曹越 高帥 羅剛 趙水炎 唐雅琪 杜占慧 泮思林

（青島大學附屬婦女兒童醫(yī)院心臟中心，山東青島 266034）

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一種急性全身性非特異性血管炎，1967 年由日本醫(yī)生川崎富作首次報道，主要臨床特征包括發(fā)熱、皮疹、頸部淋巴結非化膿性腫大等癥狀［1］。KD 最嚴重的并發(fā)癥是冠狀動脈損傷（coronary artery lesion, CAL），如未得到及時有效的治療，CAL 的發(fā)生率可高達15%～25%，即使接受靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin, IVIG）及阿司匹林治療，CAL 的風險仍高達4%［2］。長期以來，對KD所致CAL 形成的病理生理學過程中分子機制尚未明確了解。持續(xù)性的亞急性和慢性血管炎可導致長期的血管改變和重塑，炎癥對KD血管內(nèi)皮細胞造成嚴重和持續(xù)的損害可能是重要原因［3］。因此，深入了解KD的血管內(nèi)皮細胞炎性損傷機制，是防治KD早期CAL的關鍵領域之一。

殼多糖酶3 樣蛋白1（chitinase 3-like protein 1,CHI3L1）是一種炎癥性糖蛋白，在急性、慢性和亞臨床炎癥條件下由各種細胞分泌［4］。據(jù)報道，血清CHI3L1 水平升高參與調(diào)節(jié)多個關鍵生物過程，包括炎癥激活、氧化損傷及細胞凋亡等［5］。CHI3L1 在多種炎癥性疾病中都發(fā)揮著重要作用，多項研究證實，CHI3L1 可能通過介導炎性損傷參與冠狀動脈粥樣硬化的進展情況［6-8］。然而，目前尚未明確CHI3L1 是否在KD 患兒CAL 的發(fā)生、發(fā)展中起作用。本研究旨在分析干酪乳桿菌細胞壁成分（Lactobacillus caseicell wall extract, LCWE）誘導下的KD 樣血管炎小鼠模型中CHI3L1 的表達情況，初步探討CHI3L1 在KD 所致CAL 中的作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

CP100NX 超速離心機購于日本Himac 公司，超聲破碎儀購于寧波新芝生物科技股份有限公司，多功能酶標儀購于美國Perkin Elmer 股份有限公司。干酪乳桿菌菌種購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，糖類總量定量檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，十二烷基硫酸鈉（SDS）、核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ）、胰蛋白酶、MRS 肉湯培養(yǎng)基購于北京索萊寶科技有限公司，軟骨糖蛋白39（CHI3L1）檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法）購于武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗CHI3L1、鼠抗Bcl-2 抗體購于英國Affinity 公司，鼠抗α-SMA、兔抗α-SMA、鼠抗VE cadherin、兔抗Bax、兔抗Caspase-3 抗體購于美國Abcam 公司，兔抗NF-κB、兔抗p-NF-κB 抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司，鼠抗CHI3L1、兔抗vWF、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG 購于武漢三鷹生物技術有限公司，鼠抗β-tubulin 抗體購于上海Abmart 公司，Alexa Fluor 488 標記羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 647 標記羊抗兔IgG 購于美國Abcam公司。

1.2 萃取LCWE

根據(jù)文獻提供的造模方法［9］，將干酪乳桿菌菌種接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37°C厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h，經(jīng)離心和棄去上清的步驟，得到菌體沉淀物。向沉淀物中加入4% SDS 并在室溫過夜，隨后進行離心和洗滌，去除SDS及細菌碎片，再次得到沉淀物。向其中依次分別加入RNase、DNaseⅠ、胰蛋白酶消化處理，每一步消化后離心棄去上清，最后用PBS重懸沉淀，經(jīng)超聲破碎和超速離心處理后，取上清即為LCWE。使用糖類總量定量檢測試劑盒測定LCWE 含量，調(diào)整濃度為1 mg/mL，用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗動物的分組與處理

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠20 只，4 周齡，體重20～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［動物合格證號：SCXK（魯）20200009］。本研究已經(jīng)通過青島大學倫理委員會審核批準（動物實驗倫理號：202304C5712202306069）。所有小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將實驗動物按隨機數(shù)目表法分配原則分為正常對照組及模型組，每組10 只。模型組小鼠單次腹腔注射LCWE 0.5 mL，對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。分別在注射完后的第3天、第7 天和第14 天觀察小鼠的一般情況，并在第14天時對小鼠進行稱重。

1.4 樣品收集

兩組小鼠完成腹腔注射14 d后，采用4%水合氯醛溶液（0.1 mL/10 g）腹腔注射對小鼠進行麻醉，腹主動脈取血0.5 mL，2 000 r/min離心20 min，分離血清，置于-80°C保存，用于后續(xù)生化指標檢測。處死小鼠，在解剖板上固定小鼠四肢，沿前正中線剪開皮膚，依次剖開胸腔、腹腔，分離取出心臟組織與脾臟組織，在大體顯微鏡下，小心夾取冠狀動脈根部，從心臟表面緩慢逆行剝脫冠狀動脈組織。一部分冠狀動脈組織及脾臟組織采用4%多聚甲醛溶液進行固定，置于室溫保存，行組織病理學檢測；另一部分冠狀動脈組織置于-80°C冰箱凍存，以備后續(xù)實驗使用。

1.5 蘇木精-伊紅染色

取小鼠冠狀動脈組織及脾臟組織樣品后經(jīng)梯度濃度乙醇脫水，再置于二甲苯溶液中透明，之后置于石蠟中包埋。將其切成厚度為3～5 μm 的切片，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色，在光學顯微鏡下觀察，采集圖像并分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法

取出-80°C中保存的小鼠血清，按說明書要求進行檢測，根據(jù)標準曲線和吸光度（OD）值計算CHI3L1含量。

1.7 免疫熒光染色

采用免疫熒光雙染色法通過標記α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）來檢測各組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)皮標記物血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）和CHI3L1的表達。冠狀動脈組織經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，石蠟切片脫蠟前需放在60°C恒溫箱中烘烤2 h，經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復后，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育20 min，10%正常羊血清室溫封閉20 min，分別加入一抗鼠抗CHI3L1（1∶100）、兔抗α-SMA（1∶100）和兔抗vWF（1∶100）、鼠抗α-SMA（1∶200）4℃孵育過夜，次日對應加入二抗Alexa Fluor 647 標記羊抗兔IgG （1∶100）、Alexa Fluor 488 標記羊抗鼠IgG（1∶100）室溫避光孵育2 h，滴上DAPI染色，用載玻片封片，在正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 Western blot檢測

取-80°C中保存的冠狀動脈組織，研磨后加入組織裂解液，離心后取上清液并使用BCA 法測定蛋白濃度。取待測蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后封閉，分別加入一抗兔抗CHI3L1（1∶1 000）、兔抗vWF （1∶1 000）、鼠抗VE cadherin（1∶1 000）、兔抗Bax（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、兔抗Caspase-3（1∶1 000）、兔抗NF-κB（1∶1 000）、兔抗p-NF-κB（1∶1 000）、鼠抗β-tubulin（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日對應加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000）、山羊抗鼠IgG （1∶2 000） 室溫孵育1 h，ECL 顯影。用Image J 分析軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白β-tubulin 灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗獨立重復至少3次。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠一般情況

腹腔注射LCWE 3 d 后，與對照組相比，模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯，反應遲緩，飲食能力下降；7 d 后有個別小鼠肢端出現(xiàn)充血腫脹，鼠尾壞死。模型組小鼠體重［（21.0±0.8） g］ 較對照組［（24.2±1.5）g］下降（t=6.025，P＜0.001，n=10）。

2.2 冠狀動脈及脾臟組織HE染色結果

對照組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮細胞排列整齊，周圍無炎性細胞浸潤；而模型組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜欠光滑，內(nèi)皮細胞排列紊亂，周圍有大量炎性細胞浸潤。對照組小鼠脾小體結構完整，未見增生；而模型組小鼠脾臟組織中出現(xiàn)脾小體增生、融合。見圖1。

圖1 冠狀動脈及脾臟組織HE染色結果（光學顯微鏡；n=4） 對照組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮細胞排列整齊，周圍無炎性細胞浸潤。模型組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜欠光滑，內(nèi)皮細胞排列紊亂，周圍有大量炎性細胞浸潤。對照組小鼠脾小體結構完整，未見增生。模型組小鼠脾臟組織中出現(xiàn)脾小體增生、融合。

2.3 兩組小鼠血清中CHI3L1含量比較

模型組血清CHI3L1含量［（4.0±0.7）ng/mL］較對照組［（1.9±0.5）ng/mL］顯著升高（t=7.192，P＜0.001，n=8）。

2.4 兩組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1 和vWF 蛋白在內(nèi)皮細胞中的定位與變化

免疫熒光染色結果顯示，紅色為vWF 染色，綠色為α-SMA染色，藍色為DAPI染色。α-SMA是血管平滑肌的標志物之一，可有效定位血管的結構和分布情況。模型組小鼠冠狀動脈組織中vWF表達較對照組降低。見圖2。

圖2 兩組小鼠冠狀動脈組織中vWF表達（正置熒光顯微鏡，×40；n=4） 紅色為vWF染色，對照組可見明顯紅色熒光，模型組紅色熒光表達不明顯；綠色為α-SMA染色，兩組均可見明顯綠色熒光；藍色為DAPI核染色。模型組小鼠冠狀動脈組織中vWF表達較對照組降低。

免疫熒光染色結果顯示，綠色為CHI3L1染色，紅色為α-SMA染色，藍色為DAPI染色。模型組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1表達較對照組升高。見圖3。

圖3 兩組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1表達（正置熒光顯微鏡，×40；n=4） 綠色為CHI3L1染色，對照組綠色熒光不明顯，模型組可見明顯綠色熒光；紅色為α-SMA染色，兩組可見明顯紅色熒光；藍色為DAPI核染色。模型組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1表達較對照組升高。

2.5 兩組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1 及內(nèi)皮標志物蛋白的表達

Western blot 結果顯示，與對照組相比，模型組冠狀動脈組織中CHI3L1 蛋白表達水平升高（P＜0.05），而內(nèi)皮標志物蛋白vWF 及VE cadherin 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見表1、圖4。

圖4 兩組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1及內(nèi)皮標志物蛋白表達條帶圖

2.6 兩組小鼠冠狀動脈組織中細胞凋亡相關蛋白的表達

Western blot 結果顯示，與對照組相比，模型組冠狀動脈組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見表2、圖5。

表2 兩組小鼠冠狀動脈組織中細胞凋亡相關蛋白表達水平比較 （xˉ±s，n=6）

圖5 兩組小鼠冠狀動脈組織中細胞凋亡相關蛋白表達條帶圖

2.7 兩組小鼠冠狀動脈組織中NF-κB、p-NF-κB蛋白的表達水平變化

Western blot 結果顯示，與對照組（0.45±0.09）比較，模型組（0.81±0.06）冠狀動脈組織中NFκB蛋白表達水平升高（t=5.851，P=0.004，n=6）；與對照組（0.37±0.15）比較，模型組（1.69±0.12）冠狀動脈組織中p-NF-κB 蛋白表達水平升高（t=11.996，P＜0.001，n=6）。見圖6。

圖6 兩組小鼠冠狀動脈組織中NF-κB、p-NF-κB蛋白表達條帶圖

3 討論

KD 是一種以發(fā)熱為主要癥狀的全身性血管炎性疾病，常見于5 歲以下的兒童［10］。該疾病常引起冠狀動脈擴張甚至冠狀動脈瘤的形成，并可導致遠期的心血管后遺癥。在西方發(fā)達國家及我國大部分地區(qū)，CAL 已成為后天獲得性心臟病的主要病因［11］。盡管目前IVIG 被廣泛用于KD 患兒，10%～20%的KD 患兒對IVIG 治療無應答，仍有進展為CAL的風險［12］。近年來，針對KD冠狀動脈內(nèi)皮細胞損傷的機制研究成為防治KD血管并發(fā)癥的理想策略。炎性介質（如白細胞介素1、白細胞介素6、腫瘤壞死因子α 和NF-κB）促進炎癥和組織破壞，已成為KD患者CAL中發(fā)生內(nèi)皮細胞功能障礙的重要因素［13］。因此，探討KD相關炎性因子的作用機制，對精準抗炎治療和改善CAL 的預后尤為重要。

CHI3L1 屬于糖苷水解酶家族18，也被稱為YKL-40［14］。該蛋白能夠結合殼聚糖、肝素和透明質酸，并受到細胞外基質變化、細胞因子、生長因子、藥物以及應激的調(diào)控。CHI3L1 由多種細胞產(chǎn)生和分泌，包括巨噬細胞、中性粒細胞和平滑肌細胞等［15］。此外，CHI3L1在多種心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，如冠狀動脈粥樣硬化和巨細胞動脈炎等［16］。Kwon 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1在冠狀動脈粥樣硬化病變中上調(diào)，CHI3L1 可以阻止平滑肌細胞向合成和過度增殖狀態(tài)轉換的不良改變，在抑制冠狀動脈斑塊形成中發(fā)揮重要作用［18］。van Sleen等［19］研究表明，在巨細胞動脈炎患者中，CHI3L1可通過與人白細胞介素13受體α2相互作用激活Akt/ERK途徑，促進炎癥反應、組織破壞和新生血管形成的過程。

單次腹腔注射LCWE可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生主動脈炎和近端冠狀動脈炎，其組織病理學、功能和免疫特征與人類KD中觀察到的血管炎非常相似［20］，是目前常見的認可度較高的構建KD樣血管炎小鼠模型的方法之一。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光染色及Western blot 檢測正常對照組小鼠和單次腹腔注射LCWE 構建KD 樣血管炎小鼠模型組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1 的表達水平，結果顯示與對照組小鼠比較，模型組的冠狀動脈組織中CHI3L1表達水平明顯升高，因此我們推測CHI3L1的過表達可能參與了KD所致CAL的發(fā)生。既往研究表明，內(nèi)皮細胞功能障礙是KD 的關鍵病理機制［21］。本研究檢測了內(nèi)皮標志物及細胞凋亡蛋白的表達，結果表明KD樣血管炎小鼠的冠狀動脈組織中，內(nèi)皮標志物vWF 及VE cadherin 表達水平降低，并且免疫熒光染色結果也顯示，對照組小鼠冠狀動脈組織中vWF 為高表達，而模型組小鼠冠狀動脈組織中vWF基本無表達；細胞凋亡基因Bax及Caspase-3 表達水平明顯升高，而抗凋亡基因Bcl-2表達水平明顯下降，提示CHI3L1可能通過介導內(nèi)皮細胞凋亡參與KD 血管炎性損傷。NF-κB 是一種核轉錄因子，可刺激下游炎癥介質表達升高，促進人冠狀動脈內(nèi)皮細胞凋亡，參與KD血管炎癥損傷過程［22］。既往研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1可通過激活NF-κB 通路促進神經(jīng)膠質瘤進展［23］。本研究結果表明在KD 樣血管炎小鼠的冠狀動脈組織中NFκB、p-NF-κB 表達水平升高，提示LCWE 誘導的KD樣血管炎可能是通過CHI3L1/NF-κB信號通路造成血管內(nèi)皮細胞凋亡。

綜上所述，LCWE 誘導的KD 樣血管炎小鼠模型中CHI3L1 的表達水平升高，可能通過炎性反應介導血管內(nèi)皮細胞凋亡在冠狀動脈損傷中發(fā)揮作用。今后將對CHI3L1 是如何通過NF-κB 介導的炎性信號通路來誘發(fā)KD血管內(nèi)皮細胞凋亡進一步研究。本研究為探索CHI3L1 預測KD 患兒發(fā)生CAL的潛在生物標志物提供了新的方向。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。