同基因型間R2R3-MYB成員的基因拷貝數(shù)可能存在5倍差異［10］。

自植物MYB基因被表征以來，已經(jīng)在許多植物物種中發(fā)現(xiàn)了MYB家族成員，如煙草（Nicotiana tabacum）［11］、玉米（Zea mays）［12］、三七（Panax notoginseng）［7］和蘋果（Malus pumila）樹［13］。且研究證實，MYB蛋白在生理代謝、細胞分化、激素合成及信號轉(zhuǎn)導等生理功能中發(fā)揮著重要作用［14］。此外，MYB蛋白在調(diào)節(jié)植物的非生物脅迫反應中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［15］。多項研究表明，靶向MYB基因的過表達可增強植物的非生物脅迫耐受性，包括擬南芥中的AtMYB20［16］、白樺樹中的BpIMYB46［17］及水稻中的OsMYB6［18］。盡管已經(jīng)在非生物脅迫條件下的模式和非模式植物中鑒定出許多MYB基因并對其進行功能分析，但關(guān)于建蘭的MYB基因家族成員信息及其功能尚不清楚?；诖?，本研究采用全基因組分析建蘭的MYB系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)、基序組成和重復序列，并采用qRT-PCR分析目標建蘭MYB基因?qū)Σ煌}脅迫類型的表達水平。研究結(jié)果有助于對蘭花耐鹽機制及MYB基因在蘭科中的功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)方法

試驗于2020年6—10月在貴州民族大學園藝組培室中進行。建蘭品種為逸紅雙嬌，為2年生組培苗。供試鹽脅迫分別為氯化鈉（NaCl）、硫酸鈉（Na2SO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、碳酸鈉（Na2CO3），均購自默克化學試劑有限公司。

將2年生的建蘭植株采用MS培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)5周后，按照上述鹽脅迫類型進行相應處理（150 mmol/L），對照（CK）為加入無菌水，之后轉(zhuǎn)移至4 ℃環(huán)境，于鹽脅迫處理后24 h取樣，采用液氮速凍用于植株RNA提取。

1.2 建蘭MYB基因家族的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1 建蘭MYB基因的鑒定 從Pfam下載建蘭（C.ensifolium）的MYB DAN-binding結(jié)構(gòu)域信息（PF002499，http：//pfam.sanger.ac.uk/），將其結(jié)構(gòu)域信息保存為隱藏馬爾可夫格式（HMM），并使用hmmer 3.0進行檢索。從擬南芥信息資源庫（https：//www.Arabidopsis.org/）下載擬南芥MYB蛋白序列對建蘭的MYB基因組數(shù)據(jù)庫進行Blast對比，參數(shù)設(shè)置值<10-20構(gòu)建fasta文件（CeMYB.fasta）。隨后采用NCBI的conserved Domains Tool工具對CeMYB.fasta進行篩選，以去除CeMYB結(jié)構(gòu)域缺失或不正確的序列；按照Christian等所述的分類方法［19］對MYB進行分類，以得到CeMYB基因家族信息。

1.2.2 建蘭MYB基因的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 對獲得的CeMYB基因家族信息庫分別進行分類分析，采用ExPASy系統(tǒng)（http：//web.expasy.org/compute_pi/）和WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）用于預測CeMYB蛋白的分子量、等電點及亞細胞位置等［20］。采用Clustal W生成多序列比對，通過在線工具WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）確定MYB蛋白的DNA-binding結(jié)構(gòu)域特征。

通過MUSCLE軟件對建蘭和擬南芥的MYB蛋白的全長蛋白質(zhì)序列進行對比，將擬南芥的MYB和建蘭MYB的比對蛋白序列提交到IQ-TREE v1.6.12系統(tǒng)采用鄰接法構(gòu)建MYBs的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 建蘭CeMYB基因結(jié)構(gòu)和保守motif分析 基于基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng)站分析該家族成員的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，采用MEME（http：//memesuite.org/tools/meme）設(shè)定基序（motif）數(shù)為2［21］，而其他參數(shù)保持默認，利用PSORTP rediction（https：//prosite.expasy.org/）進行亞細胞定位預測，結(jié)果采用TBtools軟件進行可視化［22］。

1.2.4 建蘭CeMYB基因啟動子序列分析、染色體定位和同線性分析 通過PlantCARE預測順式作用元件（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）基于CeMYB的啟動子序列（起始密碼子上游1 500 kb序列）。通過TBtools根據(jù)建蘭基因組的注釋數(shù)據(jù)獲得CeMYBs在建蘭基因組中的染色體定位。使用TBtools的One Step MCScanx程序顯示每對建蘭染色體之間的同線關(guān)系［23］，并采用TBtools進行可視化分析。

1.3 CeMYB基因響應不同鹽脅迫類型的表達分析

1.3.1 建蘭RNA提取 將建蘭植株根系、假鱗莖、葉片及花序樣品（250 mg）加入液氮快速研磨，按照Plant RNA Kit提取試劑盒（omega）相關(guān)說明提取建蘭總RNA，采用Nano Drop 2000紫外分光光度計（Nano Drop 2000，USA）檢測RNA濃度，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測檢驗RNA質(zhì)量。

1.3.2 建蘭RT-qPCR分析 將質(zhì)檢合格的RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ（Evo M-MLV）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA采用無菌水稀釋100倍，作為后續(xù)RT-qPCR的模板。建蘭相關(guān)引物采用Primer 6.0軟件設(shè)計擴增引物（表1），以GAPDH作為內(nèi)參基因。RT-qPCR反應體系與反應程序參照曹映輝等的方法［24］，使用Bio-Rad（Bio-Rad Laboratories Inc.，USA）的C1000 Touch PCR熱循環(huán)儀和CFX Connect實時檢測系統(tǒng)，每個處理進行3個復孔，采用2-ΔΔCT [KG*5]法計算基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2007對CeMYB的qRT-PCR數(shù)據(jù)進行整理，采用DPS 14.0進行方差分析及Duncans檢驗，相關(guān)圖形采用R5、Origin 2022繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子的篩選

由圖1可知，將建蘭轉(zhuǎn)錄組相關(guān)蛋白序列注釋至PlantTFDB數(shù)據(jù)庫，通過BLAST對比最終鑒定出10種共678個轉(zhuǎn)錄因子。其中，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的數(shù)量最多，達143個，其次為bZIP、bHLH、C3H型轉(zhuǎn)錄因子，分別為99、86、69個。隨后以擬南芥的MYB蛋白全序列為對比庫，通過BLAST對比初步鑒定，然后通過Pfam篩選出來，在建蘭基因組中共獲得140個MYB序列，使用hmmer 3.0檢索，共獲得136條完整的MYB序列，其中包括27個1R-MYB、102個R2R3-MYB、5個3R-MYB和2個4R-MYB，根據(jù)其在染色體上的位置命名為CeMYB1～CeMYB136。

2.2 建蘭MYB基因家族的系統(tǒng)發(fā)育和分類

由圖2可知，對136個建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列信息和131個擬南芥（A.thaliana）MYB進行多序列對比，根據(jù)對比結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，建蘭和擬南芥的MYB成員可形成25個亞家族，分別命名為S1～S25。這些亞家族還包含一些最初不屬于S25亞家族的R2R3-MYB成員，并且大多數(shù)亞群包含來自建蘭和擬南芥的R2R3-MYB成員，表明一些R2R3-MYB同源成員可能在漫長的進化歷程中發(fā)生了丟失，就建蘭MYB家族成員而言，參照擬南芥MYB的基本表征可將建蘭MYBs分為20個亞家族，其中，S21亞家族擁有最多的MYB成員（16個），其次是S14亞家族（10個），而S7、S9、S16和S19的CeMYB數(shù)量最少，各含2個。

2.3 建蘭MYB蛋白保守基序分析

2.3.1 建蘭MYB蛋白保守基序分布分析 為研究CeMYB蛋白序列的功能多樣化形式，通過MEME系統(tǒng)鑒定了CeMYB轉(zhuǎn)錄因子的15個保守基序（基序1～15）。由圖3-A可知，大多數(shù)基序集中、規(guī)則分布在CeMYBs的N端，少數(shù)基序不規(guī)則分布在C端；屬于同一亞科的CeMYB整體具有較為相似的保守基序，而不同亞科的CeMYB之間基序存在較大差異。大多數(shù)CeMYB具有基序1、2、3、5，幾乎所有CeMYB都包含2個以上的保守基序，而CeMYB131、CeMYB38和CeMYB40僅含有1個基序；CeMYB99、CeMYB83和CeMYB129包含基序1和基序5。除了CeMYB86、CeMYB39含有基序10和基序12外，僅S1亞家族的成員有基序10、基序12。此外，基序13僅存在于S21亞家族成員的C端，推測保守的基序可能與該亞科的特定功能有關(guān)。由圖 3-C 可知，CeMYB82、CeMYB15、CeMYB13、CeMYB14、CeMYB40、CeMYB39、CeMYB8、CeMYB53、CeMYB76、CeMYB75、CeMYB62、CeMYB3、CeMYB59、CeMYB115和CeMYB25無內(nèi)含子，而其他CeMYB有1～13個內(nèi)含子。共有66個CeMYB含有2個內(nèi)含子和3個外顯子，其占CeMYB總數(shù)的49.3%。這些結(jié)果表明，雖然一部分CeMYB的基因結(jié)構(gòu)高度保守，但不同亞科的CeMYBs仍表現(xiàn)出較為復雜的序列多樣性。

2.3.2 建蘭MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域基序分析 將136個CeMYB序列信息上傳到WebLogo以檢查該家族成員是否含有共同的保守序列。由圖4可知，CeMYBs的R2和R3結(jié)構(gòu)域相對保守，在每18個氨基酸中鑒定出約1個色氨酸殘基。R2結(jié)構(gòu)域包括3個色氨酸殘基（W），而R3結(jié)構(gòu)域中的第1個色氨酸殘基被苯丙氨酸殘基（F）替換；因此，僅有1個色氨酸殘基存在于R3域中。

2.4 建蘭MYB的染色體定位和共線性分析

2.4.1 建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子的染色體定位 由染色體作圖結(jié)果（圖5）可知，在136個CeMYB中有134個CeMYB不均勻分布在建蘭的18號染色體上，2個CeMYBs定位于未具體分類的支架上。3號染色體具有最多的CeMYB（18個），7號染色體有11個CeMYB，1、2、4號染色體分別有10個CeMYB，其他染色體具有1～9個CeMYB。 此外 蛋白質(zhì)亞細胞定位結(jié)果表明，大多數(shù)CeMYB定位于細胞核中。

2.4.2 建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子分布的共線性分析 由圖6可知，串聯(lián)重復和片段重復都有利于植物基因家族的擴增，共線性分析表明，建蘭MYB基因組包含29對片段復制的基因。在12號染色體上具有最多的片段重復基因，在11、13、14、18、20號染色體上分別僅發(fā)現(xiàn)了1個重復基因。此外，還鑒定出23對串聯(lián)重復的基因?qū)?，其中，大部分出現(xiàn)在3號染色體上。在串聯(lián)重復的基因中，CeMYB13和CeMYB15、CeMYB75和CeMYB76、CeMYB96和CeMYB97、CeMYB113和CeMYB114、CeMYB105和CeMYB106、CeMYB87和CeMYB88均兩兩位于染色體的相同位置，且均具有較為相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)。

2.5 建蘭MYB在不同組織中的表達模式分析

由圖7可知，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得不同組織中108個CeMYB的表達水平（有28個CeMYB在建蘭葉片中不表達，因此未展示）并繪制Heatmap圖，將這些基因分為7組（A～G）。在108個CeMYB中，A組有18個基因在花序（flower）和葉片（leaf）中低表達，在根系（root）和假鱗莖（stem）中高表達。此外，由圖8-A可知，A組基因的表達模式與建蘭植株Na+濃度趨于一致 表明A組基因可能參與了植株的鹽脅迫調(diào)控。B組共14個基因僅8個基因在根系中表達，而在其他組織中不表達或表達水平水平較低。C組共9個基因在花序和根系中的表達水平較高。D組的22個基因中，CeMYB78、CeMYB84、CeMYB132在葉片和花序中高表達，CeMYB130、CeMYB107、CeMYB70、CeMYB119基因在根系和葉片中高表達。E組13個基因僅在花序中高表達。F組中全部基因（15個）在假鱗莖均具有較高的表達水平。G組中，除CeMYB94、CeMYB33、CeMYB71基因外，其他基因均在葉片中高表達，部分基因（CeMYB94、CeMYB33、CeMYB98、CeMYB47）也在假鱗莖中高表達。值得注意的是，A組CeMYB89和CeMYB61在根系、假鱗莖、葉片及花序中均具有較高的表達水平，且均屬于S13亞家族，初步表明該兩者基因參與鹽脅迫的調(diào)控，應在后續(xù)研究中予以重視。

2.6 qRT-PCR分析靶向CeMYB在不同鹽脅迫類型下的驗證

由圖8可知，選擇參與鹽脅迫調(diào)控的S13亞科CeMYB89和CeMYB61，研究其在不同鹽脅迫中的表達水平，在CeMYB61、CeMYB89中，任一組織器官中CK表達水平皆較低，鹽（NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3）脅迫處理均顯著或極顯著大于CK，且鹽脅迫處理間均表現(xiàn)為NaCl假鱗莖>葉片>花序。該表達模式與建蘭不同組織Na+濃度趨勢趨于一致，表明兩者基因參與建蘭鹽脅迫的調(diào)控。CeMYB61和CeMYB89在不同組織中的表達模式與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，進一步證實了上述CeMYB基因表達數(shù)據(jù)的可靠性。

3 討論與結(jié)論

全基因組分析是探索植物中MYB家族生物學功能的重要方法［25-26］。本研究基于建蘭基因組鑒定出136個CeMYB轉(zhuǎn)錄因子，其中102個CeMYB隸屬于R2R3-MYB亞家族，占比75%；其結(jié)果與前人研究基本一致，即在蘭科植物中R2R3-MYB是最大的MYB亞家族，其占比高達70%以上［27］；而與小麥［28］、煙草［11］等其他物種存在較大差距，數(shù)量差異的原因可能是由基因組大小和基因重復元件造成的［7］，這也反映了植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在進化過程中的復雜性和多樣性。

通過結(jié)合來自擬南芥的MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)MYB的保守性和相同功能將相關(guān)基因被歸入同一亞組，CeMYB可劃分為20個亞科。CeMYB61和CeMYB89歸屬于S13亞科中與AtMYB86、AtMYB50和AtMYB61聚為一類，AtMYB86、AtMYB50在以往的研究中已被證實參與擬南芥鹽脅迫調(diào)控［16］，初步顯示表明，CeMYB61、CeMYB89可能參與建蘭對鹽脅迫的調(diào)控。此外，部分建蘭CeMYB成員與擬南芥AtMYB的生物學特征不同，這表明這些基因可能是擬南芥分化后形成的，其可能具有獨特的生物學功能，或者這些基因可能在進化過程中從擬南芥基因組中丟失［29］。基因復制在植物進化中發(fā)揮著重要作用，是基因家族擴展的主要機制。前人研究表明，在擬南芥中發(fā)生了3起全基因組復制（WGD）事件［30］，而在蘭科植物中則發(fā)生了2次［2］。本研究中，建蘭基因組中有23對串聯(lián)重復的CeMYB和29對分段重復的CeMYB，基因串聯(lián)重復事件在染色體上均勻出現(xiàn)，這些結(jié)果表明基因重復是介導MYB基因家族進化的重要事件。

建蘭MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域基序分析表明，CeMYB的結(jié)構(gòu)域包含有代表性的色氨酸殘基，其中R2具有3個高度保守的色氨酸殘基，而R3中的第1個色氨酸殘基被苯丙氨酸取代。這一結(jié)果與在矮牽牛（Petunia hybrida Vilm）中觀察到的結(jié)果一致［31］，每個R基序中的色氨酸殘基有助于維持螺旋-轉(zhuǎn)螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)，使MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠與DNA結(jié)合［32］；R3中色氨酸殘基被取代可能有助于識別新的靶基因，也可能導致DNA與靶基因的結(jié)合活性喪失［29］。此外，建蘭MYB蛋白保守基序分布分析表明，系統(tǒng)發(fā)育樹中密切相關(guān)的CeMYB具有相似的保守基序，大多數(shù)CeMYB包含基序1、2、3、5。且大多數(shù)CeMYB（49.3%）包含2個內(nèi)含子和3個外顯子，僅有S1亞家族的成員具有基序13，這意味著S1中的CeMYB可能具有不同于其他亞群的特殊功能?？傮w而言，同一進化分支中的基序、內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量較為相似，僅少數(shù)CeMYB發(fā)現(xiàn)了變異。

本研究中，建蘭MYB的轉(zhuǎn)錄組分析表明，不同組織中僅S13亞科中CeMYB61、CeMYB89的表達模式與建蘭組織中的Na+濃度分布趨勢一致，再次表明該兩者基因可能參與建蘭耐受鹽脅迫的調(diào)控。qRT-PCR結(jié)果表明，CeMYB61、CeMYB89在不同組織中表現(xiàn)為根系>假鱗莖>葉片>花序，其表達水平、模式與組織中的Na+濃度一致，證實了CeMYB61、CeMYB89是建蘭耐受鹽脅迫的指示基因。此外，就轉(zhuǎn)錄豐度來看，在任一組織器官中，CeMYB61、CeMYB89均表現(xiàn)為從最大至最小列為NaCl

綜上，本研究從建蘭基因組中共鑒定出136個CeMYB轉(zhuǎn)錄因子，通過與擬南芥MYB進行系統(tǒng)發(fā)育得到20個基因簇，根據(jù)TBtools進行染色體定位顯示，136個CeMYB均勻分布在18條染色體上。保守域分析表明，它們具有典型的氨基酸序列重復，基序預測顯示，多個保守元件主要位于CeMYB的N端，表明它們的功能相對保守，大多數(shù)CeMYB位于細胞核中；基于CeMYB的轉(zhuǎn)錄組表達分析表明，S13亞科的CeMYB61和CeMYB89可能是調(diào)控鹽脅迫的關(guān)鍵基因，qRT-PCR驗證顯示CeMYB61、CeMYB89表達水平、模式與各組織中的Na+濃度分布一致，證實了CeMYB61、CeMYB89是建蘭耐受鹽脅迫的指示基因。

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收稿日期：2023-05-13

基金項目：貴州省特色林業(yè)產(chǎn)業(yè)項目（編號：特林研2020-04）；貴州省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（編號：S202010672021）。

作者簡介：鄧文楷（1996—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要從事園藝環(huán)境工程研究。E-mail：dl18222235394@163.com。

通信作者：彭 艷，博士，副教授，主要從事生物環(huán)境地球化學研究。E-mail：yan.jane.peng@ gmail.com。