趙 穎, 虞 淼, 張嘯濤, 壽林飛*,

(1.浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理總站，杭州 310009；2.杭州佰盛匯星生物科技有限公司，杭州 311112)

豇豆Vigna unguiculata(Linn.) Walp 在世界范圍內(nèi)、特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛種植，全世界豇豆種植面積達(dá)1250 萬hm2[1]，同時作為我國重要的“菜籃子”產(chǎn)品[2]，與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民群眾日常生活息息相關(guān)。由于豇豆上病蟲害多發(fā)、用藥頻繁，花果同期、采摘間隔短，加之以小農(nóng)戶分散生產(chǎn)為主，豇豆農(nóng)藥殘留問題突出[3]，連續(xù)多年監(jiān)測合格率始終偏低，南方省份農(nóng)藥殘留問題尤為突出[4]。2023 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳發(fā)布的《豇豆農(nóng)藥殘留突出問題攻堅(jiān)治理方案》文件[5]中指出，豇豆中存在的突出重點(diǎn)問題包括禁用農(nóng)藥檢出和常規(guī)農(nóng)藥超標(biāo)。2022 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鼓勵食用農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場開辦者對“三棵菜”(豇豆、韭菜、芹菜)中克百威、三唑磷等禁限用農(nóng)藥，腐霉利、滅蠅胺等易超標(biāo)的常規(guī)農(nóng)藥殘留開展針對性速測。同年，浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳公開征集豇豆上克百威等7 種農(nóng)藥的快速檢測產(chǎn)品[5]。綜合以上文件數(shù)據(jù)，本研究選取了豇豆中克百威等10 種農(nóng)藥為檢測對象，旨在為我國豇豆農(nóng)產(chǎn)品安全提供快速篩查方案。

GB 2763—2021 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]和GB 2763.1—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中2, 4-滴丁酸鈉鹽等112 種農(nóng)藥最大殘留限量》[7]規(guī)定，豇豆上的農(nóng)藥最大殘留限量(MRL)分別為克百威0.02 mg/kg、三唑磷0.05 mg/kg、毒死蜱0.02 mg/kg、啶蟲脒0.4 mg/kg、異菌脲2 mg/kg(參考菜豆)、吡唑醚菌酯2 mg/kg(參考葉用萵苣)、多菌靈0.5 mg/kg(參考菜豆)、腐霉利5 mg/kg(參考莖用萵苣)、滅蠅胺0.5 mg/kg 和甲氰菊酯1 mg/kg(參考青花菜)。豇豆中農(nóng)藥殘留檢測分析方法主要有液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-16]、液相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法[17]和增強(qiáng)拉曼光譜法[18-20]等?；谏锓磻?yīng)或特殊介質(zhì)的快速檢測技術(shù)的相關(guān)報(bào)道主要集中于金納米探針法[21-22]、免疫熒光法[23-24]、分子印跡法[25-26]和電化學(xué)傳感器[27]，研究的主要農(nóng)藥類別為有機(jī)磷[23,28-29]、氨基甲酸酯[30]、擬除蟲菊酯[31]和新煙堿類農(nóng)藥[32-33]。免疫快速檢測在現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢，開發(fā)免疫快速檢測方法，應(yīng)用于現(xiàn)場快速篩查豇豆中多種農(nóng)藥殘留超標(biāo)情況，有助于科學(xué)評估豇豆殘留水平與膳食風(fēng)險，為我國農(nóng)產(chǎn)品安全保駕護(hù)航。

目前，關(guān)于豇豆中農(nóng)藥多殘留的免疫快速檢測方法報(bào)道較少，本研究采用免疫快速檢測技術(shù)，開發(fā)了豇豆中常用10 種農(nóng)藥的免疫層析試紙，優(yōu)化了各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)，評估了10 種農(nóng)藥快速檢測方法的靈敏度和正確度，并應(yīng)用于豇豆實(shí)際樣品的抽樣檢測，綜合評價快速檢測方法的實(shí)用性與準(zhǔn)確性，旨在為豇豆中農(nóng)藥殘留的快速篩查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Fresco21 低溫高速離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司)；Nano-300 超微量核酸蛋白測定儀 (杭州奧盛儀器有限公司)；BSA323S 千分之一天平、BSA224S 萬分之一天平 (德國賽多利斯公司)；超聲波清洗器(蘇州昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀 (美國密理博公司)；恒溫磁力攪拌器(美國沃特世公司)；Vortex-5 旋渦混合器 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；噴金劃膜儀(杭州峰杭科技有限公司)；自動切條機(jī)(杭州韓感科技有限公司)；Waters TQ-S 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國沃特世公司)；手持便攜式讀數(shù)儀(蘇州和邁精密儀器有限公司)。

克百威、3-羥基克百威、丁硫克百威、異丙威、涕滅威、甲萘威、滅多威、三唑磷、二嗪磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、對硫磷、丙溴磷、辛硫磷、啶蟲脒、吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺、烯啶蟲胺、異菌脲、乙烯菌核利、腐霉利、吡唑醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯、肟菌酯、多菌靈、甲基硫菌靈、滅蠅胺、敵菌靈、甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯和溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.E)；克百威、三唑磷、毒死蜱、啶蟲脒、異菌脲、吡唑醚菌酯、多菌靈、腐霉利、滅蠅胺和甲氰菊酯的包被抗原和相應(yīng)的抗體(杭州佰盛實(shí)驗(yàn)室)；羊抗鼠二抗(北京博奧龍)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck)；鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；金標(biāo)優(yōu)化劑SDS-L(深圳逗點(diǎn))；聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鉀、乙酸銨和二氯甲烷(上海國藥)；磷酸緩沖液(PBS)(實(shí)驗(yàn)室自制)；氨基凈化柱(美國 Waters)；CN140 醋酸纖維膜和8964 玻璃纖維膜(美國Sartorius)；AN3 吸水墊和PVC 襯板(南京微測)；牛血清蛋白(BSA，MW67000)、兔抗鼠IgG、三水合氯金酸和檸檬酸三鈉(美國Sigma)；豇豆樣品(浙江省各地區(qū)田間)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金標(biāo)抗體與抗原優(yōu)化組合 根據(jù)經(jīng)典的競爭型抗原抗體免疫反應(yīng)原理建立金標(biāo)免疫層析試紙方法，采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備30 nm粒徑的膠體金溶液[34]，以此膠體金納米粒子靜電吸附10 種農(nóng)藥抗體，形成10 種膠體金標(biāo)記抗體作為免疫識別探針。

金標(biāo)免疫識別探針的制備：準(zhǔn)確量取100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的三水合氯金酸水溶液在恒溫磁力攪拌器上攪拌加熱至沸騰，快速加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%檸檬酸三鈉水溶液，在100 ℃條件下繼續(xù)攪拌，加熱反應(yīng)3 min，得到酒紅色膠體金溶液，冷卻后備用。分別取1 mL 膠體金溶液至6 個1.5 mL 低吸附尖底聚乙烯離心管中，分別用0.2 mol/L 的碳酸鉀調(diào)節(jié)pH 值至6.0、6.5、7.0、8.0、8.5 和9.0，分別逐滴加入0.1 mL 50 μg/mL的農(nóng)藥抗體，渦旋混合均勻后，靜置1 h；加入0.1 mL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% BSA 和1% PEG 的0.01 mol/L PBS 溶液，渦旋混合均勻，靜置0.5 h；于4 ℃、10000 r/min 條件下離心20 min，棄上清液；用0.25 mL 含5% 蔗糖、1% BSA 和0.1% PEG 的0.01 mol/L PBS 溶液渦旋混勻，得到金標(biāo)免疫識別探針，用于免疫層析試紙測試。通過空白和農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液添加樣品的測試線顯色情況篩選出最適pH 值(顯色判斷規(guī)則：陽性樣品的測試線顯色最深，同時陰性樣品的測試線顯色最淺)。

篩選得到最適pH 值后，以同樣的方法篩選最適抗體穩(wěn)定量，將膠體金溶液用0.2 mol/L 的碳酸鉀調(diào)節(jié)至最適pH 值 (如pH 6.5)，分別取1 mL pH 6.5 的膠體金溶液至6 個1.5 mL 低吸附尖底聚乙烯離心管中，分別逐滴加入0.1 mL 質(zhì)量濃度為10、20、40、80、120 和160 μg/mL 的農(nóng)藥抗體，其他步驟同上述金標(biāo)免疫識別探針制備過程，最后篩選得到最適抗體穩(wěn)定量。

用篩選得到的最適pH 值和最適抗體穩(wěn)定量，制備10 種金標(biāo)免疫探針，用于檢測線(T 線)和質(zhì)控線(C 線)測試。

T 線和C 線優(yōu)化：用劃線稀釋液配制農(nóng)藥包被抗原和羊抗鼠二抗溶液，農(nóng)藥包被抗原用于T 線劃膜，羊抗鼠二抗用于C 線劃膜。設(shè)置T 線質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、0.75 和1.0 mg/mL，C 線質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。噴金劃膜儀完成試紙大板NC 膜上的T 線和C 線劃膜后，將膜材料置于抽真空恒溫干燥箱中37 ℃干燥2 h，完全干燥后將試紙大板切成3 mm 小條，用于篩選測試。測試時每個試紙條的金標(biāo)免疫探針用量為5～10 μL，以顯色為篩選標(biāo)準(zhǔn)，空白對照顯色為B3的T 線濃度為最適濃度(將紅色顯色分為8 檔，B1～B8，參見表1，B1 表示紅色顯色最深，B8 表示顯色最淺（即不顯色），此判斷標(biāo)準(zhǔn)由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部制定)，同時結(jié)合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液測試顯色，T 線顯色為B3，篩選得到最適T 線抗原濃度。確定T 線濃度后，根據(jù)相應(yīng)的C 線顯色情況，適當(dāng)調(diào)整C 線濃度，使C 線顯色達(dá)到B3 即與T 線一致。最終優(yōu)化得到10 種金標(biāo)免疫層析試紙的T 線和C 線組合。

表1 T 線和C 線顯色比色表Table 1 Color comparison table for T and C lines

1.2.2 金標(biāo)試紙的組裝和制備

金標(biāo)試紙封閉體系：選擇合適的封閉配方和封閉方式，有利于控制層析速度和防止非特異吸附。本研究采用間接封閉模式，將含0.5%金標(biāo)優(yōu)化劑、0.25% BSA、0.25% PVP 及 2%蔗糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的0.01 mol/L的PBST (指含0.05% 吐溫-20體積分?jǐn)?shù)的PBS) 溶液均勻吸附于樣品墊中，于37 ℃條件下真空干燥，制成具備間接封閉性能的樣品墊。

金墊和金杯制備方法：金標(biāo)試紙分為兩種反應(yīng)模式，第1 種為金墊法，將金標(biāo)探針均勻吸附于玻璃纖維膜上，于37 ℃條件下真空干燥2 h，制成金墊。第2 種為金杯法，將金標(biāo)探針加入96 孔板微孔中，于37 ℃條件下真空干燥2 h，干燥后加密封蓋，制成金杯。

金標(biāo)試紙的主要組成部件為襯板、樣品墊、金墊、NC 膜、T 線、C 線和吸水墊，其組裝過程如圖1 所示：T 線(5)和C 線(6)分別包被于NC膜(2) 上，并根據(jù)先后順序，將NC 膜、吸水墊(7)、金墊(4-1)(若使用金杯法則不需要金標(biāo)墊，采用金杯(4-2)、樣品墊(3) 依次粘于襯板(1)上。將組裝好的試紙切成3 mm 寬的試紙條，于室溫干燥柜中保存并控制相對濕度為30%以下。

圖1 金標(biāo)試紙組裝示意圖Fig.1 Schematic diagram of the composition of the gold immunostrips

1.2.3 免疫層析試紙性能測試 根據(jù)比色判斷金標(biāo)試紙條對標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限測試結(jié)果，通過手持便攜式讀數(shù)儀識別試紙檢測區(qū)域顯色，從而判定農(nóng)藥殘留情況。

準(zhǔn)確量取100 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加于金標(biāo)試紙樣品孔(S)，反應(yīng)10 min 時判斷T 線顯色情況。T 線顯色等于、深于或略淺于C 線表示樣品中相應(yīng)農(nóng)藥的濃度低于檢出限(陰性)；T 線不顯色表示樣本中相應(yīng)農(nóng)藥的濃度等于或高于檢出限(陽性)。顯色判斷圖示見圖2。

圖2 金標(biāo)試紙顯色判斷圖示Fig.2 Color rendering diagram for gold immunostrips judgment

1.2.4 快速檢測前處理方法 本研究在儀器參比方法的前處理方法基礎(chǔ)上，簡化了前處理試劑與提取方法。由于層析試紙的NC 膜對有機(jī)溶劑不耐受，通用的乙腈、甲醇和乙酸乙酯等溶劑不能直接用于金標(biāo)試紙條測試，因而選擇了20%甲醇-0.01 mol/L PBS 為提取試劑，可有效保證金標(biāo)試紙的測試效果。

準(zhǔn)確稱取1.0 g 勻漿豇豆樣品至15 mL 離心管中，加入5 mL 20%甲醇-0.01 mol/L PBS，渦旋振蕩30 s，于4000 r/min 下離心3 min；取上清液，根據(jù)不同農(nóng)藥的檢測要求，用20%甲醇-0.01 mol/L PBS 進(jìn)行不同比例的稀釋，稀釋后取100 μL 用于金標(biāo)試紙快速檢測。檢測流程示意圖見圖3。

圖3 豇豆快速檢測流程示意圖Fig.3 Diagram of cowpea rapid detection process

1.2.5 儀器比對驗(yàn)證方法 參考GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[35]建立豇豆上10 種農(nóng)藥的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCMS/MS)分析方法，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化方法。

樣品制備、提取與凈化：準(zhǔn)確稱取 20 g 豇豆勻漿樣品(精確至0.01 g)于250 mL 燒杯中，加入40 mL 乙腈，用高速勻漿機(jī)在15 000 r/min 勻漿提取1 min，用布氏漏斗抽濾液倒入裝有5 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min 后于室溫下靜置30 min；吸取10 mL 有機(jī)相，放入50 mL 燒杯中，置于80 ℃水浴鍋中，并向杯內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)?，將乙腈蒸發(fā)至近干；加入2.0 mLV(甲醇) :V(二氯甲烷) = 1 : 9溶液溶解，蓋上鋁箔，待凈化。將氨基凈化柱用4.0 mLV(甲醇) :V(二氯甲烷)=1 : 9 溶液淋洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化溶液，收集洗脫液，用4.0 mLV(甲醇) :V(二氯甲烷)=1 : 9溶液淋洗燒杯后過柱，合并洗脫液；將洗脫液氮吹至近干，用甲醇定容至2.0 mL，超聲溶解后加入超純水定容至5.0 mL，混勻，過0.2 μm 濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定條件：Waters C18不銹鋼色譜柱(2.1 mm × 100 mm，2.6 μm)；流動相A 為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 為甲醇；流速0.3 mL/min。流動相梯度洗脫條件：0～2min，80%～20% A；＞ 2～4min，20～5% A；＞ 4～6 min，5% A；＞ 6～6.1 min，5%～80% A； ＞ 6.1～8min；80%。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。電噴霧(ESI)離子源；正離子和負(fù)離子同時掃描方式；ESI 正離子電壓5000 V，ESI 負(fù)離子電壓 -4500 V；離子源溫度500 ℃；輔助加熱氣379 kPa；氣簾氣壓力241 kPa；監(jiān)測離子對、去簇電壓和碰撞能見表2。

表2 10 種農(nóng)藥的監(jiān)測離子對和電壓參數(shù)Table 2 Monitoring ion pairs and voltage parameters of 10 pesticides

1.3 方法評價

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限評價 采用20% 甲醇-0.01mol/L PBS 配制10 種農(nóng)藥的0.001～1 mg/L 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用相應(yīng)的農(nóng)藥金標(biāo)免疫層析試紙檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液。用1.2.3 節(jié)方法判斷檢測結(jié)果，以陽性樣本的最小標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作為檢出限。

1.3.2 豇豆中10 種農(nóng)藥檢出限評價 向空白豇豆樣品中獨(dú)立添加10 種農(nóng)藥的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品充分混勻并靜置2 h后，按照1.2.4 節(jié)方法進(jìn)行提取，提取液用于相應(yīng)農(nóng)藥金標(biāo)試紙檢測。

1.3.3 交叉反應(yīng)率評價 基于抗原抗體的免疫識別特性，特定農(nóng)藥抗體對結(jié)構(gòu)類似物可能存在一定的交叉反應(yīng)。10 種農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)類似物(以目標(biāo)農(nóng)藥—結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥表述)：克百威—3-羥基克百威、丁硫克百威、異丙威、涕滅威、甲萘威、滅多威；三唑磷—二嗪磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、對硫磷、丙溴磷、辛硫磷；毒死蜱—甲基毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、對硫磷、丙溴磷、辛硫磷；啶蟲脒—吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺、烯啶蟲胺；異菌脲—乙烯菌核利、腐霉利；吡唑醚菌酯—醚菌酯、嘧菌酯、肟菌酯；多菌靈—甲基硫菌靈；腐霉利—乙烯菌核利、異菌脲；滅蠅胺—敵菌靈；甲氰菊酯—氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、溴氰菊酯。用20% 甲醇-0.01 mol/L PBS 溶液配制結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥的0.01～10 μg/mL 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，用相應(yīng)金標(biāo)試紙檢測結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測出相應(yīng)檢出限，最后根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥檢出限與交叉反應(yīng)農(nóng)藥檢出限按公式(1)計(jì)算交叉反應(yīng)率(CRR)。

1.3.4 準(zhǔn)確性評價 按照1.2.4 節(jié)的方法提取豇豆樣品，得到豇豆基質(zhì)溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，外標(biāo)法定量，確認(rèn)豇豆中未檢出10 種農(nóng)藥，即空白豇豆樣品。用該空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋成0.01、0.1、0.2、0.5 和1 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以農(nóng)藥的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向豇豆空白樣品中分別添加0、0.1、0.5、1、2 和10 倍檢出限(mg/kg) 6 個水平的10 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5 次，按照1.2.3 節(jié)和1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行樣品檢測分析，每個樣品檢測3 次。檢測結(jié)果用陽性和陰性表示，結(jié)果用于假陽性率、假陰性率和準(zhǔn)確率的評價，統(tǒng)計(jì)方法參考文獻(xiàn)[36]。

1.3.5 不同檢測方法對實(shí)際樣品的比對測試 選取浙江省36 個縣級市或區(qū)的田間豇豆樣品各1 份，用HPLC-MS/MS 分析方法(1.2.5 節(jié))定量檢測10 種農(nóng)藥的殘留量，每份樣品3 個重復(fù)；同時36 份樣品用快速檢測前處理和金標(biāo)免疫層析試紙測試方法(1.2.3 節(jié)和1.2.4 節(jié)) 進(jìn)行樣品檢測分析，每份樣品3 個重復(fù)。統(tǒng)計(jì)儀器定量結(jié)果與快速檢測結(jié)果，并對快速檢測方法與儀器參比方法進(jìn)行一致性評價[36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 金標(biāo)免疫層析試紙關(guān)鍵性參數(shù)

結(jié)果見表3。在最適pH 值和最適抗體穩(wěn)定量下制備得到的金標(biāo)抗體具有最優(yōu)探針顯色效果，并可有效識別相應(yīng)農(nóng)藥；劃膜10 種農(nóng)藥免疫層析試紙，優(yōu)化得到最適T 線和C 線所用試紙的濃度組合；在最適金標(biāo)免疫探針和T/C 線組合條件下，測試得到標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限，參照豇豆中農(nóng)藥MRL 值要求[6-7]，選擇金墊或金杯反應(yīng)模式。若金墊法檢出限低于我國MRL 值，則采用金墊法；若金墊法檢出限高于我國MRL 值，則采用金杯法，通過金標(biāo)抗體與樣品預(yù)反應(yīng)，從而提高檢測靈敏度。

表3 10 種農(nóng)藥的金標(biāo)免疫層析試紙關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化值Table 3 Optimization values of key parameters in gold labeled immunochromatographic test strips for 10 pesticides

2.2 快速前處理方法優(yōu)化

由于豇豆樣品中農(nóng)藥的檢出限與MRL 值存在一定差異，因而需要對前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。按1.2.4 節(jié)的前處理方法，結(jié)合我國規(guī)定的在豇豆中相應(yīng)農(nóng)藥的MRL 值，對豇豆中農(nóng)藥添加樣品的快速提取液進(jìn)行HPLC-MS/MS 定量檢測，每個添加樣品重復(fù)3 次，同時對提取液進(jìn)行不同比例稀釋，之后進(jìn)行快速檢測。結(jié)果 (表4) 表明：克百威、三唑磷、毒死蜱和多菌靈提取后無需稀釋，吡唑醚菌酯、滅蠅胺和甲氰菊酯提取后需稀釋2 倍，異菌脲提取后稀釋4 倍，啶蟲脒提取后稀釋16 倍，腐霉利提取后稀釋50 倍，可用于金標(biāo)試紙檢測，而毒死蜱的檢測靈敏度尚不能達(dá)到MRL 值要求。

表4 采用HPLC-MS/MS 驗(yàn)證前處理方法回收率與試紙檢測靈敏度Table 4 Using HPLC-MS/MS to verify recoveries of the sample preparation method and the sensitivity of the test-strip detection method

2.3 快速檢測方法性能評價

2.3.1 豇豆樣品檢出限 檢出限測定結(jié)果(表5)表明，10 種農(nóng)藥在豇豆中的檢出限除毒死蜱(0.25 mg/kg) 與MRL 值存在一定差距外，其他9 種農(nóng)藥的檢出限均可達(dá)到MRL 值要求[6-7]。典型的試紙條檢測實(shí)物圖見圖4。

圖4 豇豆中10 種農(nóng)藥的試紙條檢測實(shí)物圖Fig.4 Illustration of the detection results of the 10 pesticides in cowpeas using the test-strip method

表5 豇豆樣品中10 種農(nóng)藥的檢出限和MRL 值Table 5 Detection limit and MRL values of 10 pesticides in cowpea samples

2.3.2 特異性 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，除克百威金標(biāo)試紙對丁硫克百威和異丙威交叉反應(yīng)為10%外，其余農(nóng)藥金標(biāo)試紙對結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均 ＜ 1%。表明當(dāng)豇豆樣品中丁硫克百威或異丙威的殘留量≥ 0.2 mg/kg 時，可以被克百威金標(biāo)試紙檢出，而其余9 種農(nóng)藥的金標(biāo)試紙具備高特異性，與結(jié)構(gòu)類似的農(nóng)藥無交叉性反應(yīng)。另外，由于菊酯類農(nóng)藥在水中溶解度極低，存在提取不充分的因素，需在后續(xù)研究中繼續(xù)改進(jìn)。

2.3.3 準(zhǔn)確性 在0.01～1 mg/L 濃度范圍內(nèi)，豇豆基質(zhì)中10 種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2均大于 0.992，表明儀器方法準(zhǔn)確性良好，可用于定量分析。

對空白豇豆樣品中10 種農(nóng)藥的0、0.1、0.5、1、2 和10 倍檢出限添加樣品的快速檢測結(jié)果顯示：1、2 和10 倍檢出限的添加樣品均為陽性，0 和0.1 倍檢出限的添加樣品均為陰性，0.5 倍檢出限的添加樣品存在≤ 11.1%比例的假陽性，方法準(zhǔn)確率≥ 94.4%。以甲氰菊酯為例，典型的試紙條檢測實(shí)物圖見圖5。10 種農(nóng)藥快速檢測方法假陽性率、假陰性率和準(zhǔn)確率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖6。

圖5 豇豆中甲氰菊酯添加樣品的試紙條檢測實(shí)物圖Fig.5 Illustrations of the detection results on the test strips for the spiked cowpea samples with different levels of fenpropathrin

圖6 豇豆中10 種農(nóng)藥添加樣品的快速檢測結(jié)果準(zhǔn)確性評價Fig.6 Accuracy of the rapid test results for the spiked cowpea samples with 10 pesticides

2.3.4 實(shí)用性 機(jī)抽檢浙江省36 個縣市區(qū)的36 份豇豆樣品，將本研究建立的快速檢測方法與傳統(tǒng)的HPLC-MS/MS 方法進(jìn)行比對，結(jié)果如表6所示，其中，1.2.4 節(jié)快速檢測方法檢測得出陽性和陰性結(jié)果，其中陽性表示樣品中相應(yīng)農(nóng)藥濃度高于或等于MRL，陰性表示樣品中相應(yīng)農(nóng)藥濃度低于MRL。結(jié)果顯示：36 份豇豆樣品中克百威超標(biāo)1 個、三唑磷超標(biāo)2 個、毒死蜱超標(biāo)1 個、吡唑醚菌酯超標(biāo)1 個、多菌靈超標(biāo)1 個、滅蠅胺超標(biāo)1 個，其余4 種農(nóng)藥有檢出，但均未超標(biāo)。快速檢測方法結(jié)果與定量檢測方法結(jié)果比對，其準(zhǔn)確率≥ 97.2%，表明該快速檢測方法在實(shí)際樣品分析中具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

表6 豇豆實(shí)際樣品定量檢測和快速檢測比對結(jié)果Table 6 Comparison results of quantitative testing and rapid testing of actual cowpea samples

3 結(jié)論與討論

本研究建立了豇豆樣品中10 種農(nóng)藥殘留的金標(biāo)免疫層析試紙快速檢測方法，并采用真實(shí)樣品進(jìn)行HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果比對，快速檢測方法準(zhǔn)確率可達(dá)97.2%以上。所建立的金標(biāo)試紙除毒死蜱外，克百威、三唑磷、啶蟲脒、異菌脲、吡唑醚菌酯、多菌靈、腐霉利、滅蠅胺和甲氰菊酯9 種金標(biāo)試紙對豇豆中相應(yīng)農(nóng)藥的檢出限均滿足我國MRL 標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求。雖然毒死蜱快速檢測方法的檢出限0.25 mg/kg 與豇豆中MRL 0.02 mg/kg存在差距，但在實(shí)際樣品檢測中，毒死蜱殘留量為0.310 mg/kg 的豇豆樣品快速檢測結(jié)果顯示陽性，可以用于毒死蜱超標(biāo)高風(fēng)險樣品的快速篩查。除克百威金標(biāo)試紙對丁硫克百威和異丙威存在10%交叉反應(yīng)外，三唑磷、毒死蜱、啶蟲脒、異菌脲、吡唑醚菌酯、多菌靈、腐霉利、滅蠅胺和甲氰菊酯9 種金標(biāo)試紙具有高特異性，與其結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥物無明顯交叉反應(yīng)。GB 2763—2021 中規(guī)定，除克百威的殘留物以克百威及3-羥基克百威之和表示外，其他9 種農(nóng)藥的殘留物中無代謝物，因此克百威的快速檢測結(jié)果不能指示其代謝物3-羥基克百威的殘留情況。

綜上所述，金標(biāo)快速檢測方法可實(shí)現(xiàn)豇豆中10 種農(nóng)藥殘留的快速、準(zhǔn)確及定性分析。樣品的前處理過程簡易、快速、環(huán)保，樣品前處理和金標(biāo)試紙檢測時間僅需15 min，提取溶液為20%甲醇PBS 溶液，極大地減少了分析樣品時間和有機(jī)溶劑用量，有較強(qiáng)的現(xiàn)場檢測實(shí)用性，可為豇豆中10 種農(nóng)藥殘留的快速篩查提供技術(shù)保障，并為建立我國豇豆中農(nóng)藥殘留快速檢測金標(biāo)免疫層析方法標(biāo)準(zhǔn)提供重要的參考數(shù)據(jù)。