劉文瞻，蔡啟亮，吳寶軍，楊思維，姚智力，侯澤楷，孫彬栩

前列腺癌已成為歐美國(guó)家男性最常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤［1-2］，在我國(guó)呈逐年快速升高趨勢(shì)［3］。雄激素在前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而雄激素剝奪治療被認(rèn)為是前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)藥物療法［4］。盡管各種內(nèi)分泌治療藥物不斷更新，但經(jīng)過(guò)18～36個(gè)月內(nèi)分泌治療后，大多數(shù)患者仍將逐漸發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌［5］，且長(zhǎng)期服藥造成了身體不良反應(yīng)不斷加重［6］。中草藥中的單體物質(zhì)研究已成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)［7］。染料木黃酮是大豆提取物中的主要活性成分之一，已被證實(shí)具有雌激素樣活性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)信號(hào)通路以及抗腫瘤作用［8-10］。目前，染料木黃酮在前列腺癌中的作用研究報(bào)道較少，染料木黃酮抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬探討染料木黃酮對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 前列腺癌細(xì)胞株LNCaP 和CWR22RV1 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；染料木黃酮購(gòu)于Sigma-Aldrich，純度≥98%；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO BRL 公司；兔抗人E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）、N-鈣黏蛋白（NCadherin）、波形蛋白（Vimentin）、CD44、Oct4、GAPDH 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning Incorporated 公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ameresco公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司，蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞接種于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2和37 ℃孵育箱中貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為85%時(shí)傳代，穩(wěn)定傳3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照組（RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)）和實(shí)驗(yàn)組（50 μmol/L染料木黃酮處理）。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2 組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10%FBS 的RPMI 1640重懸細(xì)胞，調(diào)整成單細(xì)胞懸液。以2×104個(gè)/孔的密度將上述細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入MTT 溶液20 μL，培養(yǎng)4 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處光密度（OD）值。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP 和CWR22RV1 細(xì)胞接種至12 孔板內(nèi)，使細(xì)胞增殖至融合度為90%，使用無(wú)菌0.2 mL移液器套頭筆直在細(xì)胞上劃出一條痕，用PBS清洗3次去除細(xì)胞碎片。實(shí)驗(yàn)組加入1 mL含50 μmol/L 染料木黃酮的RPMI 1640 培養(yǎng)基，對(duì)照孔中加入不含染料木黃酮的RPMI 1640 培養(yǎng)基。在劃痕后0 h 和72 h 拍照，在每條傷痕上隨機(jī)取3 個(gè)地方，用Image-Pro Plus軟件測(cè)量直徑后取平均值，計(jì)算創(chuàng)面閉合指數(shù)。創(chuàng)面閉合指數(shù)=（0 h直徑-72 h直徑）/0 h直徑×100%。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP 和CWR22RV1 細(xì)胞饑餓孵育24 h，加胰酶消化，用無(wú)血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋使其細(xì)胞為5×105個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)組Transwell上室以基質(zhì)膠包被后加入200 μL含50 μmol/L染料木黃酮的單細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含20%FBS的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組上室加入200 μL單細(xì)胞懸液。置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，棄去舊的培養(yǎng)基，PBS多次潤(rùn)洗，4%多聚甲醛溶液固定30 min，結(jié)晶紫避光染15 min，PBS再次潤(rùn)洗，用棉簽拭去小室內(nèi)未穿過(guò)膜的細(xì)胞。在顯微鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野觀察并拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot 檢測(cè)E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、CD44、Oct4 蛋白表達(dá) 2 組細(xì)胞分組處理72 h 后用PBS 清洗，加入裂解液和蛋白酶抑制劑的混合物，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞于EP 管。4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液。BCA 法測(cè)定蛋白定量，定量后分裝保存于-80 ℃待用。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠并以恒壓80 V，20 min后120 V 進(jìn)行蛋白分離電泳1 h，100 V 恒壓濕轉(zhuǎn)1.5 h，PVDF 膜浸入5%脫脂奶粉中封閉，室溫緩慢振蕩1 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入一抗（兔抗人E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、CD44、Oct4、β-actin、GAPDH 單克隆抗體，均按1∶1 000 稀釋），4 ℃搖床孵育過(guò)夜；隔日，TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入二抗（1∶4 000）室溫孵育1.5 h；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（1∶3 000）孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；凝膠成像儀曝光成像，Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶灰度值和βactin、GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染料木黃酮對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響 MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組LNCaP 和CWR22RV1 細(xì)胞經(jīng)染料木黃酮處理24、48、72 h 后，細(xì)胞增殖活性低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Effect of genistein on proliferative activity of LNCaP and CWR22RV1 cells表1 染料木黃酮對(duì)LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞增殖活性的影響（n=3，OD490，±s）

Tab.1 Effect of genistein on proliferative activity of LNCaP and CWR22RV1 cells表1 染料木黃酮對(duì)LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞增殖活性的影響（n=3，OD490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t LNCaP細(xì)胞24 h 0.33±0.02 0.29±0.01 3.789＊48 h 0.64±0.02 0.49±0.01 11.340＊＊72 h 1.08±0.042 0.62±0.052 12.130＊＊組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t CWR22RV1細(xì)胞72 h 0.87±0.12 0.49±0.07 4.755＊24 h 0.28±0.01 0.26±0.01 2.824＊48 h 0.58±0.02 0.37±0.05 6.970＊

2.2 染料木黃酮對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 在LNCap 和CWR22RV1細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組的劃痕愈合指數(shù)（%）較對(duì)照組下調(diào)（LNCap：18.32±4.28vs.62.54±11.69，n=3，t=6.152，P＜0.01；CWR22RV1：21.38±6.74vs.67.39±15.41，n=3，t=4.738，P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Effect of genistein on migration of LNCaP and CWR22RV1 cells圖1 染料木黃酮對(duì)LNCaP 和CWR22RV1細(xì)胞的遷移的影響

2.3 染料木黃酮對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲的影響 在LNCaP 細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少（單位：個(gè)/視野，130.67±13.05vs.255.67±14.57，n=3，t=11.068，P＜0.01），在CWR22RV1 細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)亦較對(duì)照組減少（177.33±13.05vs.336.67±10.26，n=3，t=16.622，P＜0.01），見(jiàn)圖2。

Fig.2 Effect of genistein on invasion of LNCaP and CWR22RV1 cells(crystal violet staining,×200)圖2 染料木黃酮對(duì)LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

2.4 染料木黃酮抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程及腫瘤干細(xì)胞的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，在LNCap 和CWR22RV1 細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin 水平下調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)上調(diào)，腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物CD44 與Oct-4 的蛋白表達(dá)水平下調(diào)。見(jiàn)圖3、表2。

Fig.3 Changes of protein expression of E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44 and Oct-4 in LNCap and CWR22RV1 cells in each group圖3 各組LNCap、CWR22RV1細(xì)胞中E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44、Oct-4的蛋白表達(dá)變化

Tab.2 Comparison of protein expressions of E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44 and Oct-4 in LNCaP and CWR22RV1 cells between the four groups表2 各組LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞E-Cadherin、NCadherin、Vimentin、CD44和Oct-4蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expressions of E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44 and Oct-4 in LNCaP and CWR22RV1 cells between the four groups表2 各組LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞E-Cadherin、NCadherin、Vimentin、CD44和Oct-4蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t LNCap細(xì)胞CD44 0.99±0.10 0.52±0.02 7.742＊＊Oct-4 1.00±0.10 0.61±0.03 6.173＊＊E-Cadherin 1.00±0.04 2.10±0.31 5.931＊＊N-Cadherin 1.00±0.06 0.38±0.07 10.595＊＊Vimentin 1.00±0.11 0.42±0.09 6.646＊＊組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t CWR22RV1細(xì)胞CD44 1.00±0.14 0.48±0.04 6.024＊＊Oct-4 0.99±0.09 0.38±0.03 10.879＊＊E-Cadherin 0.99±0.11 1.87±0.15 7.757＊＊N-Cadherin 0.99±0.04 0.46±0.04 14.541＊＊Vimentin 0.99±0.04 0.50±0.10 7.732＊＊

3 討論

染料木黃酮的抗腫瘤作用已在宮頸癌、卵巢癌、腎癌以及肝癌中得到證實(shí)［11-13］。本研究結(jié)果表明，染料木黃酮能夠抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞LANCaP 及CWR22RV1 的增殖能力，這與李飛等［14-15］的研究結(jié)果一致。此外，本研究通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，染料木黃酮能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這與高曉康等［16］報(bào)道的染料木黃酮能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力的結(jié)果一致。綜合上述文獻(xiàn)報(bào)道及本研究結(jié)果表明，染料木黃酮能夠抑制前列腺癌的細(xì)胞增殖，從而抑制前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

前列腺癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制復(fù)雜，前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中伴隨EMT［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)染料木黃酮處理的前列腺癌LNCaP 和CWR22RV1 細(xì)胞中EMT重要相關(guān)蛋白發(fā)生了變化：間質(zhì)蛋白標(biāo)志物NCadherin、Viminten 表達(dá)降低，上皮蛋白標(biāo)志物ECadherin表達(dá)增加。由此提示染料木黃酮能夠抑制EMT 過(guò)程，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。曹玉霖等［19］報(bào)道染料木黃酮可以通過(guò)PI3K/AKT 途徑抑制雄激素非依賴性LNCaP 細(xì)胞的增殖。李飛等［15-16］研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮能夠通過(guò)抑制雄激素受體信號(hào)通路來(lái)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。由此可知，染料木黃酮對(duì)前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制是多途徑、多機(jī)制的。本研究著重探討了染料木黃酮對(duì)前列腺癌EMT的抑制作用，對(duì)于染料木黃酮在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用的詳細(xì)機(jī)制，待以后的研究深入探討。

前列腺癌干細(xì)胞具有自我更新和多分化潛能，被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)分泌治療失敗的根源［20］。前列腺癌干細(xì)胞在功能和生物學(xué)特點(diǎn)與EMT細(xì)胞部分相似，并且這些功能和生物學(xué)特點(diǎn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［21］。本課題組前期研究證實(shí)，CD44+腫瘤細(xì)胞較CD44-細(xì)胞具有更高的克隆形成和成瘤能力，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β 可通過(guò)上調(diào)CD44的表達(dá)來(lái)下調(diào)E-Cadherin，同時(shí)上調(diào)Vimentin，從而促進(jìn)前列腺癌EMT［22］。Zhang 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮可通過(guò)調(diào)控Hedgehog-Gli1信號(hào)通路影響前列腺癌細(xì)胞的干性。本研究使用染料木黃酮處理LNCaP和CWR22RV1細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物CD44及Oct-4的表達(dá)均降低，說(shuō)明染料木黃酮能夠減少前列腺癌腫瘤干細(xì)胞的形成，從而抑制前列腺癌的進(jìn)展。

綜上，染料木黃酮能夠通過(guò)抑制EMT過(guò)程和降低腫瘤細(xì)胞干性來(lái)抑制前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。