薛燕 尹晶 許俐 黨利亨 王朝 崔亞瓊 張新杰 李崇巍

（1.天津市兒童醫(yī)院（天津大學(xué)兒童醫(yī)院）天津市兒科研究所/天津市兒童出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津市兒童醫(yī)院（天津大學(xué)兒童醫(yī)院）風(fēng)濕免疫科，天津 300134）

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一種急性免疫性血管炎性疾病，心血管系統(tǒng)受累在KD中表現(xiàn)突出，以冠狀動(dòng)脈病變（coronary artery lesion,CAL）最為多見，已成為兒童后天性心臟病的最常見病因［1］。 目前， 靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin, IVIG）聯(lián)合阿司匹林是KD 的標(biāo)準(zhǔn)治療，但仍有10%～20%的患兒對該治療無反應(yīng)，其CAL 發(fā)生率較IVIG 敏感患兒明顯升高［2］。早期識(shí)別IVIG 無反應(yīng)患兒，有助于盡早采取積極的強(qiáng)化治療，從而降低IVIG 耐藥率和CAL發(fā)生率，改善患兒預(yù)后［3-4］。

目前KD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但在疾病的急性期能觀察到中性粒細(xì)胞比例和絕對計(jì)數(shù)增多，以及淋巴細(xì)胞比例和絕對計(jì)數(shù)減少，因此固有免疫與適應(yīng)性免疫的不平衡被認(rèn)為是KD的關(guān)鍵致病因素［5-6］。淋巴細(xì)胞亞群作為適應(yīng)性免疫的重要組成部分，是評估細(xì)胞免疫和體液免疫功能的重要指標(biāo)。與正常對照相比，急性KD患兒外周血中B、T細(xì)胞等顯著降低，可以選擇性地從外周血招募到冠狀動(dòng)脈，從而引起CAL［7］。有研究表明，淋巴細(xì)胞亞群參與多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，可用于監(jiān)測自身免疫性疾病的病情進(jìn)展和治療轉(zhuǎn)歸［8］。淋巴細(xì)胞亞群在IVIG 無反應(yīng)型與IVIG 敏感型KD之間存在顯著差異，但其在IVIG無反應(yīng)型KD預(yù)測體系中的作用尚未見報(bào)道。本研究就治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群在IVIG無反應(yīng)型KD中的特征及其在IVIG無反應(yīng)型KD早期預(yù)測中的臨床價(jià)值進(jìn)行探討，建立IVIG無反應(yīng)型KD的早期預(yù)測模型，并評估其預(yù)測效能。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性納入2021年1月—2023年3月期間在我院住院的KD 患兒226 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)2017年美國心臟協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)診斷的完全性KD或不完全性KD［9］；（2）發(fā)病10 d 內(nèi)入院，且首次治療均為IVIG（2 g/kg）；（3）臨床資料完整，且治療前采集外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）復(fù)發(fā)KD、KD休克綜合征；（2）合并有其他自身免疫疾病、血液疾病或惡性腫瘤等；（3）患兒于外院確診KD，且診療過程已使用IVIG治療。

IVIG無反應(yīng)型KD診斷標(biāo)準(zhǔn)：首次IVIG輸注結(jié)束后36 h，患兒仍有持續(xù)發(fā)熱的表現(xiàn)，或在治療2～7 d后再次出現(xiàn)發(fā)熱并伴隨至少1種以上的KD臨床癥狀［9］。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，將納入對象分為IVIG 敏感組（185例）和IVIG無反應(yīng)組（41例）。

另選取同期0.5～5歲的健康兒童46例作為對照組，其年齡和性別構(gòu)成與KD組相匹配。

1.2 臨床資料收集

（1）一般資料：年齡、性別和發(fā)病時(shí)間等。

（2）IVIG 治療前常見實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)：中性粒細(xì)胞比例（neutrophil percentage, N%）、血小板計(jì)數(shù)（platelet count, PLT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、球蛋白（globulin, GLB）、白蛋白（albumin, ALB）、血清鈉（serum sodium,Na+）、總膽紅素（total bilirubin, TB）、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein, CRP）、鐵蛋白（ferritin, Ferr）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測

所有患兒治療前予EDTA 抗凝管靜脈采血2 mL， 采用流式細(xì)胞儀FACScanto Ⅱ（BD Bioscience，美國）、BD multitest 6-color TBNK 試劑（BD Bioscience，美國）及絕對計(jì)數(shù)微球試劑盒（北京同生時(shí)代，中國）檢測淋巴細(xì)胞亞群，包括總T 細(xì)胞（CD3+）、CD4+T 細(xì)胞（CD3+CD4+）、CD8+T 細(xì)胞（CD3+CD8+）、B 細(xì)胞（CD3-CD19+）和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK 細(xì)胞）（CD3-CD16+/CD56+）的比例和絕對計(jì)數(shù)。

1.4 5種不同預(yù)測評分體系

應(yīng)用Kobayashi 等［10］、 Egami 等［11］、 Sano等［12］、Yang等［13］、Wu等［14］5種評分體系（表1），對本研究226 例KD 患兒進(jìn)行評分，分別計(jì)算各個(gè)評分體系對本研究中IVIG無反應(yīng)型KD患兒預(yù)測的靈敏度和特異度。

表1 5種不同預(yù)測評分體系

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，組間比較使用卡方檢驗(yàn)。將單因素分析后P＜0.05 的變量納入多因素logistic回歸分析，評估IVIG無反應(yīng)型KD的預(yù)測因素。為了便于操作，對每個(gè)預(yù)測因素進(jìn)行賦值以建立一個(gè)簡化的預(yù)測評分體系［14］。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般資料

共226例KD患兒納入研究，其中IVIG敏感組185 例，IVIG 無反應(yīng)組41 例。IVIG 敏感組中，女性73 例（39.5%），男性112 例（60.5%），中位發(fā)病年齡2（1，3）歲。IVIG 無反應(yīng)組41 例，其中女性19例（46.3%），男性22例（53.7%），中位發(fā)病年齡2（1，3）歲。兩組之間年齡、性別的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P=0.795、0.417）。

對照組共46 例，其中男性31 例（67.4%），女性15 例（32.6%），中位年齡2（1，3）歲。KD 組共226 例，其中男性134 例（59.3%），女性92 例（40.7%）。兩組年齡、性別的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P=0.599、0.305）。

2.2 IVIG敏感組和IVIG無反應(yīng)組常見臨床數(shù)據(jù)的比較

與IVIG 敏感組相比，IVIG 無反應(yīng)組Ferr、IL-6、AST、ALT、TB、N%及CRP 顯著升高，Na+、GLB 及PLT 顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組其余指標(biāo)的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 IVIG敏感組和IVIG無反應(yīng)組常見臨床數(shù)據(jù)的比較

2.3 KD組與對照組淋巴細(xì)胞亞群的比較

與對照組相比，KD組B細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值顯著升高（P＜0.05），總T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的比例顯著下降（P＜0.05）；KD 組總T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)均明顯低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 KD組和對照組淋巴細(xì)胞亞群的比較 ［M（P25，P75）］

2.4 IVIG無反應(yīng)組和IVIG敏感組淋巴細(xì)胞亞群的比較

IVIG無反應(yīng)組總T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的比例明顯低于IVIG 敏感組（P＜0.05）；IVIG 無反應(yīng)組總T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)明顯低于IVIG敏感組（P＜0.05）。兩組其余指標(biāo)的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 IVIG敏感組和IVIG無反應(yīng)組淋巴細(xì)胞亞群的比較 ［M（P25，P75）］

2.5 多因素logistic回歸分析

單因素分析后，將IVIG 敏感組與IVIG 無反應(yīng)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量（P＜0.05）納入多因素logistic 回歸分析，共納入17 個(gè)連續(xù)變量作為自變量，包括10 個(gè)常見實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)（Ferr、IL-6、Na+、AST、ALT、GLB、TB、N%、PLT、CRP） 及7 個(gè)淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)（總T 細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞比例，以及總T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)），以患兒對IVIG 治療的敏感性為因變量。多因素logistic 回歸分析顯示，CD4+T 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、NK 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、Na+、GLB和TB這5個(gè)變量是IVIG無反應(yīng)型KD 的預(yù)測因素（P＜0.05），見表5，并建立logistic回歸模型：Y（X）=26.863-0.001X1（CD4+T 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)）+0.002X2（NK細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)）-0.193X3（Na+）-0.117X4（GLB）+0.078X5（TB）。受試者操作特征曲線 （receiver operating characteristic curve， ROC 曲線）分析顯示，以模型得分≥-1.51為截?cái)嘀?，該模型預(yù)測IVIG 無反應(yīng)型KD 的靈敏度、特異度分別為70.7%、78.9%，約登指數(shù)為0.496，曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.801（95%CI：0.725～0.878）。

表5 IVIG無反應(yīng)型KD影響因素的logistic回歸分析

2.6 簡化評分體系

根據(jù)ROC 曲線分析結(jié)果，將以上logistic 回歸模型中的5個(gè)變量轉(zhuǎn)化為二分類變量，再次進(jìn)行多因素logistic 回歸分析。各變量的截?cái)嘀等缦拢篊D4+T 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)≤960.9 個(gè)/μL，NK 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)≤157.2 個(gè)/μL，Na+≤135 mmol/L，GLB≤22.4 g/L，TB≥5.9 μmol/L。多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)≤960.9個(gè)/μL，Na+≤135 mmol/L，GLB≤22.4 g/L，TB≥5.9 μmol/L 為IVIG 無反應(yīng)型KD的預(yù)測因素。根據(jù)各預(yù)測因素的OR值對變量賦分（表6），建立評分體系：CD4+T 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)≤960.9 個(gè)/μL 為3 分，Na+≤135 mmol/L 為3 分，GLB≤22.4 g/L為3分，TB≥5.9 μmol/L為5分。ROC曲線分析顯示，總分≥11分為截?cái)嘀禃r(shí)，此評分體系預(yù)測IVIG無反應(yīng)型KD的約登指數(shù)最大（0.545），靈敏度、特異度分別為70.7%、83.8%，AUC為0.816（95%CI：0.745～0.888），見表7和圖1。

圖1 預(yù)測IVIG無反應(yīng)型KD的ROC曲線

表6 多因素logistic回歸法分析IVIG無反應(yīng)型KD的預(yù)測指標(biāo)

表7 不同截?cái)嘀迪卤狙芯拷⒌念A(yù)測評分體系的預(yù)測效能

2.7 與已有的5種評分體系預(yù)測IVIG無反應(yīng)型KD的預(yù)測效能的比較

將5 種國內(nèi)外評分體系［10-14］分別應(yīng)用于本研究的226 例KD 患兒，對IVIG 無反應(yīng)型KD 進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，Sano 評分［12］、Yang 評分［13］、Wu評分［14］的靈敏度均低于50%，Kobayashi 評分［10］和Egami評分［11］的特異度均低于75%，5種評分體系的約登指數(shù)均低于0.4（范圍：0.174～0.358）。與以上5種評分體系相比，本研究建立的評分體系的靈敏度和特異度明顯增高，約登指數(shù)為0.545，見表8。

表8 6種評分體系對IVIG無反應(yīng)型KD的預(yù)測效能

3 討論

現(xiàn)有IVIG無反應(yīng)型KD評分體系主要基于臨床特點(diǎn)和炎癥指標(biāo)所構(gòu)建，缺乏免疫指標(biāo)，存在靈敏度不高的缺陷。KD作為一種急性的自身免疫性血管炎，免疫機(jī)制在其中發(fā)揮著重要作用。KD發(fā)病初期存在免疫細(xì)胞活化，免疫指標(biāo)的引入或許能增加預(yù)測體系的效能。因此本研究檢測總T 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞在急性期治療前的表達(dá)水平，結(jié)合現(xiàn)有評分體系提示的多個(gè)預(yù)測因素，構(gòu)建預(yù)測評分體系，探討其在IVIG無反應(yīng)型KD預(yù)測中的作用。

近年越來越多的證據(jù)表明，固有免疫與適應(yīng)性免疫的不平衡是KD的關(guān)鍵致病因素［7，15］。目前KD患兒外周血中總淋巴細(xì)胞比率和絕對計(jì)數(shù)減少已成共識(shí)［16-17］，但各淋巴細(xì)胞亞群的變化趨勢仍有爭議，尤其是B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的比例及絕對計(jì)數(shù)［18-20］。為此，2022 年Xie 等［7］通過生物信息學(xué)方法，收集高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫中所有KD相關(guān)數(shù)據(jù)集，分析101個(gè)健康兒童及480個(gè)急性期KD患兒的資料，歸納淋巴細(xì)胞亞群比例和絕對計(jì)數(shù)的變化趨勢，建立KD外周血免疫細(xì)胞圖譜，顯示KD患兒外周血中總T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞的比例和絕對計(jì)數(shù)均明顯低于健康兒童，NK細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)明顯低于健康兒童。本研究中淋巴細(xì)胞亞群（除B細(xì)胞外）的絕對計(jì)數(shù)結(jié)果與之一致；總T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞比例結(jié)果也與之一致，不同在于本研究中KD 患兒CD4+T 細(xì)胞比例與健康對照相比沒有顯著差異，B細(xì)胞比例則明顯高于健康兒童。這可能是由于細(xì)胞比例易受個(gè)體的亞群及總淋巴細(xì)胞兩者降低程度的影響，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。因此，我們認(rèn)為淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)更能客觀反映免疫細(xì)胞變化趨勢。此外，KD患兒的各淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)還與IVIG 敏感性有關(guān)。本研究結(jié)果表明IVIG 無反應(yīng)型KD 患兒治療前的總T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及B 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)明顯低于IVIG 敏感型，與國內(nèi)外研究結(jié)果［18，20］基本一致，但能否作為預(yù)測IVIG 治療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物尚缺乏研究。

在本研究建立的評分體系中，CD4+T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)≤960.9 個(gè)/μL 為KD 患兒IVIG 無反應(yīng)的預(yù)測因素。既往研究發(fā)現(xiàn)KD小鼠模型中早期損傷的冠狀動(dòng)脈壁可見大量CD4+T細(xì)胞浸潤，而正常小鼠冠狀動(dòng)脈中未見到CD4+T細(xì)胞［6］，提示CD4+T細(xì)胞參與KD 急性期的血管壁炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致外周血中CD4+T 細(xì)胞過度消耗。而本研究發(fā)現(xiàn)IVIG 無反應(yīng)組外周血中CD4+T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)低于IVIG敏感組，推測IVIG 無反應(yīng)組有更多CD4+T 細(xì)胞參與血管壁的炎癥反應(yīng)。在本研究建立的logistic回歸模型中，除了CD4+T 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)，NK 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)也是IVIG無反應(yīng)的預(yù)測因素。Choi等［21］發(fā)現(xiàn)在診斷時(shí)（IVIG 輸注之前），IVIG 無反應(yīng)型KD 患者的CD56-CD16+亞型NK 細(xì)胞水平明顯低于IVIG 敏感型，且其水平與IVIG 反應(yīng)性、發(fā)熱持續(xù)時(shí)間、CAL 以及頸部淋巴結(jié)等臨床表現(xiàn)相關(guān)，也與氨基酸B型鈉尿肽前體、CRP和ALT水平以及淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)。但需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證CD56-CD16+亞型NK 細(xì)胞的KD 特異性，特別是在IVIG治療的背景下，并闡明NK細(xì)胞受體表達(dá)和功能失調(diào)的分子機(jī)制。

已有研究表明淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)對兒童難治性肺炎支原體肺炎具有早期預(yù)測作用［22］。本研究將淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)納入IVIG 無反應(yīng)型KD 預(yù)測評分體系中，建立的評分體系包括接受IVIG 治療前的4 個(gè)變量：CD4+T 細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)≤960.9/μL（3 分）、Na+≤135 mmol/L（3 分）、GLB≤22.4 g/L（3 分）、TB≥5.9 μmol/L（5 分）。當(dāng)總分≥11分時(shí)，KD患兒被認(rèn)定為IVIG耐藥的高危人群，應(yīng)警惕IVIG 治療可能無反應(yīng)。此評分體系預(yù)測IVIG無反應(yīng)型KD的AUC、靈敏度和特異度分別為0.816、70.7%和83.8%，預(yù)測效能優(yōu)于其他5 種國內(nèi)外評分體系［10-14］。

本研究為單中心回顧性研究，可能存在選擇偏倚，這是本研究的局限性。另外，本研究建立的IVIG無反應(yīng)型KD的預(yù)測評分體系的效能需要進(jìn)一步內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證。因此，未來的研究應(yīng)著重于前瞻性的隨機(jī)對照研究，以優(yōu)化預(yù)測模型，并需要更嚴(yán)格的內(nèi)部和外部驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示，外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測可在預(yù)測IVIG無反應(yīng)型KD中發(fā)揮重要作用。本研究基于外周血淋巴細(xì)胞亞群及常見實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)建立的預(yù)測評分體系可用于預(yù)測KD患兒是否對IVIG 有反應(yīng)，與目前使用的風(fēng)險(xiǎn)評分體系相比，具有更好的準(zhǔn)確性，對指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇合適的個(gè)體化治療以減少KD患兒CAL的發(fā)生具有重要意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。