嚴(yán)園園 楊凌辰 丁 茹 許月欣 經(jīng) 莉

子宮內(nèi)膜癌是一種來自子宮內(nèi)膜的異質(zhì)性腫瘤,具有不同的組織學(xué)類型,是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的婦科惡性腫瘤,5年內(nèi)生存率為53%[1]。其發(fā)生率和相關(guān)病死率逐漸上升,且呈年輕化趨勢(shì)[2,3]。因此,開發(fā)新的生物學(xué)標(biāo)志物已成為子宮內(nèi)膜癌診斷和治療的主要手段。

泛素結(jié)合酶E2T(ubiquitin binding enzyme E2T,UBE2T)是E2家族的一員,在范可尼貧血中被發(fā)現(xiàn),UBE2T與FANCL的結(jié)合促進(jìn)了FANCD2的單二肽化,參與DNA損傷的修復(fù)[4]。此外,UBE2T已被報(bào)道在多種癌癥類型中表達(dá)上調(diào),包括肺癌、視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、乳腺癌和前列腺癌[5～8]。目前,關(guān)于UBE2T在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)鮮有報(bào)道,本研究主要探討UBE2T是否可以成為子宮內(nèi)膜癌潛在生物學(xué)標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)。

材料與方法

1.樣本來源:實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)的樣本采集自徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2021年7月～2022年8月因子宮內(nèi)膜癌行手術(shù)治療的組織58例。取同期因子宮良性病變行全子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織30例,-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。用于免疫組化標(biāo)本來自于2015年1月～2017年6月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的108例子宮內(nèi)膜癌組織,35例正常子宮內(nèi)膜組織及35例不典型增生子宮內(nèi)膜組織的組織蠟塊。

2.一般資料:108例子宮內(nèi)膜癌患者年齡為41～73歲,平均年齡為56歲。根據(jù)FIGO 2009年臨床分期:Ⅰ期51例,Ⅱ～Ⅳ期57例;高分化57例,中分化+低分化51例。納入標(biāo)準(zhǔn):①病理切片確診為子宮內(nèi)膜癌;②臨床病理資料完整;③所有患者手術(shù)治療后均可進(jìn)行門診或電話隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他內(nèi)外科疾病;②合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤;③來自于生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌;④術(shù)前行放化療及內(nèi)分泌治療。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):XYFY2022-KL222),樣本量收集取得患者知情同意。

3.主要試劑:兔抗人UBE2T多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;RT-qPCR試劑盒購自康美生物科技有限公司;UBE2T引物序列及內(nèi)參引物序列均由康美生物科技公司設(shè)計(jì)合成。

4.生物信息學(xué)分析:從TCGA數(shù)據(jù)庫中對(duì)獲得的35例正常子宮內(nèi)膜癌組織和519例子宮內(nèi)膜癌組織數(shù)據(jù)進(jìn)行UBE2T mRNA的差異表達(dá)分析;并對(duì)其中配對(duì)的22例子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織進(jìn)行比較。

5.RT-qPCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中UBE2T mRNA表達(dá)水平:取子宮內(nèi)膜癌組織58例及正常子宮內(nèi)膜組織30例,用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RNA濃度的測(cè)定,將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件:①預(yù)變性95℃、5min;②40個(gè)循環(huán),95℃ 30s,95℃ 5s,60℃ 30s。以GAPDH作為內(nèi)參,以2-ΔΔCt值計(jì)算UBE2T mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

6.免疫組化法檢測(cè)UBE2T蛋白表達(dá):實(shí)驗(yàn)步驟:①石蠟切片標(biāo)本脫蠟水化(60min);②抗原修復(fù)(15min);③3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性(10min);④加一抗4℃孵育過夜,加二抗(50min);⑤二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色;⑥復(fù)染細(xì)胞核;⑦脫水封片;⑧結(jié)果判讀。UBE2T主要在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。由兩名病理科醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行顯微鏡下判讀。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400),每個(gè)視野共計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,陽性細(xì)胞數(shù)百分比<5%計(jì)0分,5%～25%計(jì)1分,25%～50%計(jì)2分,50%～75%計(jì)3分,≥75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度:無著色計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,深黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分。根據(jù)染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比的結(jié)果作為最終得分:<3分記陰性,≥3分記陽性。

7.隨訪信息:對(duì)108例子宮內(nèi)膜癌患者通過門診、電話等多種方式隨訪,隨訪時(shí)間為6～60個(gè)月,截止時(shí)間為2020年6月,其中失訪13例,死亡21例。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜中UBE2T的相對(duì)表達(dá)量比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析。UBE2T在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,進(jìn)行生存分析;采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.子宮內(nèi)膜癌中UBE2T的表達(dá)情況:在TCGA網(wǎng)站下載的數(shù)據(jù)信息中包含了519例子宮內(nèi)膜癌和35例正常子宮內(nèi)膜癌,UBE2T在子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.001), 詳見圖1。其中子宮內(nèi)膜癌及其配對(duì)的癌旁組織中在子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.001), 詳見圖2。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中UBE2T在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)情況

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中22例配對(duì)子宮內(nèi)膜正常組織與子宮內(nèi)膜癌組織中UBE2T的表達(dá)情況

2.UBE2T mRNA在子宮內(nèi)膜癌中相對(duì)表達(dá)情況:RT-qPCR檢測(cè)58例子宮內(nèi)膜癌與30例正常子宮內(nèi)膜中UBE2T mRNA的表達(dá)水平差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中UBE2T mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別是1.07±0.44、2.70±0.78,子宮內(nèi)膜癌組織表達(dá)量高于正常子宮內(nèi)膜組織表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.532,P<0.01)。

3.不同子宮內(nèi)膜組織中UBE2T蛋白表達(dá)情況:UBE2T在正常子宮內(nèi)膜中的陽性率為17.1%(6/35)、在子宮內(nèi)膜不典型增生陽性率為42.9%(15/35)、在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性率為63.0%(68/108),3組數(shù)據(jù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.462,P<0.05)。進(jìn)一步組間兩兩比較顯示,子宮內(nèi)膜癌組中的陽性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮增殖期內(nèi)膜組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4.子宮內(nèi)膜癌組織中UBE2T的陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:在子宮內(nèi)膜癌組織中,UBE2T陽性表達(dá)在臨床分期、組織分化程度方面比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)在子宮內(nèi)膜癌組織中UBE2T陽性表達(dá)情況[n(%)]

5.UBE2T蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系:采用Kaplan-Meier生存分析方法,UBE2T表達(dá)陽性和陰性患者的5年生存率分別為73.5%和92.5%,UBE2T陰性患者生存時(shí)間高于陽性者(P<0.05),詳見圖3。

圖3 UBE2T表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

6.子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后相關(guān)因素:單因素COX回歸分析結(jié)果顯示,年齡(P=0.472)、組織分化程度(P=0.058)、肌層浸潤(rùn)深度(P=0.070)與預(yù)后無關(guān),而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=11.567,P<0.05)、FIGO分期(HR=7.479,P=0.006)、UBE2T(HR=4.300,P=0.038)是預(yù)后的影響因素,詳見表2。將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期及UBE2T納入COX模型進(jìn)行多因素分析,最終篩選結(jié)果顯示,FIGO分期高(HR=2.521,P=0.026)及UBE2T陽性表達(dá)(HR=2.139,P=0.032)是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,詳見表3。

表2 單因素COX回歸分析預(yù)后的影響因素

表3 多因素COX回歸分析預(yù)后的影響因素

討 論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)是真核細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解途徑,包含6種成分,即蛋白酶體、泛素(Ub)、泛素激活酶(E1)、泛蛋白結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)和去泛素酶[9]。E2是泛素(Ub)遞送的載體,是UPS中的重要組成部分[10]。主要通過泛素化和去泛素化發(fā)揮作用[11]。泛素化可能改變蛋白質(zhì)的位置、功能和活性,參與各種生物過程和信號(hào)通路,調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的過程,包括細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、凋亡和免疫反應(yīng)[12]。

UBE2T作為E2家族的一員,也稱為HSPC150,是一個(gè)典型的包含UBC結(jié)構(gòu)域的E2,它?？吭贓3的環(huán)指或HECT結(jié)構(gòu)域上,促進(jìn)底物泛素化[13]。體外實(shí)驗(yàn)證明,UBE2T在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[5～8]。本研究前期通過TCGA數(shù)據(jù)庫獲取子宮內(nèi)膜癌UBE2T mRNA表達(dá)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)UBE2T在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)。提示其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。故本研究擬進(jìn)一步探究UBE2T在子宮內(nèi)膜癌中的作用,采用RT-qPCR及免疫組化法檢測(cè)了子宮內(nèi)膜癌組織、不典型增生子宮內(nèi)膜組織以及正常子宮內(nèi)膜組織UBE2T相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),UBE2T表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá),與TCGA數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果一致。因此,推測(cè)UBE2T可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程。越來越多的證據(jù)表明,UBE2T參與了不同類型腫瘤的致癌,且與腫瘤大小、惡性程度、轉(zhuǎn)移和腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān),UBE2T高表達(dá)與胃癌及肝癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[14,15]。本研究結(jié)果顯示,UBE2T高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示UBE2T可能在促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展、發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

UBE2T在子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制及途徑目前尚未明確。有研究表明,UBE2T通過泛素化降解RACK1的賴氨酸K172、K225和K257位點(diǎn),激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)胃癌進(jìn)展[16]。在肺癌中,UBE2T介導(dǎo)自噬過程中參與了p53/AMPK/mTOR信號(hào)通路,證明UBE2T通過該機(jī)制誘導(dǎo)自噬[17]。在卵巢癌中,UBE2T可通過PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,并在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用,與BRCA相互作用影響卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[18]。UBE2T通過激活GRP78/FAK信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌干細(xì)胞特性并發(fā)揮致癌作用[19]。敲低UBE2T可抑制骨肉瘤增殖和侵襲[20]。此外,既往研究表明,癌細(xì)胞的藥物易損性依賴于蛋白質(zhì)參與泛素化和降解,如UBE2T在肺癌中過表達(dá),并與化療藥物耐藥有關(guān)[21,22]。因此,UBE2T可能被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌患者潛在的藥物靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,與UBE2T低表達(dá)組比較,UBE2T高表達(dá)組預(yù)后較差。此外,多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,FIGO分期和UBE2T表達(dá)情況是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。

綜上所述,UBE2T高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),往往提示預(yù)后不良。因此,UBE2T有望成為子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后的指標(biāo)。本研究?jī)H從臨床角度探究其表達(dá)意義,其是否能調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲、遷移及增殖仍需開展進(jìn)一步研究予以證實(shí)。