丁胤彰 王 凱 李鐘鳴 李巖松 許 迪

人口老齡化已是當(dāng)前社會(huì)不可忽視的問(wèn)題,我國(guó)第七次人口普查資料顯示,2020年我國(guó)60歲及以上老年人口數(shù)量增至2.64億人,人口老齡化水平升至18.70%[1]。至2018年,心血管疾病的病死率仍居首位,高于腫瘤及其他疾病,而心血管疾病最大的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是心臟衰老[2,3]。隨著年齡的增長(zhǎng),心臟不可避免地發(fā)生衰老。心臟在衰老過(guò)程中其功能、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞及分子水平發(fā)生一系列變化,突出表現(xiàn)為病理性心肌重構(gòu)、心律失常、收縮和舒張功能障礙、微循環(huán)功能障礙、心肌細(xì)胞代謝失調(diào)、心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞纖維化、心肌細(xì)胞丟失、錯(cuò)誤折疊蛋白堆積、線粒體功能失調(diào)、鈣通道活性降低和交感神經(jīng)活性增強(qiáng)等[3～6]。已有研究顯示,冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心肌肥厚、心房顫動(dòng)、心力衰竭等心血管病的發(fā)生率均隨年齡的增長(zhǎng)而升高[5～7]。因此,探究心臟衰老的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)防治心血管疾病及改善老年人群生活質(zhì)量有著重要意義。

生物信息學(xué)是伴隨著人類基因組計(jì)劃而產(chǎn)生的一門涉及生物學(xué)、數(shù)學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的交叉學(xué)科,旨在綜合運(yùn)用多種學(xué)科理論及工具闡明和解讀海量生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義[8]。目前心臟衰老的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究,運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,可為研究心臟衰老的分子機(jī)制提供新的思路。本研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)下載并分析數(shù)據(jù)集GSE8146,以獲得年輕小鼠和老年小鼠心臟中的差異表達(dá)基因,對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,并構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)獲得關(guān)鍵基因,以進(jìn)一步了解心臟衰老的分子機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.獲取基因芯片信息與差異表達(dá)基因:從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇基于GPL81平臺(tái)的GSE8146芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,其中包括年輕(5月齡)小鼠心臟標(biāo)本GSM201691、GSM201733、GSM201734、GSM201736、GSM201737以及老年(30月齡)小鼠心臟標(biāo)本GSM201741、GSM201753、GSM201767、GSM201768、GSM201770。利用R軟件的limma程序篩選差異表達(dá)基因,篩選條件為|log2FC|>1(差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)2倍以上)且P<0.05。根據(jù)篩選出的差異表達(dá)基因繪制熱圖、火山圖,并將所得的差異表達(dá)基因?qū)氡砀裰小?/p>

2.差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析:使用DAVID 6.8在線分析工具,將上述差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。導(dǎo)出后篩選出P<0.05的結(jié)果,利用微生信平臺(tái)(在線數(shù)據(jù)分析和可視化平臺(tái))繪制水平柱狀圖。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度,選取排名前5位的GO生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能和KEGG信號(hào)通路并利用微生信平臺(tái)繪制氣泡圖。

3. 差異表達(dá)基因間的PPI分析:通過(guò)STRING 11.5在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI,PPI評(píng)分設(shè)置為0.4,保存PPI網(wǎng)絡(luò)圖及結(jié)果文件,利用R軟件將關(guān)鍵基因依照degree值(度)進(jìn)行排序,并利用微生信平臺(tái)繪制水平柱狀圖。

結(jié) 果

1.年輕小鼠與老年小鼠心臟的差異表達(dá)基因:從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE8146芯片數(shù)據(jù)與GPL81平臺(tái)數(shù)據(jù),共20個(gè)樣本。篩選后獲得5例年輕小鼠與5例老年小鼠心臟組織基因。利用R軟件進(jìn)行相關(guān)分析,獲取兩者間差異基因55個(gè),包括上調(diào)基因22個(gè),下調(diào)基因33個(gè),繪制熱圖(圖1A)與火山圖(圖1B)。

2.差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析結(jié)果:使用DAVID 6.8在線分析工具,根據(jù)上述差異表達(dá)基因,進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。其中生物過(guò)程有24個(gè),細(xì)胞成分有7個(gè),分子功能有8個(gè)(圖2A),KEGG信號(hào)通路有5條(圖3)。GO功能富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因顯著富集于脂質(zhì)代謝過(guò)程、脂肪酸代謝過(guò)程、對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)、磷酸化、對(duì)活動(dòng)的反應(yīng)等生物過(guò)程,差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞質(zhì)、線粒體、線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞外組分、細(xì)胞外間隙等細(xì)胞成分;差異表達(dá)基因在分子功能中的富集,包括相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、核苷酸結(jié)合、催化活性、蛋白激酶活性等(圖2B)。差異表達(dá)基因顯著富集KEGG信號(hào)通路有過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)信號(hào)通路、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、胰高血糖素信號(hào)通路和代謝通路。

圖2 GO功能富集分析A.水平柱狀圖;B.氣泡圖

圖3 KEGG信號(hào)通路富集分析

3.差異表達(dá)基因間的PPI分析結(jié)果:使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI分析。在PPI網(wǎng)絡(luò)中,有30個(gè)節(jié)點(diǎn),141條邊(圖4),其中degree值(度)最高的差異基因位分別是Fasn、Pck1、Adipoq、Cpt1a、Pdk4、Pnpla2、Slc27a1、Hmgcs2、Cidec和Ucp3(圖5)。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

圖5 關(guān)鍵基因

討 論

心臟的衰老主要體現(xiàn)在心肌細(xì)胞進(jìn)行性肥大、心肌纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。此外,在心臟衰老過(guò)程中細(xì)胞凋亡增多,促進(jìn)了心肌細(xì)胞丟失增加[9]。然而,心臟衰老的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究選取了5例年輕小鼠和5例老年小鼠心臟組織中的基因表達(dá)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,共篩選出55個(gè)差異表達(dá)基因,包括22個(gè)在老年小鼠心臟中上調(diào)的基因和33個(gè)在老年小鼠心臟中下調(diào)的基因;差異表達(dá)基因富集的通路主要是PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、胰高血糖素信號(hào)通路和代謝通路;PPI分析中的關(guān)鍵基因?yàn)镕asn、Pck1、Adipoq、Cpt1a、Pdk4、Pnpla2、Slc27a1、Hmgcs2、Cidec和Ucp3。

KEGG富集分析顯示,差異表達(dá)基因主要富集在PPAR信號(hào)通路與AMPK信號(hào)通路。PPAR是一類配體依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,亞型包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。PPAR具有控制心肌細(xì)胞的能量代謝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌細(xì)胞肥大、抗心肌纖維化、抗炎等作用[10]。PPARα在心臟的脂肪酸代謝中起著重要作用,抑制PPARα的表達(dá)可導(dǎo)致線粒體脂肪酸代謝受損,從而加速心臟衰老[11]。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,由1個(gè)催化亞基(α)和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β,γ)組成。AMPKα2亞基在心肌細(xì)胞中大量表達(dá),它參與多種細(xì)胞過(guò)程以防止心肌肥厚。研究表明,調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路可減輕負(fù)荷過(guò)重誘導(dǎo)的心肌纖維化[12]。而激活A(yù)MPK/JNK信號(hào)通路可通過(guò)減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體依賴性凋亡來(lái)改善心功能[13]。這些證據(jù)表明,PPAR信號(hào)通路與AMPK信號(hào)通路均可能在心臟衰老的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),獲得Fasn、Pck1、Adipoq、Cpt1a、Pdk4、Pnpla2、Slc27a1、Hmgcs2、Cidec、Ucp3等關(guān)鍵基因。Fasn是缺氧誘導(dǎo)基因,在心血管疾病中心排出量的減少和供氧的不足可致Fasn上調(diào)。與此同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),Fasn的單一表達(dá)便足以引發(fā)心力衰竭。因此,Fasn的上調(diào)可能是心臟衰老相關(guān)心力衰竭的早期致病事件[14]。Pck1是糖異生調(diào)控的主要控制點(diǎn)。該基因編碼的胞質(zhì)酶和GTP催化草酰乙酸生成磷酸烯醇丙酮酸,釋放二氧化碳和GDP。據(jù)研究報(bào)道,Pck1上調(diào)可能與纖維化相關(guān)[15]。但仍需要開展進(jìn)一步研究其與心肌纖維化、心臟衰老的相關(guān)性。

Adipoq基因編碼合成脂聯(lián)素,脂聯(lián)素是一種多功能的脂肪細(xì)胞因子,可延緩心臟擴(kuò)大、心肌纖維化和左心室功能障礙的發(fā)生、發(fā)展[16]。研究表明,脂聯(lián)素能顯著抑制促炎基因和致動(dòng)脈粥樣硬化基因的表達(dá),同時(shí)增加抗炎性細(xì)胞因子在動(dòng)脈壁中的表達(dá)[17]。故Adipoq可能通過(guò)多種途徑抑制心臟衰老的發(fā)生、發(fā)展。PPARα可調(diào)控參與脂肪酸和葡萄糖氧化的下游基因,如Cpt1a和Pdk4;前者負(fù)責(zé)將脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)骄€粒體進(jìn)行β-氧化,后者是葡萄糖氧化過(guò)程中的負(fù)調(diào)控酶,以此改善心肌代謝從而減輕心肌肥厚,提示其可能與延緩心臟衰老相關(guān)[18]。

Haemmerle等[19]研究顯示,Pnpla2敲除小鼠的心肌中甘油三酯大量沉積,表現(xiàn)為心肌肥厚和間質(zhì)纖維化,最終死于心力衰竭。另外,可觀察到心肌細(xì)胞中脂滴的數(shù)量和大小也的確隨著年齡的增長(zhǎng)而增加,表明Pnpla2在心臟衰老的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn),Slc27a1過(guò)表達(dá)的小鼠心臟會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂繼而導(dǎo)致舒張功能障礙。此外,通過(guò)抑制Slc27a1的表達(dá)可以減少巨噬細(xì)胞中總游離脂肪酸和甘油三酯的累積。因此,Slc27a1可能與心臟衰老過(guò)程中的舒張功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。Hmgcs2是酮體合成的速率控制酶。近年來(lái)有研究顯示,抑制Hmgcs2的表達(dá)可減輕脂質(zhì)沉積引起的心肌肥厚和纖維化[21]。由此推測(cè),Hmgcs2可能通過(guò)調(diào)節(jié)代謝參與衰老過(guò)程中的心肌肥大與纖維化。Ucp3具有抗活性氧生成、保護(hù)線粒體及減少心肌細(xì)胞凋亡等作用,與心肌細(xì)胞衰老有著密切聯(lián)系[22]。目前尚無(wú)研究顯示Cidec與心臟衰老的關(guān)系,需進(jìn)一步研究以驗(yàn)證其相關(guān)性。

綜上所述,Fasn、Pck1、Adipoq、Cpt1a、Pdk4、Pnpla2、Slc27a1、Hmgcs2、Ucp3等基因及PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路等可能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝,在心臟衰老的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究為今后對(duì)心臟衰老分子調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ),以此研發(fā)新的延緩心臟衰老的藥物,將有助于對(duì)老年人群心血管疾病的診治。