何承帥, 張 輝, 吳順?lè)? 高云昊, 高聰芬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 綠色農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095)

化學(xué)防治是防控農(nóng)業(yè)有害生物的有效措施，在保障糧食安全方面有著不可或缺的地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年由病蟲(chóng)害導(dǎo)致的作物產(chǎn)量損失在30%～40%[1]，使用化學(xué)農(nóng)藥可至少挽回30%的產(chǎn)量損失?；瘜W(xué)農(nóng)藥具有使用方便、防治速度快、防治效果好等優(yōu)點(diǎn)，但長(zhǎng)期或不合理使用可能引致防治對(duì)象對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性、農(nóng)藥對(duì)非目標(biāo)生物的毒副作用以及環(huán)境污染等一系列問(wèn)題。因此，尋找高效且安全的新型綠色農(nóng)藥是農(nóng)藥行業(yè)發(fā)展的重要方向。

RNA 干擾 (RNA interference，RNAi) 是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA (doublestranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源信使RNA(messenger RNA，mRNA) 高效特異性降解的現(xiàn)象，可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄前水平或轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)而誘導(dǎo)功能缺失的表型[2]。核酸農(nóng)藥是一類(lèi)可以特異性地結(jié)合靶標(biāo)生物中特定基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 的多核苷酸，通過(guò)靶標(biāo)生物體內(nèi)天然存在的RNAi 系統(tǒng)沉默相應(yīng)基因的表達(dá)，從而干擾靶標(biāo)生物的正常生長(zhǎng)及其對(duì)寄主植物的危害，最終達(dá)到保護(hù)植物目的的植物保護(hù)劑[3]。核酸農(nóng)藥具有特異性強(qiáng)、見(jiàn)效周期短、無(wú)殘留和對(duì)非靶標(biāo)生物影響較小等優(yōu)勢(shì)，被譽(yù)為農(nóng)藥史上第3 次革命，是新型綠色農(nóng)藥創(chuàng)制領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。近年來(lái)，基于RNAi技術(shù)的核酸農(nóng)藥已逐漸走向市場(chǎng)[3,5]。目前，核酸農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)有害生物防治方面的應(yīng)用方式主要包括以轉(zhuǎn)基因作物為主的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥和直接噴施dsRNA 為主的可噴灑核酸農(nóng)藥兩種類(lèi)型[3,6]。相較于具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥，外源施用的可噴灑核酸農(nóng)藥更符合公眾對(duì)農(nóng)藥的認(rèn)知，更具應(yīng)用前景和市場(chǎng)潛力，是未來(lái)核酸農(nóng)藥的理想應(yīng)用方式。然而，體外應(yīng)用dsRNA在環(huán)境中不穩(wěn)定，易被RNA 降解酶、紫外光和高溫降解[7-8]，難以有效地導(dǎo)入靶標(biāo)生物體內(nèi)等技術(shù)難題，嚴(yán)重限制了可噴灑核酸農(nóng)藥的實(shí)際應(yīng)用效果。

納米材料具有納米尺度下的小尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)以及良好的生物兼容性等特點(diǎn)，其作為dsRNA載體可以增強(qiáng)dsRNA 在環(huán)境中的穩(wěn)定性和進(jìn)入目標(biāo)生物組織或細(xì)胞的能力，進(jìn)而提高靶向遞送效率，是解決核酸農(nóng)藥外源施用難的有效手段[9-12]。近年來(lái)，隨著納米材料的快速發(fā)展和dsRNA 高效合成技術(shù)日漸成熟，基于納米材料的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)在有害生物防治方面取得了一系列重要的進(jìn)展。鑒于此，本文對(duì)核酸農(nóng)藥的應(yīng)用方式與挑戰(zhàn)、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展、基于納米材料的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)及其國(guó)內(nèi)外應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的前景和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行展望，旨在為核酸農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)有害生物綠色防控中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 核酸農(nóng)藥的應(yīng)用方式與挑戰(zhàn)

自從1998 年Fire 等[13]在秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans中發(fā)現(xiàn)RNAi 現(xiàn)象以來(lái)，開(kāi)發(fā)基于RNAi 原理的核酸農(nóng)藥應(yīng)用于保護(hù)植物和防治有害生物方面就受到廣泛關(guān)注并取得了重要進(jìn)展。之前龔流娥等[14]、王治文等[3]在影響RNAi 效率的主要因素、核酸農(nóng)藥防治原理及應(yīng)用現(xiàn)狀等相關(guān)方面進(jìn)行了綜述，本節(jié)側(cè)重于討論核酸農(nóng)藥在病蟲(chóng)害防治中應(yīng)用方式的研究進(jìn)展與挑戰(zhàn)。

1.1 轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥

轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)傳遞針對(duì)害蟲(chóng)致命基因的dsRNA 或者小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)，從而賦予作物自身防御病蟲(chóng)害的能力[15-16]。轉(zhuǎn)基因作物可以通過(guò)植物細(xì)胞產(chǎn)生dsRNA/siRNA，而后經(jīng)過(guò)食物鏈進(jìn)入靶標(biāo)生物體內(nèi)，打破dsRNA/siRNA 穩(wěn)定供應(yīng)的限制，從而觸發(fā)持續(xù)的RNAi 反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因作物自身表達(dá)dsRNA 或者siRNA 的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥在有害生物管理方面具有成本低、穩(wěn)定表達(dá)和高特異性等諸多優(yōu)勢(shì)[17]。

目前，新型的葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以讓dsRNA 穩(wěn)定地在葉綠體中積累而不會(huì)被自身的RNAi 元件 (Dicer 酶) 切割降解，其克服了基于常規(guī)細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥會(huì)被植物自身RNAi 系統(tǒng)識(shí)別切割，進(jìn)而影響RNAi 效率和防控效果的應(yīng)用難題[18-20]。然而，轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥仍具有一定的局限性，例如：許多作物無(wú)法進(jìn)行基因改造[8]；在水稻、小麥和玉米等主要糧食作物上難以開(kāi)發(fā)葉綠體轉(zhuǎn)化方案[5]。此外，轉(zhuǎn)基因作物的農(nóng)產(chǎn)品在大多數(shù)國(guó)家具有較低的市場(chǎng)公眾接受度，對(duì)其潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)需要進(jìn)行嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[21-23]。

1.2 可噴灑核酸農(nóng)藥

近年來(lái)，利用噴霧誘導(dǎo)基因沉默 (spray-induced gene silencing，SIGS) 技術(shù)在植物表面應(yīng)用可噴灑核酸農(nóng)藥進(jìn)行農(nóng)業(yè)有害生物防治的方式受到了核酸農(nóng)藥研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[24-26]。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，可噴灑核酸農(nóng)藥具有對(duì)靶標(biāo)生物的高特異性和快速自然降解的優(yōu)點(diǎn)[27-29]。

隨著對(duì)核酸農(nóng)藥研究的不斷深入，關(guān)于葉面噴施核酸農(nóng)藥進(jìn)行有害生物防治的研究越來(lái)越多。2001 年，Tenllado 等[30]首次報(bào)道了葉面應(yīng)用dsRNA 可成功干擾辣椒輕斑駁病毒 (pepper mild mottle virus，PMMoV)、苜?；ㄈ~病毒 (alfalfa mosaic virus，AMV) 和煙草蝕紋病毒 (tobacco etch virus，TEV) 對(duì)煙草Nicotiana tabacum的侵染。Koch 等[31]研究表明，在大麥Hordeum vulgare葉片表面噴灑靶向3 個(gè)禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum麥角甾醇生物合成基因 (CYP51A、CYP51B、CYP51C) 的dsRNA (CYP3-dsRNA)，可有效抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)。Wang 等[32]發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea在侵染植物時(shí)可以將siRNAs(主要由灰葡萄孢菌Dicer 蛋白BcDCL1 和BcDCL2產(chǎn)生) 傳遞到植物細(xì)胞中，以沉默宿主免疫基因；在植物表面應(yīng)用靶向灰葡萄孢菌DCL1 和DCL2基因的siRNA 或dsRNA 可削弱這種沉默，進(jìn)而顯著抑制灰霉病。李本杰等[33]在馬鈴薯Solanum tuberosum葉面上施用針對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsa decemlineata肌動(dòng)蛋白基因的dsRNA，能夠有效防治該類(lèi)害蟲(chóng)28 d 以上。Andrade 等[34]用靶向亞洲柑橘木虱Diaphorina citri精氨酸激酶基因的dsRNA 處理柑橘Citrus sinensis葉片，發(fā)現(xiàn)柑橘木虱取食后會(huì)因精氨酸激酶基因的表達(dá)受到干擾而死亡。

與轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥相比，可噴灑核酸農(nóng)藥因開(kāi)發(fā)時(shí)間短、開(kāi)發(fā)成本低、抗性風(fēng)險(xiǎn)低、調(diào)控過(guò)程簡(jiǎn)單及對(duì)所有作物的可行性高而備受青睞[35]。噴施操作便捷且應(yīng)用場(chǎng)景多樣，是核酸農(nóng)藥未來(lái)主要的應(yīng)用方式。然而，可噴灑核酸農(nóng)藥在實(shí)際應(yīng)用中也受到諸多因素的限制。例如：植物細(xì)胞和大多病原菌細(xì)胞具有由纖維素等物質(zhì)構(gòu)成的較厚且堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，厚度從0.1 μm 到幾個(gè)微米不等，這對(duì)核酸農(nóng)藥的傳遞構(gòu)成了物理障礙[36-37]；昆蟲(chóng)中腸內(nèi)的內(nèi)切酶可以降解進(jìn)入體內(nèi)的dsRNA，從而降低昆蟲(chóng)的RNAi 效率[38-40]。此外，dsRNA 在環(huán)境中的降解也是RNAi 無(wú)效誘導(dǎo)的主要原因[28,41-44]。

2 核酸農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展

在過(guò)去的幾十年里，隨著生物技術(shù)迅速發(fā)展，核酸農(nóng)藥作為一種新興的農(nóng)業(yè)防治手段引起了廣泛關(guān)注。通過(guò)對(duì)潛在靶基因的篩選和功能分析，以及基于RNAi 的作物保護(hù)和作物改良策略的設(shè)計(jì)，部分核酸農(nóng)藥已成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

2.1 轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥

2017 年，孟山都公司 (現(xiàn)已被拜耳公司收購(gòu))利用一種天然高效的轉(zhuǎn)基因載體——農(nóng)桿菌 (屬于革蘭氏陰性細(xì)菌) 將目的基因轉(zhuǎn)入受體品種中，開(kāi)發(fā)了一種可以同時(shí)表達(dá)蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis，Bt) Cry3Bt1 蛋白和西方玉米根甲蟲(chóng)Diabrotica virgifera virgifera Snf7基因dsRNA 的商業(yè)轉(zhuǎn)基因玉米MON87411，并獲得美國(guó)環(huán)境保護(hù)署 (EPA) 批準(zhǔn)，成為全球獲批的首項(xiàng)基于RNAi技術(shù)控制害蟲(chóng)的核酸農(nóng)藥[45]。該產(chǎn)品創(chuàng)新性地通過(guò)將RNAi 技術(shù)與Bt 毒素相結(jié)合的方式，改善了對(duì)西方玉米根甲蟲(chóng)的控制[46]。2021 年，該產(chǎn)品成功獲得了中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司頒發(fā)的轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū) (進(jìn)口) 批準(zhǔn) (http://www.kjs.moa.gov.cn/gzdt/202101/t20210113_6359909.htm)，主要用作加工原料。同年，歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)了該產(chǎn)品用于食品和飼料的加工原料[47]。2022—2023 年，拜耳公司在美國(guó)和加拿大對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行了商業(yè)化種植與推廣[48]。

宿主誘導(dǎo)的基因沉默并不局限于對(duì)害蟲(chóng)的控制，一些使用RNAi 來(lái)改善作物質(zhì)量的產(chǎn)品也已被授權(quán)批準(zhǔn)，或?qū)⒃诓痪玫膶?lái)進(jìn)入市場(chǎng)。例如，2018 年，拜耳公司通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化傳統(tǒng)大豆Glycine max得到含有FAD2-1A/FATB1Ab(脂肪酸生物合成途徑關(guān)鍵基因) 表達(dá)抑制盒和cp4-epsps耐除草劑基因的轉(zhuǎn)基因大豆MON87705，該產(chǎn)品可以改良大豆脂肪酸組成，并對(duì)除草劑草甘膦具有抗性，目前該產(chǎn)品在美國(guó)、加拿大和日本已被批準(zhǔn)用于食品和飼料的加工原料以及商業(yè)化種植，在歐盟已被批準(zhǔn)用于飼料和食品的加工原料[47]。2022 年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物衛(wèi)生檢驗(yàn)局(APHIS) 解除了同樣采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Z6 的管制。在該馬鈴薯品種中，RNAi 介導(dǎo)的靶基因沉默可以防止馬鈴薯擦傷，減少丙烯酰胺的含量，并提高淀粉質(zhì)量[49]。然而，這種基于農(nóng)桿菌侵染植物實(shí)現(xiàn)核酸農(nóng)藥遞送的方式仍然存在不足之處。例如，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體物種有限，單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，往往具有較低的轉(zhuǎn)化率和外源基因表達(dá)水平，大多數(shù)單子葉植物無(wú)法通過(guò)農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化[50]。

2.2 可噴灑核酸農(nóng)藥

基于SIGS 技術(shù)的可噴灑核酸農(nóng)藥不需要植物轉(zhuǎn)化就可以為植物提供病蟲(chóng)害的高度定向保護(hù)，不受因植物轉(zhuǎn)化所涉及的技術(shù)挑戰(zhàn)以及獲得監(jiān)管批準(zhǔn)的時(shí)間和成本的限制，近年來(lái)得到了蓬勃發(fā)展。2019 年，拜耳公司向EPA 提交了全球首個(gè)可噴灑核酸農(nóng)藥新產(chǎn)品BioDirect，該產(chǎn)品可顯著降低養(yǎng)蜂業(yè)的主要害蟲(chóng)狄斯瓦螨Varroadestructor的存活率，卻對(duì)蜜蜂沒(méi)有影響[47]。2021 年，拜耳將該產(chǎn)品專(zhuān)利授權(quán)給Greenlight Biosciences 公司進(jìn)行生產(chǎn)，新產(chǎn)品預(yù)計(jì)2024 年上市[6]。馬鈴薯甲蟲(chóng)因其對(duì)RNAi 反應(yīng)的高度敏感性成為了核酸農(nóng)藥公司研發(fā)可噴灑核酸農(nóng)藥的焦點(diǎn)。2021 年，先正達(dá)公司在田間驗(yàn)證了直接噴灑dsRNA 用于控制馬鈴薯甲蟲(chóng)的可行性，相關(guān)產(chǎn)品預(yù)計(jì)在7～10 年內(nèi)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[51]。2022 年，Greenlight Biosciences 公司研發(fā)的可噴灑核酸農(nóng)藥ledprona 通用名獲得國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織 (ISO) 的批準(zhǔn) (https://committee.iso.org/)，葉面噴施該產(chǎn)品可以有效防治馬鈴薯甲蟲(chóng)，Greenlight Biosciences 公司就該產(chǎn)品已向EPA 提交申請(qǐng)登記。

總體而言，核酸農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展迅速，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的選擇。隨著核酸合成技術(shù)的進(jìn)一步成熟和市場(chǎng)需求的增加，核酸農(nóng)藥在未來(lái)將得到進(jìn)一步的研發(fā)和推廣，同時(shí)可噴灑核酸農(nóng)藥展現(xiàn)出良好的商業(yè)化前景。可噴灑核酸農(nóng)藥的應(yīng)用效率與dsRNA 在環(huán)境中的穩(wěn)定性密切相關(guān)，研發(fā)安全高效的保護(hù)遞送系統(tǒng)已成為克服可噴灑核酸農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化瓶頸的前沿?zé)狳c(diǎn)。

3 納米材料介導(dǎo)的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)

核酸農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力和商業(yè)價(jià)值，然而，其應(yīng)用效果受環(huán)境因素影響較大，噴灑使用后易降解失效，嚴(yán)重限制了核酸農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，納米科技的迅猛發(fā)展為安全、高效、穩(wěn)定地向靶標(biāo)對(duì)象 (植物、昆蟲(chóng)等)遞送核酸農(nóng)藥提供了新途徑，基于納米材料負(fù)載核酸農(nóng)藥的納米遞送系統(tǒng) (圖1) 相關(guān)研究備受關(guān)注。

圖1 納米材料介導(dǎo)的dsRNA/siRNA 傳遞系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic representation of nanomaterial-mediated dsRNA/siRNA delivery systems

3.1 納米材料的優(yōu)勢(shì)

國(guó)際上關(guān)于納米材料和納米尺度的定義尚無(wú)統(tǒng)一規(guī)定[52-53]。我國(guó)關(guān)于納米材料的定義為任一外部維度、內(nèi)部或表面結(jié)構(gòu)處于納米尺度 (1～100 nm)的材料稱(chēng)為納米材料 (https://openstd.samr.gov.cn/bzgk/gb/)。納米材料作為新興的核酸遞送載體，在提高核酸農(nóng)藥轉(zhuǎn)染效率、干擾效率和穩(wěn)定性等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

1) 提高轉(zhuǎn)染效率。據(jù)報(bào)道，由介孔二氧化硅納米顆粒、層狀雙氫氧化物納米片和碳納米管等納米材料負(fù)載DNA 或RNA，可在沒(méi)有機(jī)械輔助(例如基因槍、超聲波、渦旋和電穿孔等) 條件下穿透植物細(xì)胞和病原菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，從而產(chǎn)生瞬時(shí)或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化[54]。納米材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方式已成功應(yīng)用于煙草、玉米、擬南芥、洋蔥等作物，展現(xiàn)出普適性[55]。

2) 提升干擾效率。Avila 等[56]設(shè)計(jì)了一種基于兩親性肽的納米膠囊負(fù)載BiP(Binding protein) 基因 (編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熱休克蛋白) 的dsRNA，飼喂法生物測(cè)定結(jié)果表明，相較于裸BiP-dsRNA，BiPdsRNA 納米膠囊可縮短豌豆蚜Acyrthosiphon pisum幼蟲(chóng)的死亡時(shí)間，并顯著提高赤擬谷盜Tribolium castaneum的死亡率。

3) 增加dsRNA 穩(wěn)定性。納米材料可以將dsRNA包裹在其表面或內(nèi)部，其本身的尺寸和結(jié)構(gòu)可以提供物理屏障，防止dsRNA 與酶相互作用，從而增強(qiáng)dsRNA 的穩(wěn)定性。例如，Ma 等[57]利用一種星狀陽(yáng)離子聚合物納米載體 (star polycation，SPc)對(duì)dseGFP進(jìn)行負(fù)載后形成dsRNA/SPc 復(fù)合物，RNase A 酶和昆蟲(chóng)血淋巴處理不會(huì)造成復(fù)合物中dseGFP的降解，表明該納米載體對(duì)dseGFP提供了強(qiáng)有力的保護(hù)作用。Christiaens 等[58]發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)苷酸聚合物作為納米載體可以防止外源dsRNA 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua堿性腸道中的降解，證明了該類(lèi)納米材料對(duì)核酸具有高效保護(hù)性。此外，納米材料還可以克服昆蟲(chóng)腸道圍食膜、植物表皮以及昆蟲(chóng)體壁等障礙，進(jìn)而顯著提升RNAi效率和病蟲(chóng)害控制效果[9,11-12]。

3.2 核酸農(nóng)藥的負(fù)載

通過(guò)納米材料的負(fù)載，可有效延長(zhǎng)核酸農(nóng)藥在環(huán)境中的降解周期以及保護(hù)核酸農(nóng)藥免受生物機(jī)體的免疫識(shí)別。納米材料應(yīng)該具有結(jié)合或封裝核酸分子的能力，這是其負(fù)載核酸農(nóng)藥的一個(gè)重要前提。通常情況下，帶正電荷的納米材料可與帶負(fù)電荷的RNA 分子，通過(guò)靜電作用形成dsRNA/siRNA-納米材料復(fù)合物[59-60]。例如：殼聚糖含有大量的氨基，在生物微酸性條件下帶有正電荷，其可以通過(guò)靜電作用負(fù)載RNA，形成RNA-殼聚糖復(fù)合物[61-62]；樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物的表面具有大量帶正電荷的胺類(lèi)官能團(tuán)，可以與負(fù)電性的dsRNA/siRNA 結(jié)合，完成核酸農(nóng)藥的負(fù)載[63]。同樣的，支鏈兩親性肽膠囊的表面具有大量的陽(yáng)離子賴(lài)氨酸基團(tuán)，其可以與核酸分子形成dsRNA/siRNA-支鏈兩親性肽膠囊復(fù)合物[64]。對(duì)于負(fù)載率低的無(wú)機(jī)納米材料，可以對(duì)其表面進(jìn)行多官能團(tuán) (-NH2、-CHO 和-OH 等) 修飾，使其通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)作用或者配體反應(yīng)等與核酸分子結(jié)合[65-66]。Zhao 等[66]采用帶正電荷的聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine，PEI) 對(duì)四氧化三鐵磁性納米顆粒 (magnetic nanoparticle，MNP) 進(jìn)行表面修飾后作為DNA 載體，可以與電負(fù)性DNA 結(jié)合，并凝聚形成MNPDNA 復(fù)合物。Yang 等[67]利用陽(yáng)離子聚酰胺樹(shù)狀分子 (polyamidoamine dendrimer，PAMAM) 來(lái)改善碳納米管的功能特性，使其與帶負(fù)電荷的siRNA 發(fā)生靜電相互作用，從而增加碳納米管對(duì)核酸分子的負(fù)載。脂質(zhì)體可以通過(guò)將核酸分子包裹在其親水內(nèi)核，從而完成負(fù)載結(jié)合[60,68]，而脂質(zhì)納米顆粒則是通過(guò)具有的陽(yáng)離子脂質(zhì)與核酸物質(zhì)通過(guò)靜電絡(luò)合作用在其內(nèi)部形成膠束結(jié)構(gòu)，從而完成核酸農(nóng)藥的負(fù)載[69]。

3.3 細(xì)胞攝取與內(nèi)體逃逸

細(xì)胞攝取是影響核酸農(nóng)藥對(duì)宿主細(xì)胞有效生物利用度的重要因素。核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)可以利用細(xì)胞壁間的孔洞 (例如花粉孔、葉面氣孔)直接穿過(guò)細(xì)胞壁[70]。表面帶有正電荷的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)可以與帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面結(jié)合，在胞吞作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[53,59,71]。因此，具有正電荷的陽(yáng)離子納米載體材料較中性或陰離子納米載體材料更容易被細(xì)胞攝取，表現(xiàn)出更高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率[71-72]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，dseGFP/SPc 處理可顯著上調(diào)Sf9 細(xì)胞的Chc基因 (編碼網(wǎng)格蛋白的包被凹坑和囊泡表面結(jié)構(gòu)的主要多肽[73])、AP2S1基因 (編碼AP2 異四聚體復(fù)合物的σ 亞單位，AP2 復(fù)合物是網(wǎng)格蛋白包被小泡的核心成分，促進(jìn)膜蛋白的內(nèi)吞作用[74])、Arf1基因 (ARF 蛋白通過(guò)募集各種輔助蛋白構(gòu)成運(yùn)輸囊泡，是內(nèi)吞作用中的關(guān)鍵蛋白[75])等關(guān)鍵基因的表達(dá)，激活網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)dsRNA 的攝?。贿M(jìn)一步采用質(zhì)子泵抑制劑 (抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用) 巴佛洛霉素A (bafilomycin-A，Baf A) 體外處理Sf9細(xì)胞后，dseGFP/SPc 無(wú)法激活細(xì)胞內(nèi)的RNAi 效應(yīng)；該研究證明了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是細(xì)胞攝取SPc 介導(dǎo)的dsRNA 遞送的主要途徑[57]。

核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)通過(guò)內(nèi)吞作用被內(nèi)化形成內(nèi)吞囊泡，若其不能從內(nèi)體及時(shí)逃逸，則會(huì)與內(nèi)體一起進(jìn)入溶酶體中從而降解，從而限制核酸農(nóng)藥的細(xì)胞生物利用度。目前研究表明，大多數(shù)RNA 納米遞送系統(tǒng)內(nèi)體逃逸的重要機(jī)制為“質(zhì)子海綿效應(yīng)”[68,76]，即RNA 納米遞送系統(tǒng)進(jìn)入內(nèi)體后，為緩沖內(nèi)體內(nèi)的酸性環(huán)境而吸收大量質(zhì)子，大量質(zhì)子涌入內(nèi)吞囊泡導(dǎo)致內(nèi)體的滲透性水腫脹，最終導(dǎo)致內(nèi)體破裂，完成內(nèi)體逃逸[77-78]。值得注意的是，陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆粒具有獨(dú)特的內(nèi)體逃逸機(jī)制，它們通過(guò)識(shí)別并結(jié)合內(nèi)體膜上的磷脂分子，從而破壞內(nèi)體的穩(wěn)定性，完成內(nèi)體逃逸并釋放所負(fù)載的dsRNA/siRNA[79-80]。納米遞送載體或可以促進(jìn)核酸農(nóng)藥的內(nèi)體逃逸。例如，Ma等[57]通過(guò)激光共聚焦顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與裸露的dsRNA 相比，dseGFP/SPc 孵育的Sf9 細(xì)胞的晚期核內(nèi)體中沒(méi)有dsRNA 的積累，表明SPc 納米載體可以促進(jìn)dsRNA 的內(nèi)體逃逸。

3.4 核酸農(nóng)藥的釋放

核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)具有生物活性的本質(zhì)是基于dsRNA/siRNA 的RNAi 作用。因此，dsRNA/siRNA 必須從納米載體中釋放出來(lái)才能激活RNAi途徑，抑制靶標(biāo)生物特異mRNA 的表達(dá)，最終發(fā)揮核酸農(nóng)藥的生物效應(yīng)。然而，目前關(guān)于dsRNA/siRNA 從納米載體中的釋放機(jī)制研究報(bào)道相對(duì)較少。

2001 年，Moret 等[81]研究發(fā)現(xiàn)，肝素、硫酸軟骨素等生物體內(nèi)的聚陰離子可以解離穩(wěn)定的DNA 與PEI 復(fù)合物PEI-DNA，釋放DNA。2004年，Okuda 等[82]首次在體外證明了PEI-DNA 復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中的解離，并且發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子含量比例低的陽(yáng)離子聚合物類(lèi)納米材料-DNA 復(fù)合物可以自主釋放DNA；該研究表明，具有較高親和力的生物體內(nèi)聚陰離子可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，導(dǎo)致PEI-DNA的解離，并將DNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)中。然而，這種競(jìng)爭(zhēng)性的置換過(guò)程通常是非常緩慢的[83]。

納米材料響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)刺激而造成的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)崩解是另一種誘導(dǎo)核酸農(nóng)藥釋放的機(jī)制。該類(lèi)納米材料自身的物理或化學(xué)性質(zhì)可以在生物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境因素的刺激下發(fā)生響應(yīng)性改變，如胞漿pH 值和氧化還原性的改變從而誘導(dǎo)遞送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)崩解[83]。例如：聚(β-氨基酯) (poly(β-aminoester)s) 是一種基因遞送常用的陽(yáng)離子聚合物，其解離速率取決于環(huán)境pH 和組成聚合物的鏈構(gòu)象[84-86]；含有二硫鍵 (S－S) 的核酸納米遞送系統(tǒng)在組織或細(xì)胞中谷胱甘肽的氧化還原刺激下，其二硫鍵被催化斷裂，進(jìn)而響應(yīng)釋放裝載的核酸分子[87]。

3.5 基于納米材料遞送核酸農(nóng)藥的應(yīng)用進(jìn)展

基于RNAi 的病蟲(chóng)害防治技術(shù)正在給農(nóng)藥領(lǐng)域帶來(lái)革命性的變化，因?yàn)槠溽槍?duì)的是有害生物的遺傳基因，而不是下游的蛋白質(zhì)，這為許多棘手的病蟲(chóng)害防治提供了潛在的防治可能。為了解決核酸農(nóng)藥自身的局限性，開(kāi)發(fā)能夠促進(jìn)核酸農(nóng)藥分子進(jìn)入到靶標(biāo)生物細(xì)胞的高效遞送系統(tǒng)尤為重要。目前，基于載體的核酸農(nóng)藥遞送系統(tǒng)按其遞送載體的來(lái)源和性質(zhì)，可以分為病毒類(lèi)和非病毒類(lèi)遞送載體兩種類(lèi)型。病毒類(lèi)載體是通過(guò)改造病毒來(lái)遞送目標(biāo)基因的常用工具，具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，但其存在制備工藝復(fù)雜、成本昂貴、可載入基因片段大小有限 (通常低于7 kb) 且容易引起機(jī)體免疫反應(yīng)等缺陷，極大地限制了病毒類(lèi)載體的應(yīng)用[88]。而非病毒類(lèi)遞送載體因其具有低免疫性、低毒性和高安全性等優(yōu)勢(shì)逐步成為核酸農(nóng)藥遞送載體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[89]。近年來(lái)，納米材料作為新興的非病毒類(lèi)核酸遞送載體，在新型核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)中得到了廣泛的關(guān)注 (表1)。在此基礎(chǔ)上，本小節(jié)對(duì)基于有機(jī)(脂質(zhì)、聚合物、多肽) 和無(wú)機(jī) (碳、層狀雙氫氧化物) 納米材料的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)研究報(bào)道進(jìn)行歸納綜述。

3.5.1 基于脂質(zhì)的納米材料 基于脂質(zhì)的納米材料是一類(lèi)用途極為廣泛的非病毒類(lèi)核酸載體材料，在各種生理環(huán)境下具有穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，并且可以輕松地與各種生物膜結(jié)合，從而能夠有效地遞送核酸分子[60,108]。脂質(zhì)通常被定義為疏水性或兩親性分子，在結(jié)構(gòu)組成上包括一個(gè)親水性的頭部和一個(gè)疏水性的尾部，以及它們之間的連接物?；谥|(zhì)的納米材料通常含有一定的脂質(zhì)成分，如磷脂、膽固醇或聚乙二醇組分等。由于合成方法、脂質(zhì)成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)等存在差異，目前用于核酸遞送的脂質(zhì)納米材料可劃分為脂質(zhì)體與脂質(zhì)納米顆粒兩種類(lèi)型 (圖2)[69,109]。

圖2 脂質(zhì)體 (左) 和脂質(zhì)納米粒 (右) 的示意圖[109]Fig.2 Schematic representation of liposomes (left) and lipid nanoparticles (right)[109]

3.5.1.1 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是由脂質(zhì)自組裝成有序排列的雙分子層封閉囊泡，具有親水的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu) (圖2 左)。脂質(zhì)體由于其良好的生物相容性、生物降解性、低毒性以及遞送親水和親脂性藥物的能力，已成為促進(jìn)小分子和大分子傳遞的強(qiáng)大藥物載體[110-111]。Lin 等[90]將靶向德國(guó)小蠊Blattella germanica微管蛋白基因 (α-tubulin，Tub) 的dsRNA(dsTub) 封裝進(jìn)脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體可以有效防止該dsTub在中腸中的降解，飼喂dsTub/脂質(zhì)體復(fù)合物的基因沉默效率達(dá)60%，顯著提高了dsTub處理害蟲(chóng)的死亡率。類(lèi)似地，Castellanos 等[91]利用脂質(zhì)體2000 封裝靶向ATP 酶 (vATPase A) 和肌肉肌動(dòng)蛋白 (act-2) 的dsRNA，飼喂新熱帶區(qū)褐臭蝽Euschistus heros上述復(fù)合物，14 d 后可以導(dǎo)致45%和42%的試蟲(chóng)死亡，相較于裸露的dsRNA和dsRNA/EDTA 處理，dsRNA/脂質(zhì)體系統(tǒng)具有更好的遞送效果。盡管脂質(zhì)體作為核酸農(nóng)藥載體有很大優(yōu)勢(shì)，但其合成方法較復(fù)雜，并需要使用大量的有機(jī)溶劑，這可能會(huì)不利于其大規(guī)模生產(chǎn)[111]。

3.5.1.2 脂質(zhì)納米顆粒 脂質(zhì)納米顆粒 (lipid nanoparticles，LNPs) 在廣義上是指以脂質(zhì)形成的納米顆粒，是用來(lái)描述一種不同于脂質(zhì)體的特定類(lèi)型的納米顆粒[109]。從組成上，LNPs 與脂質(zhì)體的主要成分大致相同，都含有脂質(zhì)和膽固醇，但形成LNPs 的脂質(zhì)必須包含可電離脂質(zhì)，而脂質(zhì)體則對(duì)此沒(méi)有嚴(yán)格的限制。從各成分比例上看，LNPs與脂質(zhì)體之間存在較大的差異，尤其是中性輔助脂類(lèi) (膽固醇、磷脂等) 的用量，LNPs 需要物質(zhì)的量之比 (摩爾比例) 在30%～40%的輔助脂類(lèi)，才能有效封裝dsRNA/siRNA[109]。從形貌來(lái)上，LNPs沒(méi)有脂質(zhì)體的親水空腔，相反，其內(nèi)部具有膠束結(jié)構(gòu)[69,109](圖2 右)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所任廣偉團(tuán)隊(duì)采用PEI 修飾的LNPs 封裝昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因，即保幼激素受體基因 (Methoprenetolerant，Met) 的dsRNA，成功制備了Met3@PEI@LNPs 納米復(fù)合物 (385 nm，-36.9 mV)，其細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到96.4%；飼喂法生物測(cè)定結(jié)果表明，在僅為對(duì)照組25%的dsRNA 濃度下，Met3@PEI@LNPs 處理的草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda干擾效率仍高達(dá)91.7%，顯著控制了草地貪夜蛾種群數(shù)量[92]。與脂質(zhì)體相比，LNPs 具有更高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度，且易于大規(guī)模生產(chǎn)。

3.5.2 聚合物納米材料 聚合物納米材料 (polymer nanoparticles，PNPs) 是指由小分子化合物通過(guò)聚合反應(yīng)形成的具有納米尺度 (1～1000 nm) 的一類(lèi)膠體材料，具有較高生物安全性、廣泛結(jié)構(gòu)多樣性和良好生物降解性[112]。因具有易于合成、結(jié)構(gòu)多樣、高轉(zhuǎn)染效率和生物相容性等特性，PNPs 成為了非病毒類(lèi)核酸分子遞送載體的主要材料，被廣泛應(yīng)用于基因治療和核酸農(nóng)藥遞送領(lǐng)域。

3.5.2.1 殼聚糖 殼聚糖是天然多糖甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，含有羥基和氨基，是最常用的天然聚合物材料之一。由于具有低成本、易于降解和生物相容性等特點(diǎn)，殼聚糖納米顆粒 (chitosan nanoparticles，CNPs) 已被廣泛應(yīng)用于dsRNA、siRNA、質(zhì)粒、寡核苷酸、多肽、甚至蛋白質(zhì)等生物分子遞送[97,113-114]。Zhang 等[93]于2010 年首次利用CNPs (70 nm) 裝載dsRNA，發(fā)現(xiàn)飼喂dsRNA/CNPs 復(fù)合物 (100～200 nm) 可以顯著增加岡比亞按蚊Anopheles gambiae AgCHS1基因的沉默效率(62.8%)。Kumar 等[61]研究表明，dsRNA/CNPs 復(fù)合物 (100～200 nm，+12 mV，包封率85%) 可以明顯抑制與翅膀發(fā)育相關(guān)的Vg基因的表達(dá)，顯著提高埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲(chóng)的死亡率，延遲幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，并導(dǎo)致成蟲(chóng)翅膀畸形。Lichtenberg 等[94]證明，采用dsRNA/CNPs (CNPs：15.6 nm ± 3.5 nm，+29 mV ± 4.0 mV) 浸泡處理秀麗隱桿線蟲(chóng)，比僅使用dsRNA 處理具有更高的轉(zhuǎn)染效率和沉默效率；另外發(fā)現(xiàn)，CNPs 可以下調(diào)線蟲(chóng)體內(nèi)肌凝蛋白的表達(dá)。Kolge 等[95]發(fā)現(xiàn)，CNPs(100 nm，+32 mV) 可以有效介導(dǎo)針對(duì)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera保幼激素甲基轉(zhuǎn)移酶(Juvenile hormone methyltransferase，JHAMT) 和乙酰膽堿酯酶 (Acetylcholine esterase，ACHE) 靶基因的dsRNA 的遞送，提高dsRNA 沉默效率和抑制相關(guān)酶活性，室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果表明，僅噴灑1 mL dsRNA/CNPs 復(fù)合物(200 μg:1000 ng)可使害蟲(chóng)死亡率達(dá)100%，且對(duì)非靶標(biāo)生物黑腹果蠅Drosophila melanogaster和斜紋夜蛾Spodoptera litura無(wú)影響。類(lèi)似地，CNPs (95 nm，+36 mV)可有效保護(hù)針對(duì)棉鈴蟲(chóng)中性脂肪酶 (HaLipn 001)和幾丁質(zhì)酶靶基因的dsRNA 在昆蟲(chóng)腸道核酸酶和不同pH 條件下的降解，通過(guò)飼喂法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，dsRNA/CNPs 復(fù)合物可有效地沉默脂肪酶和幾丁質(zhì)酶靶基因 (2.0～2.7 倍下調(diào))，并抑制其酶活性(2.0～5.3 倍)[96]。

通過(guò)將殼聚糖與三聚磷酸鈉 (tripolyphosphate，TPP)、葉酸、聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯亞胺和葡聚糖硫酸鹽等交聯(lián)劑結(jié)合，可進(jìn)一步提高其對(duì)dsRNA/siRNA 的保護(hù)能力，并提高轉(zhuǎn)染效率和沉默效率[115-116]。例如，Dhandapani 等[97]將殼聚糖與TPP 交聯(lián)，合成了粒徑小于200 nm 載有dsRNA 的納米復(fù)合物 (CS-TPPdsRNA)，其使埃及伊蚊的死亡率提高到60%以上，而同樣條件下，dsRNA-殼聚糖納米復(fù)合物(CS-dsRNA) 的死亡率僅為35%。Lyu 等[98]將松香改性的PEG 與殼聚糖交聯(lián) (rosin-modified polyethylene glycol and chitosan，ROPE@C) (418 nm，+26.5 mV) 負(fù)載褐飛虱Nilaparvata lugens(Brown planthopper，BPH) 體內(nèi)幾丁質(zhì)合成酶基因A(Chitin synthetase A，CHSA) 的dsRNA (dsNlCHSA)，得到了dsNlCHSA/ROPE@C 納米遞送系統(tǒng) (圖3)。點(diǎn)滴法測(cè)定結(jié)果表明，dsNlCHSA/ROPE@C 可以使CHSA的相對(duì)表達(dá)量降低54.3%，BPH 的死亡率為65.8%。

圖3 dsRNA/ROPE@C/APG 納米遞送系統(tǒng)示意圖[98]Fig.3 Schematic diagram of dsRNA/ROPE@C/APG nano-formulation[98]

總的來(lái)說(shuō)，CNPs 及其衍生物價(jià)格低廉、可生物降解、含量豐富、可大規(guī)模生產(chǎn)，是遞送核酸農(nóng)藥的理想材料之一。然而，CNPs 及其衍生物提高RNAi 效率的能力似乎是特異性的，因此在納入基于RNAi 的控制策略之前，需要對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行有效性測(cè)試[117]。

3.5.2.2 樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物 樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物是一類(lèi)由重復(fù)單元組成超分支球狀結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子聚合物。樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物的內(nèi)部也有大量叔胺基，這些叔胺基可以在酸性細(xì)胞內(nèi)體中被質(zhì)子化，從而啟動(dòng)“質(zhì)子海綿效應(yīng)”[63]。因此樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物具有高負(fù)載率和高轉(zhuǎn)染效率的特點(diǎn)。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰團(tuán)隊(duì)在該領(lǐng)域做了許多工作，他們構(gòu)建了一系列以酰亞胺衍生物為內(nèi)核的核殼結(jié)構(gòu)熒光陽(yáng)離子納米顆粒 (fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NPs)，作為dsRNA 遞送載體，表現(xiàn)出良好的靶標(biāo)生物防治效果[99,118-120]。采用飼喂的方式，通過(guò)FNPs 遞送幾丁質(zhì)酶基因CHT10的dsRNA 可以顯著降低亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis的體重，并導(dǎo)致幼蟲(chóng)脫皮缺陷和死亡[99]。為了更貼合實(shí)際應(yīng)用，該團(tuán)隊(duì)后續(xù)開(kāi)發(fā)了一種dsRNA/FNPs/表面活性劑的配方，只需要點(diǎn)滴在大豆蚜Aphis glycines4 齡幼蟲(chóng)的背板處，即可在1h 內(nèi)穿透蚜蟲(chóng)角質(zhì)層進(jìn)入血腔，具有較高的基因沉默效應(yīng) (95.4%) 和良好的控制效果 (80.5%)[12]。然而，合成FNPs 的經(jīng)濟(jì)成本過(guò)高，這限制了其作為核酸農(nóng)藥遞送載體走向田間大規(guī)模應(yīng)用?；诖耍搱F(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種低成本、低細(xì)胞毒性、高基因轉(zhuǎn)染效果的星形陽(yáng)離子聚合物 (SPc) 納米材料(100.5 nm，+20.9 mV) (圖4)[121]。該材料以商業(yè)化成本低廉的季戊四醇為原材料，不僅簡(jiǎn)化了合成步驟，而且減少了有機(jī)溶劑的使用，在核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。Yang等[100]利用SPc 與可以抑制植物側(cè)根發(fā)育基因的雙鏈微小RNA (microRNA，miRNA) 組裝形成納米復(fù)合物 (253.6 nm ± 5.0 nm，+14.03 mV) ds-miRNA/SPc，處理擬南芥Arabidopsis thaliana幼苗后的表型與過(guò)表達(dá)miRNA 的轉(zhuǎn)基因擬南芥相似。Yan 等[11]將針對(duì)ATP 酶 (V-ATPaseD) 和幾丁質(zhì)合酶 (CHS1)基因的dsRNA/SPc 制劑 (沉默效率為86.86%～58.87%) 直接噴灑在大豆幼苗上，大豆蚜取食后其死亡率可達(dá)78.5%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，采用CNP/SPc 復(fù)合物 (CNP/SPc complex，CSC) 作為dsRNA納米載體，以真核RNAi 機(jī)制的核心組件Argonaute蛋白 (AGO) 為靶基因，在水稻表面噴灑dsAGO/CSC復(fù)合物，能夠?qū)⑺救~片上立枯絲核菌Rhizoctonia solani的病變面積減少92%，且持效期長(zhǎng)達(dá)20 d[101]。然而，最近Yan 等[122]研究表明，SPc 材料本身對(duì)模式生物黑腹果蠅具有生物毒性，除對(duì)成蟲(chóng)具有急性毒性外，SPc 對(duì)新生幼蟲(chóng)的壽命、生育能力、攀爬能力和抗逆性也產(chǎn)生了不利影響。

圖4 基于SPc 的核酸農(nóng)藥遞送系統(tǒng)用于害蟲(chóng)防治[121]Fig.4 SPc as a highly efficient gene vector in pest management[121]

總的來(lái)說(shuō)，SPc 材料作為核酸農(nóng)藥載體具有巨大的應(yīng)用潛力，但應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化和開(kāi)發(fā)新的配方，提高對(duì)非靶標(biāo)生物的特異性，以降低環(huán)境安全與人類(lèi)健康的風(fēng)險(xiǎn)[117]。

3.5.2.3 胍類(lèi)聚合物 胍類(lèi)聚合物 (guanidinecontaining polymers，GCPs) 是一類(lèi)分子鏈中存在胍基基團(tuán)的聚合物?？茖W(xué)研究表明，dsRNA/siRNA對(duì)堿性環(huán)境非常敏感，在強(qiáng)堿性環(huán)境下易被水解[53]，而鱗翅目害蟲(chóng)的腸道微環(huán)境為堿性，pH 值甚至可以達(dá)到12.0，這可能是鱗翅目昆蟲(chóng)RNAi技術(shù)的最大挑戰(zhàn)[123]。胍基是堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿[124]，可以在高范圍堿性pH 環(huán)境中保持正電性，含有胍基的GCPs 可以與dsRNA/siRNA 結(jié)合并在強(qiáng)堿環(huán)境中保持穩(wěn)定?；诖耍珿CPs 材料或許可以為鱗翅目害蟲(chóng)的RNAi 提供新的途徑。例如，Christiaens等[58]合成了一種含有胍基的陽(yáng)離子聚甲基丙烯酸酯聚合物 (PAG87L)，研究表明，PAG87L 可以保護(hù)dsRNA 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua腸液 (pH =11.0) 中避免降解超過(guò)30 h，而裸dsRNA 僅10 min就完全降解；以幾丁質(zhì)合酶B 基因 (ChSB) 為靶標(biāo)基因，飼喂dsChSB/PAG8L7 復(fù)合物的甜菜夜蛾死亡率約為53.3%，飼喂對(duì)照裸dsChSB的死亡率僅為16.7%。Parsons 等[102]合成了另一種GCPs 材料——聚-N-(3-胍基丙基) 甲基丙烯酰胺 (poly-[N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide]，PGPMA) 負(fù)載斜紋夜蛾CDC27基因的dsRNA，與Sf9 細(xì)胞體外孵育48 h 后，Sf9 細(xì)胞中該基因的mRNA 水平減少了92%。用dsCDC27/PGPMA 復(fù)合物連續(xù)飼喂斜紋夜蛾3 齡幼蟲(chóng)7 d，29 d 后死亡率約為30%。

3.5.3 多肽納米材料 多肽是一類(lèi)由多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵共價(jià)連接的化合物。基于天然多肽的納米載體通常具有安全無(wú)毒、可生物降解等特點(diǎn)，已成為核酸農(nóng)藥載體材料的研究熱點(diǎn)之一。

3.5.3.1 支鏈兩親性肽膠囊 支鏈兩親性肽膠囊(branched amphiphilic peptide capsules，BAPCs) 是由兩親性氨基酸自組裝成雙層分隔的超分子納米囊泡，具有與脂質(zhì)體類(lèi)似但更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。Avila等[56]在赤擬谷盜和豌豆蚜的飼料中分別加入靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路基因 (BiP和Armet)的dsRNA/BAPCs 復(fù)合物，可以顯著抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊，若同時(shí)飼喂BiP-dsRNA 和Armet-dsRNA 與BAPCs 的復(fù)合物可導(dǎo)致赤擬谷盜3 齡幼蟲(chóng)75%的死亡率。此外，與單獨(dú)喂食裸BiP-dsRNA 相比，喂食BiP-dsRNA/BAPCs 復(fù)合物的豌豆蚜可提前6～9 d 死亡。該項(xiàng)研究表明，BAPCs 納米材料增強(qiáng)了口服dsRNA 的給藥效果并改善了RNAi 效應(yīng)。Wessel 等[125]最近的一項(xiàng)研究證明了BAPCs 可被一種常見(jiàn)的土壤真菌構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans降解，從而減少了這些納米顆粒對(duì)環(huán)境的潛在影響。目前，口服BAPCs 對(duì)其他害蟲(chóng)中產(chǎn)生RNAi 效應(yīng)的潛力仍需進(jìn)一步的研究證明[117]。

3.5.3.2 細(xì)胞膜穿透肽 細(xì)胞膜穿透肽 (cellmembrane penetrating peptides，CPPs) 是一種具有穿透生物膜系統(tǒng)功能的短肽的統(tǒng)稱(chēng)。CPPs 可以作為siRNA、蛋白質(zhì)、附加肽和其他生物小分子的載體，增加細(xì)胞對(duì)dsRNA 的攝取并協(xié)助其在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體逃逸[126-127]。在CPP 家族中，富含精氨酸的Tat 肽 (AYGRKKRRQRRR) 已被證明可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功地內(nèi)化質(zhì)粒DNA 和激素[128-129]。肽蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (peptide transduction domain，PTD) 是Tat 肽的一個(gè)改進(jìn)型小分子多肽。該結(jié)構(gòu)域包括血凝素肽的脂質(zhì)融合特性，它可以在胞吞作用后破壞囊泡膜，將裝載的生物分子分散到細(xì)胞質(zhì)中[130]。通過(guò)將PTD 與dsRNA 結(jié)合域 (dsRNA binding domain，DRBD) 配對(duì)結(jié)合，可以形成核糖核蛋白顆粒 (ribonucleoprotein particles，RNPs) 來(lái)攜帶dsRNA 穿過(guò)細(xì)胞膜，逃離內(nèi)體，并誘導(dǎo)沉默[103]。Gillet 等[103]發(fā)現(xiàn)，RNPs 可以增強(qiáng)dsRNA在酸性條件下的耐受性和提高dsRNA 在Sf21 細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染效率。飼喂棉鈴象甲Anthonomus grandis靶向幾丁質(zhì)合酶II (Ag-ChSII) 基因的RNPs可以降低Ag-ChSII基因80%的轉(zhuǎn)錄水平，顯著高于裸dsRNA 處理 (30%) (圖5)。該研究證明了CPPs遞送dsRNA 到昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)方面的實(shí)用性，但目前未見(jiàn)有關(guān)CPPs 介導(dǎo)的核酸農(nóng)藥遞送系統(tǒng)在其他害蟲(chóng)中應(yīng)用的報(bào)道。

圖5 dsRNA 與PTD-DRBD 聯(lián)合口服傳遞的機(jī)制模型[103]Fig.5 Model for the mechanism of oral delivery of dsRNA combined with PTD-DRBD[103]

3.5.4 碳基納米材料 碳基納米材料是指具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的碳材料。已有研究表明，碳基納米材料在遞送核酸分子方面表現(xiàn)出良好的基因轉(zhuǎn)染效率，與商業(yè)脂質(zhì)體2000 相比具有較低的細(xì)胞毒性[131]。此外，碳基納米材料的合成成本廉價(jià)且技術(shù)成熟，易被多功能化修飾[132]。這些特性使得碳基納米材料成為一種新興的核酸傳遞工具，在核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

3.5.4.1 碳納米管 碳納米管 (carbon nanotubes，CNTs) 是一種由碳原子組成的管狀中空納米材料，主要包括單壁碳納米管 (single wall carbon nanotubes，SWNTs) 和多壁碳納米管 (multiwalled carbon nanotubes，MWNTs)。由于其疏水性的特點(diǎn)，CNTs 的生物相容性較差，實(shí)際應(yīng)用中通常需要對(duì)其進(jìn)行功能化或表面修飾。2009 年，CNTs首次被報(bào)道用作植物基因傳遞載體，該研究將氧化的SWNTs 與單鏈DNA 結(jié)合，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物可以在不使用基因槍的情況下穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜[133]。雖然該研究證明了CNTs 可以遞送DNA 進(jìn)入有壁細(xì)胞，但SWNTs 在植物細(xì)胞中的內(nèi)化機(jī)制尚未得到詳細(xì)研究。除了SWNTs 外，MWNTs 也被證明具有穿透植物細(xì)胞的能力。Serag 等[134]利用透射電鏡和共聚焦成像技術(shù)闡明了MWNTs 進(jìn)入植物原生質(zhì)體的內(nèi)化機(jī)制，研究結(jié)果表明，植物原生質(zhì)體對(duì)MWNTs 的攝取是通過(guò)胞吞-內(nèi)體逃逸模式完成的。隨后的研究也報(bào)道了CNTs 攜帶其他核酸分子進(jìn)入植物細(xì)胞的能力，例如質(zhì)粒DNA[135]、dsRNA[104]和siRNA[136]。Demirer 等[136]研究表明，SWNTs 介導(dǎo)的siRNA 傳遞可以在mRNA水平上達(dá)到95%的基因沉默效率，顯著減少核酸酶對(duì)siRNA 的降解作用。Edwards 等[104]采用聚酰胺樹(shù)狀分子 (PAMAM) 對(duì)CNTs 進(jìn)行表面修飾得到PAMAM-CNTs 顆粒，相較于注射裸dsRNA，向赤擬谷盜幼蟲(chóng)體內(nèi)注射PAMAM-CNTs-dsRNA復(fù)合物可以顯著提高對(duì)靶標(biāo)基因的沉默效率；然而，注射高劑量的 PAMAM-CNTs 顆粒(200 μg/mL)在60 h 后對(duì)赤擬谷盜4 齡幼蟲(chóng)產(chǎn)生了明顯的生物毒性。因此，對(duì)于未來(lái)的研究，需要對(duì)CNTs 本身的毒性和在生物體內(nèi)的降解進(jìn)行長(zhǎng)期評(píng)估，以充分證明CNTs作為核酸農(nóng)藥載體在農(nóng)業(yè)中的安全使用。

3.5.4.2 碳量子點(diǎn) 碳量子點(diǎn)也稱(chēng)碳點(diǎn) (carbon dots，CDs)，通常被定義為具有顯著熒光性能，粒徑小于10 nm 的球形碳顆粒，是一種新興的碳納米功能材料。CDs 具有可光致發(fā)光性、高分散性、低毒性、生物相容性、生物降解性、原材料來(lái)源廣泛和低成本等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用在生物成像、癌癥治療、光電子器件、催化、功能材料和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[137]。與CNTs 相似，運(yùn)用CDs 遞送核酸分子時(shí)通常需要對(duì)其進(jìn)行表面修飾。Schwartz等[105]采用PEI 修飾的CD 材料 (CD-PEI，～3.9 nm)裝載編碼鎂螯合酶 (一種植物葉綠素合成必需酶)兩個(gè)亞基 (CHLH和CHLI) 基因的siRNA，通過(guò)噴灑的方式處理模式生物本氏煙草Nicotiana benthamiana的葉面，發(fā)現(xiàn)siRNA/CD-PEI 復(fù)合物表現(xiàn)出良好的沉默效率，可以抑制CHLH基因79%的轉(zhuǎn)錄水平。Das 等[138]通過(guò)飼喂法評(píng)估了CNP、CDPEI 和胺功能化二氧化硅3 種納米材料遞送埃及伊蚊關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育基因 (SNF7和SRC) dsRNA 后觸發(fā)的沉默效率，結(jié)果表明，CD-PEI 是保護(hù)和傳遞dsRNA 最有效的載體，具有更高的沉默效率和死亡率。最近，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉西莉團(tuán)隊(duì)制備了一種聚乙二醇異丙烯酸酯 (poly (ethylene glycol)diamine，PEGDA) 修飾的CDs (CDs 平均粒徑為2.6 nm) (圖6)，裝載靶向卵菌保守并且是兩類(lèi)殺菌劑靶標(biāo)蛋白的纖維素合酶基因 (CesA3) 和氧化固醇結(jié)合蛋白基因 (OSBP1) 的dsRNA，生物活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)CesA3-/OSBP1-dsRNA-CDs 對(duì)致病疫霉Phytophthora infestans、大豆疫霉Phytophthora sojae和辣椒疫霉Phytophthora capsici均表現(xiàn)出良好的防治效果[106]。此外，同時(shí)噴灑dsRNA-CDs 與作用靶標(biāo)相同的化學(xué)殺菌劑，在保證防效的同時(shí)可以減少90%化學(xué)藥劑的使用，這對(duì)農(nóng)藥的減施增效具有重要意義[106]。

圖6 基于碳量子點(diǎn)遞送dsRNA 來(lái)控制植物疫霉菌的可噴灑核酸農(nóng)藥模型[106]Fig.6 Working model of SIGS dependent on carbon dot delivered dsRNAs to control Phytophthora diseases[106]

3.5.5 層狀雙氫氧化物 層狀雙氫氧化物 (layered double hydroxides，LDHs) 是一種類(lèi)似天然水滑石的二維離子層狀納米顆粒，由帶正電荷的層板與層間陰離子組成。LDHs 的一般組成公式為[M2+(1-x)M3+x(OH)2]x+An-x/n·zH2O，其中M2+和M3+為二價(jià)和三價(jià)金屬離子，An-為層間電荷平衡陰離子。大量研究表明，LDHs 具有多用途特性，可以作為一種生物相容性、低毒性的基因和藥物載體[139]。LDHs 進(jìn)入植物細(xì)胞的方式包括自由擴(kuò)散和胞吞兩種[140]。由于存在植物細(xì)胞壁孔徑大小的限制，粒徑成為L(zhǎng)DHs 納米顆粒在植物細(xì)胞中成功內(nèi)化的關(guān)鍵因素。例如，Yong 等[107]發(fā)現(xiàn)，在50～120 nm 的粒徑范圍內(nèi)，粒徑為50 nm 的LDH納米顆粒在番茄Solanum lycopersicum花粉細(xì)胞中表現(xiàn)出最快的內(nèi)化速率，遞送dsRNA 至轉(zhuǎn)基因番茄10512i 的花粉細(xì)胞中可以造成GUS (β-glucuronidase) 報(bào)告基因的mRNA 水平下降89%，顯著高于相同劑量的單獨(dú)dsRNA 處理 (37%)。

澳大利亞昆士蘭大學(xué)Neena Mitter 與許志平合作開(kāi)發(fā)了一種基于LDHs 的RNA 農(nóng)藥噴霧制劑——LDH-dsRNA (BioClay)，以辣椒輕斑駁病毒和黃瓜花葉病毒 (cucumber mosaic virus，CMV) 特異性基因?yàn)榘谢?，僅葉面噴灑一次BioClay 就可以為豇豆Vigna unguiculata提供長(zhǎng)達(dá)20 d 的有效病毒防護(hù)，30 d 后仍可以檢測(cè)到葉片表面的dsRNA[25]。近年來(lái)，該團(tuán)隊(duì)利用高通量RNAi 手段篩選到煙粉虱Bemisia tabaci的致死基因，葉面噴施BioClay 在煙粉虱整個(gè)生命階段 (卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)) 都有良好的控制效果 (圖7)[24]。此外，LDH納米顆粒在濕潤(rùn)的CO2環(huán)境下就可以降解，并且在哺乳動(dòng)物中無(wú)毒性[25,139]。綜上所述，LDHs 納米材料在核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，其在進(jìn)入植物細(xì)胞后的系統(tǒng)保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

圖7 葉面噴施BioClay 可防治整個(gè)生命階段煙粉虱 (卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)) [24]Fig.7 Foliar-applied dsRNA-LDH (BioClay) provides safe and effective planta protection from whitefly eggs, nymphs, and adults[24]

4 核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的安全風(fēng)險(xiǎn)

農(nóng)藥的使用與食品安全和人類(lèi)健康息息相關(guān)。核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)作為一項(xiàng)新技術(shù)，其在實(shí)際應(yīng)用中的安全性問(wèn)題受到普遍關(guān)注。

RNAi 的脫靶效應(yīng)是核酸農(nóng)藥應(yīng)用中備受關(guān)注的問(wèn)題，這種效應(yīng)可能是由于dsRNA 序列和脫靶基因的mRNA 序列之間存在足夠的相似性引起的[46,141]。對(duì)于確保核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)未來(lái)順利進(jìn)入市場(chǎng)，解決可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)尤為重要。因此，在設(shè)計(jì)RNAi 靶序列時(shí)，應(yīng)該具有高度特異性，與脫靶轉(zhuǎn)錄本沒(méi)有同源性和序列相似性，以減少或避免脫靶效應(yīng)的發(fā)生。生物信息學(xué)工具和模型在設(shè)計(jì)RNAi 靶序列和預(yù)測(cè)潛在的脫靶效應(yīng)方面具有十分重要的作用。隨著眾多物種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的完善和各種生物信息學(xué)軟件模型的開(kāi)發(fā)，使得精確搜索、預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)特異性的dsRNA/siRNA 成為可能。例如，果蠅RNAi 篩選中心數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.flyrnai.org)、基因組RNAi數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.genomernai.org)、dsCheck 在線設(shè)計(jì)軟件 (http://dscheck.rnai.jp)、Offtarget-Finder 在線工具 (https://www.specifly.org)、以及算法模型siRNA-Finder (https://github.com/snowformatics/siFi21)、pssRNAit SVM (https://www.zhaolab.org/pssRNAit) 和PFRED (https://github.com/pfred)。對(duì)于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)的dsRNA/siRNA，仍需進(jìn)一步對(duì)選定的試驗(yàn)物種類(lèi)群進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，以驗(yàn)證脫靶效應(yīng)[142]。

納米載體因其“納米”特性可能會(huì)對(duì)環(huán)境安全和人類(lèi)健康帶來(lái)新的威脅。例如，碳納米管具有致癌性，也會(huì)引起生殖和發(fā)育毒理學(xué)效應(yīng)，同時(shí)在環(huán)境中難以降解[143]。肌凝蛋白作為真核生物的關(guān)鍵組成部分，殼聚糖納米載體負(fù)載dsGFP或單獨(dú)使用均可以顯著抑制秀麗隱桿線蟲(chóng)蟲(chóng)體肌凝蛋白的表達(dá)[94]。SPc 納米載體自身對(duì)非靶標(biāo)生物黑腹果蠅具有急性毒性，且對(duì)其初孵幼蟲(chóng)的壽命、生育能力、攀爬能力和抗逆性均產(chǎn)生了不利影響[122]。因此，需要對(duì)納米載體材料進(jìn)行嚴(yán)格的安全性評(píng)估，分析其潛在風(fēng)險(xiǎn)。

5 總結(jié)與展望

基于RNAi 技術(shù)的核酸農(nóng)藥在有害生物防治領(lǐng)域具有巨大的潛力，使用核酸農(nóng)藥控制病蟲(chóng)害將為有害生物綜合治理增加新的維度。核酸農(nóng)藥目前已經(jīng)有產(chǎn)業(yè)化的案例。相對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥，可噴灑核酸農(nóng)藥不需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物就可以提供針對(duì)有害生物的基因控制，因而更具吸引力，其商業(yè)化更易被接受。納米科技的發(fā)展為可噴灑核酸農(nóng)藥的發(fā)展提供了新的思路，各種具有特殊物化性質(zhì)和生物學(xué)功能的納米材料已成功應(yīng)用于核酸農(nóng)藥的遞送?；诩{米材料為載體的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)可以提高核酸農(nóng)藥在環(huán)境中的穩(wěn)定性和有效促進(jìn)其在目標(biāo)生物細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散、攝取和內(nèi)體逃逸，對(duì)于核酸農(nóng)藥的高效應(yīng)用和有害生物綠色防控具有重要意義。

然而，核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用仍受部分因素限制：

1) 靶標(biāo)基因。如何獲得高效、特異致死的靶標(biāo)基因dsRNA 序列是核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的首要因素[144]。理想的靶標(biāo)基因可以利用低劑量的dsRNA 引起高效的RNAi 效應(yīng)，靶基因的篩選和挖掘是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，需要更多的研發(fā)投入。

2) 生產(chǎn)成本。開(kāi)發(fā)一類(lèi)合成簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的納米載體以及研發(fā)一種可大量、低成本、高效合成dsRNA 的技術(shù)，是核酸農(nóng)藥走向田間大規(guī)模應(yīng)用的前提。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰研究團(tuán)隊(duì)和美國(guó)RNAGri 公司在這方面已有創(chuàng)新性技術(shù)[121,145-146]，未來(lái)仍需繼續(xù)開(kāi)發(fā)多元的技術(shù)手段，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的大規(guī)模生產(chǎn)。

3) 潛在環(huán)境、健康風(fēng)險(xiǎn)。目前基于納米材料遞送核酸農(nóng)藥的新型核酸遞送系統(tǒng)重點(diǎn)關(guān)注在納米遞送系統(tǒng)的制備、物理表征、生物活性等方面，缺乏關(guān)于潛在的脫靶效應(yīng)以及納米材料在環(huán)境中的命運(yùn)以及沿食物鏈的潛在生物積累等信息。因此，必須對(duì)未來(lái)的研究建立一個(gè)可靠檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停源_定在農(nóng)業(yè)中使用納米材料及核酸農(nóng)藥相關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來(lái)，隨著RNAi 醫(yī)藥研發(fā)的蓬勃發(fā)展和相關(guān)技術(shù)的不斷突破，基于RNAi 技術(shù)的核酸農(nóng)藥研發(fā)也進(jìn)入了快速發(fā)展的時(shí)期[6]。核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)在核酸農(nóng)藥遞送領(lǐng)域展現(xiàn)出很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，特別是能夠?qū)sRNA 提供高效保護(hù)以及大幅提升核酸農(nóng)藥的RNAi 效率，關(guān)注和推動(dòng)新型核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的研發(fā)將對(duì)我國(guó)綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。此外，未來(lái)多學(xué)科的研究者應(yīng)加強(qiáng)交流合作，闡明植物和納米材料之間相互作用的問(wèn)題，加強(qiáng)納米載體的生物安全性評(píng)估研究，優(yōu)化載體設(shè)計(jì)以減少潛在毒性，這對(duì)促進(jìn)核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的大規(guī)模應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。