鐘偉興，諶祖江，李俊樺，鄺珊珊，王寧，張璇，李義凱，*

1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣州 510630

骨骼肌急性鈍挫傷（acute skeletal muscle blunt trauma）指骨骼肌因外界突然直接的暴力作用造成肌纖維損害，出現(xiàn)局部腫脹瘀血，肌纖維斷裂，肌細(xì)胞溶解崩塌等，從而導(dǎo)致骨骼肌功能和結(jié)構(gòu)的不可逆損害。由于骨骼肌損傷及修復(fù)機(jī)制極其復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，尚未得到統(tǒng)一觀點(diǎn)和意見[1,2]。膏摩療法（ointment massage therapy）[3]是將中藥外用膏藥與按摩手法相結(jié)合的治療方法，是中醫(yī)外治法的重要組成部分。本團(tuán)隊(duì)從事膏摩療法對(duì)急慢性軟組織疼痛的機(jī)制研究和臨床研究，本實(shí)驗(yàn)在臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察消炎止痛膏成分對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的C2C12 骨骼肌細(xì)胞炎癥模型的影響，包括炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)，探討膏摩療法的膏藥成分對(duì)骨骼肌鈍挫傷的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) C2C12 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞所，培養(yǎng)于含DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液）的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中，隔天換液，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。

1.2 主要試劑 雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium）購(gòu)自ACMEC 公 司，DMEM/F12 培 養(yǎng) 基 購(gòu) 自 美 國(guó)Gibco 公司，馬血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，胎牛血清購(gòu)自Biological Industries，胰酶細(xì)胞消化液（含0.25%胰酶、0.02% EDTA 和酚紅）和青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自Beyotime 公司，LPS 購(gòu)自Solarbio 公司，小鼠IL-1β 和IL-6 的ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Multisciences 公司。CCK-8 試劑盒購(gòu)自Fdbio science 公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試 劑 盒 和 丙 二 醛（malondialdehyde, MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究有限公司。

1.3 主要儀器與軟件 正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon），酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)Dragon），Image-Pro Plus 6.0（美國(guó)Media Cybemetics）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C2C12 誘導(dǎo)分化模型建立 用胰酶消化增殖培養(yǎng)至80%～90%融合的C2C12 細(xì)胞，更換為分化培養(yǎng)基（含2%馬血清），置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每天更換分化培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，直至出現(xiàn)肌管，并確定最佳分化時(shí)間。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 C2C12 細(xì)胞誘導(dǎo)分化完全后，設(shè)置空白組、模型組、雙氯芬酸鈉（陽性對(duì)照藥物）組、消炎止痛膏組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。消炎止痛膏組將中藥血竭、冰片、乳香、沒藥、紅花、兒茶各稱取10 g，放置于潔凈煎藥鍋中，加雙蒸水至沒過藥材1 橫指，浸泡30 min；武火煎煮，沸騰后繼續(xù)煎煮30 min；將熬制好的藥液倒入潔凈的燒杯中，再向煎藥鍋加入適量雙蒸水，武火煎煮30 min；將兩次熬出的藥液混合，用200 目篩過濾2 次后置入坩堝；用水浴鍋蒸發(fā)直至變?yōu)楹隣钏幬铮D(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿，用保鮮膜覆蓋并戳出數(shù)孔，放置-80 ℃冰箱中冷凍24 h；將冷凍好的藥液置于真空冷凍干燥機(jī)干燥；收集凍干粉，-80 ℃密閉保存?zhèn)溆?。以上步驟在南方醫(yī)科大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室完成。凍干粉稱重，用含DMEM/F12 的完全培養(yǎng)基配成10 mg/mL 溶液，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將溶液稀釋成需要的濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

雙氯芬酸鈉組將購(gòu)置的雙氯芬酸鈉粉劑用含DMEM/F12 的完全培養(yǎng)基配成1000 μg/mL 溶液，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將溶液稀釋成需要的濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 LPS 介導(dǎo)C2C12 細(xì)胞炎癥模型建立 根據(jù)誘導(dǎo)分化模型結(jié)果，用96 孔板分化培養(yǎng)C2C12 細(xì)胞，加入LPS 溶液并分為低、中、高濃度組（0.1、1、10 μg/mL），分別作用30 min、3 h、12 h、24 h 后用CCK-8 法測(cè)定各組細(xì)胞活性，用IL-6 ELISA 試劑盒檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)IL-6 濃度，以確定LPS 致炎的最佳濃度及作用時(shí)間。

1.2.4 篩選藥物對(duì)C2C12 細(xì)胞炎癥模型最佳干預(yù)濃度 設(shè)立雙氯芬酸鈉（陽性對(duì)照藥物）組和消炎止痛膏組干預(yù)LPS 介導(dǎo)的C2C12 細(xì)胞炎癥模型。雙氯芬酸鈉濃度梯度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL，消炎止痛膏濃度梯度50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL，分別作用24 h，CCK-8 測(cè)定各組細(xì)胞活性，IL-6 ELISA 試劑盒檢測(cè)各組IL-6 濃度，確定雙氯芬酸鈉和消炎止痛膏的最佳干預(yù)濃度。

1.2.5 CCK-8 測(cè)定細(xì)胞活性 調(diào)整C2C12 細(xì)胞濃度為1×104/mL，在96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔），將孔板放置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)至貼壁后給予干預(yù)措施。每孔加入CCK-8 溶液10 μL，并重新將孔板放置培養(yǎng)箱中孵育2 h、4 h，分別用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的OD 值。根據(jù)CCK-8 說明書計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.6 ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6 含量 從孔板中吸出各組細(xì)胞培養(yǎng)基，3000 r/min 離心10 min，收集上清，即刻檢測(cè)。采用100 μL 反應(yīng)體系，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，具體操作按Multisciences 公司試劑盒說明書進(jìn)行。最后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定450 nm最大吸收波長(zhǎng)和630 nm 參考波長(zhǎng)的OD 值。校準(zhǔn)后的OD 值為450 nm 的測(cè)定值減去630 nm 的測(cè)定值。

1.2.7 檢測(cè)SOD、MDA 含量 從孔板中吸出各組細(xì)胞培養(yǎng)基，3500 r/min 離心10 min，收集上清進(jìn)行SOD、MDA 測(cè)定。取出96 孔板，按照說明書加入標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、測(cè)定孔、對(duì)照孔相應(yīng)試劑及樣品，渦旋混勻器混勻，95 ℃水浴30 min，取出冷卻，3500 r/min離心10 min，取上清，于相應(yīng)波長(zhǎng)處，用酶標(biāo)儀測(cè)定各管吸光度，并根據(jù)公式：血清MDA 含量（nmol/mL）=（測(cè)定OD-對(duì)照OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)，計(jì)算出對(duì)應(yīng)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS 22.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graph Pad Prism 8 制圖軟件制圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，各組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，非正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)、Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)）；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，比較采用Chi-square 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C2C12 細(xì)胞增殖與分化培養(yǎng)

C2C12 在含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，開始時(shí)細(xì)胞稀疏形態(tài)呈梭形；增殖過程中，細(xì)胞密度增大，形態(tài)變長(zhǎng)變細(xì)，呈纖維狀，4～5 d 后細(xì)胞基本增殖完全，未見肌管出現(xiàn)（圖1）。

圖1 增殖培養(yǎng)6、12、24 及96 h 的C2C12 細(xì)胞形態(tài)（標(biāo)尺100 μm）Fig.1 Morphology of C2C12 cells cultured for 6h, 12h, 24h and 96h (bar=100 μm)

C2C12 細(xì)胞在含2%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4～5 d 后顯微鏡下觀察到細(xì)胞變大變長(zhǎng)出現(xiàn)融合，融合漸多，形成許多有兩個(gè)以上似串珠樣細(xì)胞核的肌管，分化培養(yǎng)至第9～10 d 達(dá)高峰（圖2），之后細(xì)胞逐漸衰老死亡，細(xì)胞成片脫落[4]。

圖2 分化培養(yǎng)1、5、8 及10 d 的C2C12 細(xì)胞形態(tài)（標(biāo)尺100 μm）Fig.2 Morphology of C2C12 cells differentiated and cultured for 1d, 5d, 8d and 10d (bar=100 μm)

2.2 LPS 作用C2C12 肌管細(xì)胞最佳炎癥模型

運(yùn)用CCK-8 和IL-6 ELISA 試劑盒分別檢測(cè)0.1、1、10 μg/mL 的LPS 刺激C2C12 肌管細(xì)胞30 min、3 h、12 h、24 h，0.1 μg/mL 作用30 min 細(xì)胞活性無明顯改變（P＞0.05）；1 μg/mL LPS 作用C2C12 肌管細(xì)胞24 h炎性細(xì)胞因子IL-6 水平最高（圖3）。因此，LPS 刺激C2C12 肌管細(xì)胞的最佳時(shí)間為24 h，最佳濃度為1 μg/mL。

2.3 藥物干預(yù)最佳濃度

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，濃度低于1.25 mg/mL 的消炎止痛膏組細(xì)胞活性無明顯變化（P＞0.05），5 mg/mL 和2.5 mg/mL 消炎止痛膏組細(xì)胞活性明顯下降（P=0.005，P=0.002），因此濃度低于1.25 mg/mL 的消炎止痛膏較為安全；IL-6 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，安全濃度1.25 mg/mL 消炎止痛膏組的IL-6 濃度最低（P=0.001）（圖4A）。

圖4 不同濃度消炎止痛膏溶液（A）和雙氯芬酸鈉溶液（B）作用C2C12 肌管炎癥模型24 h 細(xì)胞活性和IL-6 表達(dá)情況Fig.4 Cell activity and IL-6 expression of C2C12 myofibers inflammation model treated with Xiaoyanzhitong Ointment solution and diclofenac sodium solution at different concentrations for 24h.A: 5.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml, 0.078125 mg/ml Xiaoyanzhitong Ointment solution solution; B: 200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 6.25 μg/ml, 3.125 μg/ml diclofenac sodium solution

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，3.125～200 μg/mL 雙氯芬酸鈉組細(xì)胞活性無明顯變化（P＞0.05）；IL-6 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6.25 μg/mL 雙氯芬酸鈉組的IL-6 濃度最低（P=0.077）（圖4B）。

2.4 消炎止痛膏對(duì)C2C12 肌管影響

與模型組比較，1.25 mg/mL 消炎止痛膏顯著抑制LPS 誘 導(dǎo) 的C2C12 肌 管 細(xì) 胞 的IL-1β（P=0.006）和MDA 水平（P=0.002），提高SOD 水平（P=0.0001）；與雙氯芬酸鈉組比較，1.25 mg/mL 消炎止痛膏抑制LPS誘導(dǎo)的C2C12 肌管IL-1β 水平無顯著性差異（P=0.188），但提高SOD（P=0.0001）和抑制MDA 水平（P=0.014）的效果有顯著性差異（圖5）。

圖5 不同濃度消炎止痛膏（2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 mg/mL）和雙氯芬酸鈉（6.25 μg/mL）作用C2C12 肌管炎 癥 模 型24 h 的IL-1β、SOD和MDA 水平A：ELISA 檢 測(cè) 各 組 細(xì) 胞IL-1β 水平 B：各組細(xì)胞SOD 含量 C：各組細(xì)胞MDA 含量Fig.5 Different concentrations of anti-inflammatory pain relief ointment (2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml) and diclofenac sodium (6.25 μg/ml),the levels of IL-1β, SOD and MDA in C2C12 myofibers inflammation model for 24h A: Cell IL-1β level in each group detected by ELISA; B: SOD level in each group; C:MDA levels in each group

3 討論

本團(tuán)隊(duì)從事膏摩療法對(duì)急慢性軟組織疼痛的機(jī)制研究和臨床研究，前期臨床研究表明以消炎止痛膏為代表的膏摩療法對(duì)軟組織損傷患者有良好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)在臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過建立LPS 誘導(dǎo)的C2C12 肌管炎癥模型[5]，觀察不同濃度的消炎止痛膏溶液對(duì)LPS誘導(dǎo)的C2C12 肌管致炎過程中的炎癥水平和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，探討膏摩療法的膏藥成分對(duì)骨骼肌鈍挫傷可能的療效機(jī)制。研究表明，合適濃度的消炎止痛膏溶液可降低C2C12 肌管的IL-1β、IL-6 和MDA 水平，提高SOD 水平。

骨骼肌急性鈍挫傷，造成損傷局部腫脹瘀血，肌纖維斷裂，肌細(xì)胞溶解崩塌，從而導(dǎo)致局部組織炎癥反應(yīng)劇烈。研究表明，骨骼肌損傷和修復(fù)是非常復(fù)雜的過程，包括逐步的壞死和凋亡、炎癥反應(yīng)、纖維化與肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、血管再生[2,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，合適濃度的消炎止痛膏溶液可降低C2C12 肌管的IL-1β 和IL-6 水平，從而減輕炎癥反應(yīng)對(duì)C2C12 的損害。

機(jī)體內(nèi)氧化劑與抗氧化劑不平衡所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激具有雙刃劍作用[7]，低中水平自由基具有充當(dāng)分子信號(hào)調(diào)節(jié)系列生理過程的作用，如維持血管張力、抵御感染、控制通氣等。同時(shí)自由基也是脂質(zhì)、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)及DNA 等細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的中介，可產(chǎn)生次級(jí)反應(yīng)物，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死、凋亡，最終導(dǎo)致發(fā)病。本研究通過對(duì)LPS 誘導(dǎo)的C2C12 肌管癥模型SOD 和MDA 含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，合適濃度的消炎止痛膏溶液可提高C2C12 肌管細(xì)胞的SOD 含量，降低MDA 含量，從而減少氧化應(yīng)激對(duì)C2C12 的損害，促進(jìn)損傷修復(fù)。

綜上所述，消炎止痛膏成分可降低LPS 誘導(dǎo)的C2C12 肌管炎癥模型IL-1β、IL-6 和MDA 水平，提高SOD 水平，可能與減輕組織炎癥反應(yīng)、降低機(jī)體氧化應(yīng)激損害有關(guān)。本研究存在一些不足之處，如未開展藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等。此外，可運(yùn)用細(xì)胞力學(xué)刺激模擬細(xì)胞層面的膏摩療法等。