康麗，曹艷，李恒希，李佳麗，凌騰晗，尹愛平，張瑞林，李坪*

1.河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，河南 安陽 455000； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，昆明 650500； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院毒物化學(xué)系，昆明 650500

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）為神經(jīng)外科常見疾病，其致殘率、致死率居創(chuàng)傷首位[1]。TBI 發(fā)生后，機(jī)械性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元、軸突、膠質(zhì)細(xì)胞和血管等結(jié)構(gòu)剪切、撕裂和組織變形，尤其是血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的連續(xù)性和通透性受損，包裹于微血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AST）足板腫脹和小血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接破壞。TBI 會引起AST 和緊密連接蛋白Claudin-5 受損[2]，而大麻二酚（cannabidiol，CBD）作為大麻的天然提取物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗腫瘤等作用，且不具神經(jīng)毒性，其安全性和耐受性良好[3～6]，對蛛網(wǎng)膜下腔出血造成的腦損傷早期有改善作用[7]。本實(shí)驗(yàn)觀察TBI 后緊密連接蛋白Claudin-5 的表達(dá)變化和CBD 干預(yù)對腦損傷的改善作用，探究參與構(gòu)成血腦屏障的AST 和Claudin-5 蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，為臨床救治TBI 患者提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用體重（280±20）g 的健康成年雄性SD 大鼠（昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），在標(biāo)準(zhǔn)照明（12 h 光照/黑暗）和標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（溫度20～25 ℃，濕度55%～65%）適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食和飲水，術(shù)前8 h 禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)符合動物學(xué)倫理，實(shí)驗(yàn)期間盡可能減輕動物痛苦。

1.1.2 主要試劑 CBD（云南漢素生物公司）；兔抗Claudin-5 多克隆抗體（美國Affinity 公司）；Cy3 goatanti rabbit IgG（美 國Sigma 公 司）；488-conjugated GFAP monoclonal antibody（中國Proteintech 公司）；總RNA 提取試劑盒（日本Takara 公司）；熒光定量試劑盒（日本Takara 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）；即用型免疫組化超敏試劑盒（福州邁新生物公司）；DAB 顯色液（福州邁新生物公司）；山羊血清（北京Biotopped 公司）；抗熒光衰減封片劑（大連美侖生物公司）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 自由落體腦損傷打擊裝置（深圳瑞沃德公司）；-80 ℃冰箱（美國Thermo Fisher 公司）；LED 數(shù)顯圓周搖床（美國scilogex 公司）；石蠟切片機(jī)（德國Laica 公司）；光學(xué)顯微鏡（德國Laica 公司）；熒光倒置顯微鏡（德國ZEISS 公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及神經(jīng)功能缺損鑒定 參照改良的Feeney 自由落體方式制備TBI 大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）進(jìn)行麻醉，額頂部剃毛并俯臥位固定于腦立體定位儀上，常規(guī)消毒后矢狀位切開頭皮，暴露右側(cè)顱骨，用牙科鉆鉆出一個直徑6 mm 的窗孔（矢狀縫右側(cè)2.5 mm，冠狀縫下方2 mm），將40 g 砝碼從15 cm 高度自由落下打擊骨窗暴露的硬腦膜，隨后止血、縫合、腹腔注射生理鹽水補(bǔ)液等處理[8]。假手術(shù)組僅做開骨窗，不進(jìn)行打擊，其余實(shí)驗(yàn)過程相同。術(shù)后動物接受監(jiān)護(hù)，直到恢復(fù)自主呼吸。依據(jù)改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS），從運(yùn)動、行走、感覺、平衡木、反射5 個方面對大鼠的神經(jīng)損傷評分，評分越高代表神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。測試顯示大鼠TBI 模型制備成功[9]。

1.2.2 分組及給藥 將符合條件的108 只大鼠隨機(jī)分為形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)（n=54）和RT-PCR 實(shí)驗(yàn)（n=54），各分為3 組（Sham 組、TBI+vehicle 組和TBI+CBD 組），按8 h、1d、2 d、3 d、5 d 和7 d（n=3）6 個時間點(diǎn)斷頭取腦。其中TBI+CBD 組于造模前30 min 以及造模后6 h 腹腔注射CBD 混懸液（10 mg/kg），之后每天注射1 次直至取材，Sham 組和TBI+vehicle 組注射等量2%Tween-80 生理鹽水（1 mL/kg）。

1.2.3 免疫組化染色 大鼠灌注取腦并用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸透包埋。腦組織切片厚5 μm。嚴(yán)格按照試劑說明書采用免疫組化SP 方法，步驟如下：切片常規(guī)脫蠟、抗原熱修復(fù)；用0.01 M 的PBS-0.1% triton 緩 沖 液 沖 洗3 min×3 次，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；滴加正常非免疫性羊血清，室溫孵育10 min；滴加一抗（兔抗Claudin-5 多克隆抗體，1：100）孵育，4 ℃過夜；室溫復(fù)溫20 min；PBS-0.1% triton 緩沖液沖洗3 min×5次；滴加生物標(biāo)記的第二抗體，37 ℃孵育15 min；PBS-0.1% triton 緩沖液沖洗3 min×3 次；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫孵育15 min；PBS-0.1% triton 緩沖液沖洗3 min×3 次；DAB 試劑顯色；雙蒸水沖洗3 min×3 次終止DAB 顯色；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。將大鼠損傷側(cè)/開骨窗側(cè)皮質(zhì)區(qū)作為采圖和分析部位，隨機(jī)選取5 個高倍視野（×400）拍片，光學(xué)顯微鏡下觀察Claudin-5 的形態(tài)學(xué)特征，用Image J 軟件對每張照片的平均光密度進(jìn)行分析。

1.2.4 免疫熒光雙標(biāo)染色 取待測組織石蠟切片，脫蠟以及抗原修復(fù)，PBS 清洗3 min×3 次；5%山羊血清封閉30 min；加兔抗Claudin-5 多克隆抗體（1：100），4 ℃冰箱過夜；室溫平衡30 min，PBS 清洗5 min×3次；加Cy3 標(biāo)記羊抗兔IgG（1：200），室溫孵育1 h，PBS 清 洗5 min×3 次；再 加488-conjugated GFAP 多 克隆抗體（1：200），室溫孵育2 h，PBS 清洗5 min×3 次；抗熒光衰減封片劑封片。于倒置顯微鏡（×400）下觀察染色情況，隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)及背景清晰的5 個視野拍片，Image J 圖像分析系統(tǒng)測量每張圖片中陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR 大鼠斷頭取腦，分離損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)新鮮腦組織，用Trizol 法提取總RNA，根據(jù)說明書規(guī)范操作，用紫外線分光光度計檢測RNA 樣品濃度及A260 和A280 比值，每組取1 μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA 作為模板，Claudin-5 上游引物：CTTGGAAGGGGCTGTGGAT，下游引物：GCCAGCACAGACTCATACAC；GAPDH 上 游 引 物：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，下 游 引 物 ：GACGCCAGTAGACTCCACGACA。利 用 SYBR Green 試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，進(jìn)行40 次循環(huán)。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用實(shí)時熒光定量PCR 儀器進(jìn)行Claudin-5 mRNA 定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用Student'st檢驗(yàn)，P＜0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測CBD 干預(yù)對TBI 不同時間Claudin-5 mRNA 表達(dá)影響

與Sham 組相比，TBI 大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)Claudin-5 mRNA 表達(dá)減弱（8 h～5 d），其中2 d 組的表達(dá)最低，CBD 干預(yù)后1～5 d，Claudin-5 mRNA 表達(dá)明顯升高，差 異 均 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.05）。7 d 組Claudin-5 mRNA 表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 實(shí)時熒光定量PCR 檢測Claudin-5 mRNA 表達(dá)*P＜0.05，與Sham 組比較 # P＜0.05，與TBI+vehicle 組比較Fig.1 Expression of claudin-5 mRNA detected by realtime PCR* P＜0.05, vs Sham group; # P＜0.05, vs TBI + vehicle group

2.2 免疫組化檢測CBD 干預(yù)對TBI 不同時間Claudin-5 陽性表達(dá)影響

Sham 組陽性細(xì)胞內(nèi)皮較為連續(xù)、完整，陽性表達(dá)較強(qiáng)，TBI 后不同時間點(diǎn)Claudin-5 線條發(fā)生斷裂，陽性表達(dá)的平均光密度值從8h 起逐漸下降，2d 組陽性表達(dá)降至最低值，Claudin-5 線條呈點(diǎn)狀分布，隨后有所回升，但至7d 組陽性表達(dá)仍低于Sham 組。CBD 干預(yù)后，2 d，3 d，5 d 和7 d 組Claudin-5 陽性表達(dá)的形態(tài)有所恢復(fù)，呈現(xiàn)較為連續(xù)、完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，陽性顯色程度顯著高于TBI 組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 免疫組化檢測Claudin-5 蛋白表達(dá)A：免疫組化染色（Bar=25 μm）箭頭示Claudin-5 陽性 B：Image J 分析Claudin-5 光密度 * P＜0.05，與Sham 組比較 # P＜0.05，與TBI+vehicle 組比較Fig.2 Protein expression of Claudin-5 detected by immunohistochemistry A: Immunohistochemical staining (Bar=25 μm), arrows indicated positive expression of Claudin-5; B: Image J software analysis of Claudin-5 optical density values * P＜0.05, vs Sham group; # P＜0.05, vs TBI + vehicle group

2.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測CBD 干預(yù)對TBI 不同時間Claudin-5 和膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性表達(dá)影響

由于RT-PCR 及免疫組化結(jié)果均顯示TBI 后2 d組AST 激活最明顯，Claudin-5 陽性表達(dá)下降最明顯，因此選擇TBI 后2 d 組做免疫熒光染色，從腦微血管區(qū)及非微血管區(qū)均可看到：與Sham 組相比，TBI 后膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性表達(dá)增強(qiáng)，即AST 處于激活狀態(tài)，主要表現(xiàn)為胞體變大、突起增多和變粗，貼附在腦血管內(nèi)皮表面的足板腫脹，且出現(xiàn)斷裂、點(diǎn)狀不連續(xù)分布。而Claudin-5 陽性表達(dá)顯著減低。CBD 干預(yù)后，GFAP 陽性表達(dá)減弱，即AST 的激活狀態(tài)減弱，而Claudin-5 的熒光表達(dá)強(qiáng)度有所恢復(fù)（圖3）。這進(jìn)一步說明：CBD 干預(yù)能夠抑制TBI 損傷引起的AST 激活，提高Claudin-5 表達(dá)。

3 討論

國內(nèi)外研究證實(shí)各種類型的腦損傷可導(dǎo)致BBB功能障礙[1,10]，而BBB 受損通常與微血管內(nèi)皮緊密連接破壞有關(guān)。緊密連接是位于BBB 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）最頂部的蛋白分子復(fù)合體，Claudin-5 是緊密連接蛋白的主要成分。多項研究表明，Claudin-5 主要表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，其陽性表達(dá)在不同的腦損傷模型中呈現(xiàn)不同程度的下降[10～12]。本實(shí)驗(yàn)參照改良的Feeney 自由落體方式制備TBI 大鼠模型[8]，通過免疫組織化學(xué)染色對Claudin-5 的平均光密度進(jìn)行測量，結(jié)果顯示對照組Claudin-5 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，并沿血管內(nèi)皮連續(xù)分布，TBI 后各時間點(diǎn)的Claudin-5 表達(dá)顯著降低，2 d 達(dá)最低，免疫熒光染色和RT-PCR 結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果類似。此外，在腦非血管部位同樣發(fā)現(xiàn)Claudin-5表達(dá)下調(diào)。因此推測TBI 所致的Claudin-5 表達(dá)持續(xù)降低導(dǎo)致BBB 的完整性破壞，且Claudin-5 可能引起B(yǎng)BB 以外的大腦組織結(jié)構(gòu)改變。

與Claudin-5 類似，緊密貼附于BMECs 表面的AST 對于維持BBB 結(jié)構(gòu)完整和功能正常至關(guān)重要。AST 和緊密連接蛋白Claudin-5 作為血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)，兩者的相互關(guān)系備受關(guān)注。文獻(xiàn)報道Claudin-5和貼附于微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的AST 在不同的腦損傷類型中表現(xiàn)有時間依賴性[12～16]。前期課題組發(fā)現(xiàn)TBI 后AST 表現(xiàn)為激活狀態(tài)，胞體變大、突起增多和變粗[17]。本實(shí)驗(yàn)分別從腦血管區(qū)和非血管區(qū)免疫熒光雙標(biāo)圖片發(fā)現(xiàn)TBI 后GFAP 陽性表達(dá)增強(qiáng)，說明AST 被激活，同時發(fā)現(xiàn)Claudin-5 表達(dá)降低。由此推測TBI 導(dǎo)致AST 激活，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)Claudin-5 蛋白表達(dá)?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)研究，尋找一種適合的化合物，能有效干預(yù)AST 激活及增強(qiáng)Claudin-5 表達(dá)，進(jìn)而改善TBI 損傷顯得尤為重要。

CBD 是大麻提取物中含量第二豐富的無精神活性成分的物質(zhì)，其作用有別于四氫大麻酚（THC）。國內(nèi)外研究CBD 與腦缺血疾病較為密集，有關(guān)CBD 與創(chuàng)傷性腦損傷方面的文獻(xiàn)較少。有研究發(fā)現(xiàn)口服CBD 可以改善TBI 所致的慢性疼痛、抑郁等神經(jīng)功能障礙[18]；對于體外BMECs 和AST 共培養(yǎng)制備缺血性腦損傷模型研究發(fā)現(xiàn)：缺血再灌注前給予CBD 是最有效的，缺血再灌注后2 h 仍可觀察到保護(hù)作用，提示缺血性腦損傷后CBD 影響B(tài)BB 通透性從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[17,19]。那么CBD 干預(yù)能否改善TBI 大鼠的神經(jīng)功能障礙？本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TBI 后Claudin-5 陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度明顯減弱，而CBD 干預(yù)后Claudin-5 表達(dá)明顯升高[2]，但未能揭示干預(yù)后表達(dá)時序性變化，所以本實(shí)驗(yàn)主要研究CBD 干預(yù)后8 h、1 d、2 d、3 d、5 d 和7 d 6 個時間點(diǎn)AST 的激活程度和Claudin-5 的陽性表達(dá)變化規(guī)律，結(jié)果顯示TBI 后AST 的突起足板與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間有直接接觸，Claudin-5 陽性表達(dá)下降，線條狀發(fā)生斷裂，多呈點(diǎn)狀分布。CBD 干預(yù)后AST 激活狀態(tài)下降，Claudin-5 陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，線條狀有所恢復(fù)，干預(yù)后2 d 表現(xiàn)最為明顯。由此推斷CBD 能降低TBI 引起的AST激活及增加Claudin-5 表達(dá)，從而改善BBB 結(jié)構(gòu)的完整性。

綜上所述，顱腦損傷后通過CBD 干預(yù)可抑制AST 激活，提高Claudin-5 表達(dá)水平，從而改善腦損傷后BBB 通透性，CBD 對改善腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。