符 康, 苗鴻飛, 劉艷霞, 李寶玲, 金銀銀,李宗杰, 汪星宇, 柴婷婷, 崔 峰*,

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江省綠色農(nóng)藥 2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 食品與健康學(xué)院，杭州 311300)

Inpyrfluxam [圖式1，CAS：1352994-67-2，化學(xué)名稱(chēng)為3-(二氟甲基)-N-[(R)-2,3-二氫-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基]-1-甲基吡唑-4-甲酰胺]是由日本住友化學(xué)公司開(kāi)發(fā)的新型琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI) 類(lèi)殺菌劑，其作用機(jī)理是通過(guò)抑制病原菌線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞鏈上的蛋白復(fù)合體II 進(jìn)而阻斷能量代謝，最終導(dǎo)致病原菌死亡[1]。Inpyrfluxam 具有高效、廣譜的殺菌活性，適用于大豆、水稻、谷物等多種作物的病害防治[2]。2020 年3 月，inpyrfluxam在日本取得了全球首個(gè)登記，后陸續(xù)于加拿大、美國(guó)、巴西登記上市[3]。

圖式 1 Inpyrfluxam 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of inpyrfluxam

近年來(lái)，隨著SDHI 類(lèi)殺菌劑的大量應(yīng)用，導(dǎo)致其在環(huán)境水體中被頻繁檢出[4]。據(jù)報(bào)道，大部分SDHI 類(lèi)殺菌劑對(duì)水生生物具有較高毒性[4]。如苯丙烯氟菌唑?qū)︴庺~(yú)和虹鱒魚(yú)的96 h-LC50值分別為3.5 和9.1 μg/L[5]，吡唑萘菌胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的96 h-LC50值為230 μg/L[6]。除致死效應(yīng)外，SDHI類(lèi)殺菌劑還可影響水生生物的生長(zhǎng)發(fā)育。Wu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，500 μg/L 的聯(lián)苯吡菌胺和吡唑萘菌胺可造成熱帶爪蟾胚胎色素減退、眼睛晶狀體渾濁、尾軸短縮及鰭窄小，且畸形率可高達(dá)100%。1.1 mg/L 氟唑菌酰胺暴露48 h 后，斑馬魚(yú)胚胎孵化被顯著抑制，出現(xiàn)卵黃囊水腫、心包水腫等畸形，并伴隨心率顯著下降[8]。錢(qián)樂(lè)[9]的研究表明，1.0 mg/L 啶酰菌胺處理28 d 可導(dǎo)致斑馬魚(yú)成魚(yú)體重和體長(zhǎng)被顯著抑制。綜上，SDHI 類(lèi)殺菌劑對(duì)水生生物的毒性風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)引起廣泛關(guān)注。Inpyrfluxam作為一種新型SDHI 類(lèi)殺菌劑，其對(duì)非靶標(biāo)生物尤其是水生生物的毒性效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以斑馬魚(yú)胚胎為試驗(yàn)生物，開(kāi)展暴露試驗(yàn)，以探明新殺菌劑inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致死毒性和發(fā)育毒性效應(yīng)，旨在為inpyrfluxam 的合理使用和環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)與胚胎收集

野生型斑馬魚(yú)Danio rerio親魚(yú) (AB 品系，4 月齡) 購(gòu)于南京一樹(shù)梨花生物科技有限公司，飼養(yǎng)于斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng) (北京愛(ài)生科技發(fā)展有限公司)。飼養(yǎng)用水為ISO 標(biāo)準(zhǔn)水[10]，保持水溫 (27 ±1) ℃，光照/黑暗周期為14 h : 10 h，每天喂食3 次新鮮孵化的豐年蝦。試驗(yàn)前一天傍晚挑選發(fā)育一致的健康斑馬魚(yú)親魚(yú)，按照雌雄比例1 : 1 放入產(chǎn)卵盒中，用隔板將雌雄魚(yú)隔開(kāi)。次日早晨光照開(kāi)始后抽開(kāi)隔板，待雌雄魚(yú)自由追逐交配產(chǎn)卵后，收集受精2 h (2 hours post fertilization, 2hpf)的健康胚胎用于暴露試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters 公司)；CX23 生物顯微鏡 (日本Olympus公司)；RXZ 智能人工氣候箱 (寧波江南儀器制造廠)；Milli-Q 超純水系統(tǒng) (美國(guó) Millipore 公司)。

99.3% inpyrfluxam 標(biāo)準(zhǔn)品 (廣州佳途科技股份有限公司)；丙酮 (分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；乙腈 (色譜純，北京迪馬科技有限公司)；甲酸 (色譜純，阿拉丁試劑有限公司)；99.5%氯化鈉 (分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.3 致死毒性暴露試驗(yàn)

參照 OECD 236 準(zhǔn)則[11]和Lin 等[12]的方法進(jìn)行。用丙酮將inpyrfluxam 配制成母液，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用ISO 標(biāo)準(zhǔn)水稀釋inpyrfluxam 母液配制成質(zhì)量濃度分別為0.050、0.055、0.060、0.065、0.070 和0.075 mg/L 的暴露藥液，并設(shè)置空白對(duì)照組 (ISO 標(biāo)準(zhǔn)水) 和與暴露藥液含相同體積丙酮的溶劑對(duì)照組 (丙酮體積分?jǐn)?shù)為 0.01%)。試驗(yàn)在200 mL燒杯中進(jìn)行，每個(gè)燒杯裝有150 mL的暴露溶液和20 枚2 hpf 的健康胚胎，每個(gè)濃度和對(duì)照設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將胚胎置于溫度為 (2 7 ± 1) ℃，光照/黑暗周期為14 h:10 h 的智能人工氣候箱中培養(yǎng)至96 hpf。暴露試驗(yàn)期間每24 h 更換全部暴露藥液并在顯微鏡下觀察胚胎死亡情況 (死亡標(biāo)志為卵凝結(jié)、發(fā)育停滯和心跳停止[13])，及時(shí)清除死亡胚胎并記錄死亡個(gè)數(shù)，根據(jù)胚胎死亡率求出LC50值。

1.4 發(fā)育毒性暴露試驗(yàn)

根據(jù)致死毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置0.045、0.050、0.055、0.060 和0.065 mg/L 5 個(gè)暴露濃度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。暴露方法同1.3 節(jié)。每24 h 在顯微鏡下檢查胚胎發(fā)育情況并清除死亡個(gè)體，記錄畸形類(lèi)型、畸形個(gè)數(shù)、孵化個(gè)數(shù)，計(jì)算孵化率和畸形率。分別于48、72 和96 hpf，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取5 個(gè)存活胚胎，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)20 s 內(nèi)心跳次數(shù)。96 hpf 時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)選取5 條存活的孵化仔魚(yú)測(cè)量體長(zhǎng)。

1.5 暴露藥液inpyrfluxam 實(shí)際質(zhì)量濃度測(cè)定

在暴露試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和暴露24 h 更換藥液前，分別從每個(gè)重復(fù)中取10 mL 暴露藥液至50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋30 s，再加入5 g氯化鈉渦旋30 s，于7000 r/min 離心3 min。取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL 超純水混勻，經(jīng)0.22 μm 的有機(jī)濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入1.5 mL 進(jìn)樣瓶中。采用高效液相色譜法 (HPLC) 進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件如下：C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為V(乙腈) :V(0.1%甲酸水溶液) ＝70 : 30；流速0.2 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；檢測(cè)時(shí)間為7 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用概率單位法計(jì)算LC50值。獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組胚胎所有指標(biāo)均無(wú)顯著差異，故在本研究中使用溶劑對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果分析和討論。處理組和對(duì)照組之間的差異采樣單因素方差分析 (ANOVA) 和Dunnett 分析，P＜ 0.05，表示差異顯著；P＜ 0.01，表示差異極顯著。使用GraphPad 8.0.2 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 暴露藥液中inpyrfluxam 實(shí)際質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

如表1 所示，所有暴露藥液中inpyrfluxam 實(shí)際質(zhì)量濃度在0～24 h 之間與理論質(zhì)量濃度的偏差均低于20%，因此，本研究中，inpyrfluxam 藥液的理論質(zhì)量濃度可以代表實(shí)際質(zhì)量濃度[10]。

2.2 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致死毒性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有較強(qiáng)的致死能力，其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的72 h-LC50值和96 h-LC50值分別為0.068 mg/L 和0.063 mg/L(表2)。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的毒性等級(jí)為劇毒。

2.3 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致畸效應(yīng)

如圖1 所示，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有明顯的致畸效應(yīng)，可引起斑馬魚(yú)胚胎卵黃囊水腫(yolk sac edema, Yse)、心包水腫 (pericardial edema,Pe) 以及脊柱彎曲 (spinal curvature, Sc)。從圖2-A可以看出，斑馬魚(yú)胚胎的畸形率隨inpyrfluxam質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間的增加而顯著上升?；卧?8 hpf 開(kāi)始顯著出現(xiàn)在0.050 mg/L 處理組中，胚胎畸形率為18.3%；當(dāng)質(zhì)量濃度上升至0.065 mg/L時(shí)，畸形率增大至93.3%。在96 hpf，0.065 mg/L處理組胚胎的畸形率高達(dá)96.7%。卵黃囊水腫和心包水腫是inpyrfluxam 引起的兩種主要畸形癥狀。卵黃囊水腫率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2-B 所示，隨著暴露濃度的升高，胚胎卵黃囊水腫率逐漸增大。在48 hpf，卵黃囊水腫率由0.050 mg/L 處理組的15.0%上升至0.065 mg/L 處理組的93.3%。而隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，卵黃囊水腫率略有下降，96 hpf時(shí)0.065 mg/L 處理組胚胎卵黃囊水腫率降至75.0%。由圖2-C 可以看出，心包水腫率隨暴露濃度和時(shí)間的增加而顯著上升，從16.7% (0.055 mg/L，48 hpf) 上升至83.3% (0.065 mg/L，96 hpf)。

圖1 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致畸作用Fig.1 Embryonic malformations caused by inpyrfluxam after exposure

圖2 Inpyrfluxam 暴露后斑馬魚(yú)胚胎的累計(jì)畸形率 (A)、卵黃囊水腫率 (B) 和心包水腫率 (C)Fig.2 The cumulative deformity rate (A), Yse rate (B) and Pe rate (C) of zebrafish embryos after inpyrfluxam exposure

2.4 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化的影響

由圖3 可以看出，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化具有顯著抑制作用。對(duì)照組胚胎從72 hpf 開(kāi)始孵化，96 hpf 時(shí)所有胚胎完成孵化。隨著暴露濃度的升高，斑馬魚(yú)胚胎的孵化率逐漸降低。72 hpf 時(shí)，胚胎孵化率由對(duì)照組的71.7%顯著降低至0.060 mg/L 處理組的5.0%，而0.065 mg/L 處理組的胚胎均未孵化。在96 hpf 時(shí)，0.065 mg/L處理組的胚胎孵化率僅26.7%。

圖3 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響Fig.3 Effect of inpyrfluxam on the hatching rate of zebrafish embryos

2.5 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心跳的影響

Inpyrfluxam 暴露后，斑馬魚(yú)胚胎的心跳被顯著抑制，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系 (圖4)。在48 hpf，0.050 mg/L inpyrfluxam 處理組斑馬魚(yú)胚胎心跳次數(shù)顯著降低至對(duì)照組的88.0%，當(dāng)inpyrfluxam濃度升高至0.065 mg/L 時(shí)，胚胎心跳次數(shù)下降至對(duì)照組的64.9%。72 hpf 時(shí)，0.045 mg/L inpyrfluxam即可顯著抑制胚胎心跳。在96 hpf，0.065 mg/L inpyrfluxam 處理組斑馬魚(yú)胚胎心跳次數(shù)僅為對(duì)照組的45.3%。

圖4 Inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心跳的影響Fig.4 Effect of inpyrfluxam on the heartbeat of zebrafish embryos

2.6 Inpyrfluxam 對(duì)96 hpf 孵化仔魚(yú)體長(zhǎng)的影響

如圖5 所示，96 hpf 時(shí)，孵化的斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)隨inpyrfluxam 暴露濃度的升高逐漸降低。0.055 mg/L inpyrfluxam 處理組中，仔魚(yú)體長(zhǎng)顯著減小至對(duì)照組的94.3%；當(dāng)inpyrfluxam 增加至0.065 mg/L 時(shí)，仔魚(yú)體長(zhǎng)下降至對(duì)照組的82.7%。

圖5 Inpyrfluxam 對(duì)96 hpf 孵化仔魚(yú)體長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of inpyrfluxam on the body length of the hatched larvae at 96 hpf

3 結(jié)論與討論

致死毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的96 h-LC50為0.063 mg/L，參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎為劇毒。李紅等[4]收集了噻呋酰胺等7 種常用SDHI 類(lèi)殺菌劑對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的毒性數(shù)據(jù)，除苯并烯氟菌唑?qū)Π唏R魚(yú)胚胎96 h-LC50值為0.041 mg/L 外，其余6 種SDHI 類(lèi)殺菌劑的96 h-LC50值 (0.547～3.690 mg/L) 均遠(yuǎn)高于inpyrfluxam。由此可見(jiàn)，inpyrfluxam 對(duì)魚(yú)類(lèi)的致死能力可能強(qiáng)于大部分同類(lèi)殺菌劑，其對(duì)水生生物的毒性風(fēng)險(xiǎn)亟需引起足夠的重視。

除致死效應(yīng)外，inpyrfluxam 對(duì)斑馬胚胎具有較強(qiáng)的致畸作用，畸形率隨著inpyrfluxam 濃度和暴露時(shí)間的增加而顯著上升。在48 hpf 時(shí)，inpyrfluxam暴露組胚胎開(kāi)始出現(xiàn)嚴(yán)重的卵黃囊水腫。類(lèi)似的情況在噻呋酰胺、啶酰菌胺、吡噻菌胺等其他SDHI 類(lèi)殺菌劑處理后的斑馬魚(yú)胚胎中也有報(bào)道[9,15]。在卵生魚(yú)類(lèi)胚胎中，內(nèi)源性脂質(zhì)主要儲(chǔ)存于卵黃囊中，脂質(zhì)代謝若被干擾可導(dǎo)致卵黃囊異常[16]。已有研究表明，SDHI 類(lèi)殺菌劑可造成斑馬魚(yú)胚胎脂質(zhì)代謝紊亂[15]，因此在本研究中，inpyrfluxam可能影響了胚胎的脂質(zhì)代謝從而導(dǎo)致卵黃囊水腫，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實(shí)。心臟是斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的第一個(gè)功能性器官[17]。本研究發(fā)現(xiàn)inpyrfluxam 暴露后，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)生嚴(yán)重的心包水腫。心包水腫是心臟毒性的典型特征[18]，因此，心臟可能是inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的重要靶器官。大量研究表明，其他SDHI 類(lèi)殺菌劑亦可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎心包水腫[19-21]。此外，inpyrfluxam處理后斑馬魚(yú)胚胎心率顯著下降，這可能與卵黃囊病變有關(guān)。據(jù)報(bào)道，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來(lái)儲(chǔ)存于卵黃囊中，卵黃囊發(fā)育異常會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足[22]。心臟的正常運(yùn)轉(zhuǎn)需要消耗大量的能量[23]，若營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙造成能量供應(yīng)不足，心臟的正常工作就會(huì)受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致心率降低。此外，inpyrfluxam 暴露還可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎脊柱彎曲。這種發(fā)育缺陷會(huì)影響斑馬魚(yú)捕獲食物和逃離天敵的能力，從而影響到斑馬魚(yú)的生存[24-25]。

研究發(fā)現(xiàn)，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育有顯著的抑制作用。孵化抑制是inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的主要影響之一。隨著暴露濃度的升高，斑馬魚(yú)胚胎的孵化率逐漸降低；在96 hpf，0.065 mg/L 處理組的胚胎孵化率僅為26.7%。此外，inpyrfluxam 還可顯著抑制孵化后的仔魚(yú)體長(zhǎng)。0.055 mg/L 及更高濃度inpyrfluxam 處理組中斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)均較對(duì)照組顯著減小，0.065 mg/L處理組中仔魚(yú)體長(zhǎng)僅為對(duì)照組的82.7%。已有研究表明，其他SDHI 類(lèi)殺菌劑亦可抑制斑馬魚(yú)胚胎孵化率及仔魚(yú)體長(zhǎng)[4]。有關(guān)inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的抑制機(jī)理需進(jìn)一步探究。

綜上，inpyrfluxam 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有較強(qiáng)的致死和發(fā)育毒性。據(jù)報(bào)道，inpyrfluxam 難以被光解、水解，其在水中的半衰期超過(guò)1 年[26]。因此，inpyrfluxam 對(duì)水生生物的潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)inpyrfluxam 對(duì)水生生物毒性及作用機(jī)理的研究，為inpyrfluxam 的科學(xué)合理使用和環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供充足的參考依據(jù)。