鄭子英 ,丁 林 ,楊 晶 ,韓婉雪 ,劉 瑾 ,王新珍 ,王鳳花**

(1.河北師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院/河北省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省環(huán)境變化遙感識(shí)別技術(shù)創(chuàng)新中心/河北省地理科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 石家莊 050024;2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心/中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)水資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省土壤生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050022;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

抗生素在保障人類健康、預(yù)防和治療動(dòng)物傳染性疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面起到了重要作用[1]。長(zhǎng)期過(guò)量、不規(guī)范使用抗生素使環(huán)境中殘留的抗生素日益增多,對(duì)環(huán)境微生物造成選擇性壓力[2],加劇了抗生素抗性細(xì)菌(ARB)和抗生素抗性基因(ARGs)的污染程度。目前,ARGs 在環(huán)境中的傳播、擴(kuò)散已成為全球性的污染問(wèn)題[3]。土壤生態(tài)系統(tǒng)作為ARGs 的源與匯,因與人類健康密切相關(guān)而備受關(guān)注[4]。我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖大國(guó),獸用抗生素的使用量逐年遞增,2020 年獸用抗生素使用總量高達(dá)32 776.30 t[5],動(dòng)物體內(nèi)攝入的抗生素大部分會(huì)以抗生素原型或代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排出體外[1,6],使得畜禽糞便成為抗生素和ARGs 的重要儲(chǔ)蓄庫(kù)[7],而畜禽糞便的資源化利用又加劇了農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中ARGs 的污染程度。

畜禽糞便是農(nóng)田土壤ARGs 的主要來(lái)源。農(nóng)作物種植過(guò)程中會(huì)施用大量畜禽糞肥來(lái)提高土壤肥力,保障作物產(chǎn)量[8-9]。在集約化養(yǎng)殖過(guò)程中,由于畜禽種類(主要包括豬、羊、雞、牛)、抗生素使用種類及使用量的不同,導(dǎo)致畜禽糞便中ARGs 多樣性和豐度也存在顯著差異。四環(huán)素和磺胺作為廣譜抗生素在畜牧業(yè)中廣泛使用。Ji 等[10]在豬糞、家禽糞便和牛糞中檢測(cè)到高豐度的磺胺和四環(huán)素ARGs,其相對(duì)豐度分別為2.37×10-5～4.23×10-2copies·copies-1(16S rRNA)和 2.23×10-8～3.96×10-3copies·copies-1(16S rRNA)。McKinney 等[11]在長(zhǎng)期施用牛糞的土壤中檢測(cè)到較高豐度的sul1、tetW和tetX基因,豐度范圍為10-4～10-2copies·copies-1(16S rRNA)。Heuer 等[12]研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)施用含有抗生素的豬糞顯著增加了土壤中sul1和sul2基因豐度。此外,Cheng 等[13]發(fā)現(xiàn),施用不同類型畜禽糞肥均會(huì)提高土壤中ARGs 的污染水平,但施畜禽糞便土壤中ARGs 的多樣性和豐度具有顯著差異。畜禽糞便施用增加了土壤中ARGs 的豐度和種類,加劇了土壤中ARGs 的傳播風(fēng)險(xiǎn)。此外,ARGs 能夠通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)遺傳元件以水平基因轉(zhuǎn)移的方式在同一物種成員之間以及不同屬的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移[6]。其中,intI1基因(Ⅰ型整合子)與ARGs 關(guān)系密切,可以將不同的ARGs 以位點(diǎn)特異性重組的方式進(jìn)行重排,并通過(guò)接合型質(zhì)粒傳播[14],促進(jìn)ARGs 在土壤中的擴(kuò)散[15]。Mu 等[16]調(diào)查發(fā)現(xiàn)雞、豬和牛飼養(yǎng)場(chǎng)附近土壤中磺胺類ARGs 濃度最高,占ARGs 總豐度的71.1%～80.2%,而intI1基因在促進(jìn)磺胺類ARGs 的傳播擴(kuò)散中發(fā)揮了重要作用。此外,畜禽糞肥施用影響了土壤環(huán)境和生態(tài)過(guò)程,進(jìn)而影響了土壤細(xì)菌群落。土壤微生物作為ARGs 的宿主,其群落結(jié)構(gòu)的變化直接影響了ARGs 的分布。Li 等[17]研究發(fā)現(xiàn)施用化肥和雞糞土壤中ARGs 的變化與細(xì)菌群落之間存在密切聯(lián)系,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替性在ARGs 的傳播擴(kuò)散中起著不可替代的作用。

近年來(lái),隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的深入調(diào)整,蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大。我國(guó)蔬菜種植普遍采用糞肥作為底肥,由此引起的蔬菜地土壤ARGs 污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重[18-19]。此外,農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)是抗生素和ARGs暴露的重要環(huán)境,農(nóng)產(chǎn)品的食用,尤其是可生食的蔬菜,是土壤-植物系統(tǒng)中ARGs 進(jìn)入人體最直接的途徑之一,是環(huán)境ARGs 人群暴露的主要來(lái)源[20]。目前,蔬菜地施肥類型多樣,為進(jìn)一步探究施用不同畜禽糞肥對(duì)蔬菜地土壤中ARGs 傳播擴(kuò)散的影響,本研究采集了河北省保定市周邊縣區(qū)施用不同畜禽糞肥的蔬菜地表層土壤(0～20 cm),采用定量PCR 方法探究施用不同類型肥料蔬菜地土壤ARGs 的污染特征,采用高通量測(cè)序技術(shù)解析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成,結(jié)合土壤環(huán)境因子指標(biāo)探明影響蔬菜地土壤中ARGs 分布的主控因子,以期為評(píng)估蔬菜地土壤中ARGs 污染現(xiàn)狀提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究在河北省保定市清苑區(qū)、安新縣、定州市、淶水縣采集施用商品有機(jī)肥、鮮羊糞、鮮牛糞、鮮雞糞和化肥的蔬菜地土壤樣品。蔬菜地種植作物主要包括: 西紅柿(Solanum lycopersicumL.)、韭菜(Allium tuberosumRottler ex Sprengle)、生菜(Lactuca sativavar.ramosaHort.)、芹菜(Apium graveolensL.)和白菜(Brassica rapavar.glabraRegel)。采樣點(diǎn)信息見(jiàn)表1。2021 年4 月大棚蔬菜成熟期采用五點(diǎn)采樣法采集表層0～20 cm 土壤,每個(gè)采樣地采集3 個(gè)重復(fù),共采集21 個(gè)土壤樣品,土壤樣品置于冰上運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。將采集的土壤樣品過(guò)2 mm 篩除去植物根莖、砂礫、石塊等。一部分土壤樣品風(fēng)干后,用于土壤環(huán)境因子(pH、有機(jī)質(zhì)、總氮)的分析,其余部分置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存,用于土壤微生物組DNA的提取。

表1 采樣點(diǎn)信息Table 1 Details of soil sampling sites

1.2 土壤環(huán)境因子分析測(cè)定

土壤理化指標(biāo)測(cè)定主要參考《土壤農(nóng)化分析》[21]。采用酸度計(jì)電位法測(cè)定pH [土壤與水的比值為1∶2.5 (質(zhì)量∶體積)];采用烘干稱重法測(cè)定土壤含水率(SWC);采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化法,利用分光光度計(jì)(UV-6100S,Shanghai)測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)(SOM);采用凱氏定氮方法,利用FOSS-凱氏定氮儀(Kjeltec 8400,Denmark)測(cè)定土壤總氮(TN),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同施肥類型下土壤環(huán)境因子分析Table 2 Physical and chemical properties of soil under different fertilization treatments

1.3 DNA 提取和定量PCR

土壤微生物DNA 采用FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals,Santa Ana,CA,United States)按制造商說(shuō)明提取。使用超微量分光光度計(jì)(NanoDropTMOne,Thermo Fisher Scientific,United States)測(cè)定提取的DNA 濃度,DNA 樣品于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。采用SYBR Green 染料法定量2 個(gè)磺胺類ARGs (sul1、sul2)、8 個(gè)四環(huán)素類ARGs (tetA、tetC、tetG、tetL、tetO、tetM、tetW、tetQ)以及Ⅰ類整合酶基因(intI1)[20,22]。PCR 反應(yīng)體系為25 μL,包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Takara Biotech,Dalian,China),前后引物各0.5 μL (10 μmol·L-1),DNA 1 μL (20～30 ng·μL-1),ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增程序如下: 95 ℃ 3 min,95 ℃30 s,退火溫度30 s (sul1: 55.9 ℃;sul2: 60.8 ℃;tetA:55 ℃;tetC: 55 ℃;tetG: 55 ℃;tetL: 55 ℃;tetO: 45 ℃;tetM: 45 ℃;tetW: 60 ℃;tetQ: 55 ℃;intI1: 60 ℃),72 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸3 min,通過(guò)溶解度曲線分析(每次讀取0.5 ℃,10 s)確定擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。采用TaqMan 探針?lè)ǘ?6S rRNA 基因豐度[23]。使用定量PCR 儀CFX Connect? (Bio-Rad,United States)對(duì)所有樣品已檢出的ARGs、intI1基因和16S rRNA基因進(jìn)行定量分析。

1.4 細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測(cè)序

使用515F/806R 引物對(duì)16S rRNA 基因V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[24],探究不同施肥類型下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。利用Illumina Miseq 平臺(tái)(Illumina,San Diego,CA,United States)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。使用QIIME2 2019.7 版本(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[25]。利用DADA2 對(duì)序列進(jìn)行去噪、拼接和過(guò)濾后將序列以99%的相似度進(jìn)行聚類,最終生成特征序列。使用QIIME2 的classifysklearn 算法(基于Silva 數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)特征序列進(jìn)行注釋[26-27]。通過(guò)q2-diversity 插件計(jì)算α 和β 多樣性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)探討不同土壤樣品中pH、SOM、SWC、TN、細(xì)菌群落組成和ARGs 豐度是否存在顯著差異。采用Pearson 相關(guān)性分析探究土壤環(huán)境因子對(duì)ARGs 分布的影響,以及土壤中主要細(xì)菌門與ARGs 之間的相互關(guān)系。使用R 4.1.1 中的“vegan”包利用冗余分析(RDA)分析ARGs 與土壤環(huán)境因子之間的相關(guān)性;使用“pheatmap”包繪制ARGs 豐度熱圖。采用OriginPro 2018 軟件繪制箱線圖以揭示不同施肥處理下細(xì)菌α 多樣性的差異,采用非度量多維尺度(NMDS)(基于Bray-Curtis 距離)探究細(xì)菌β 多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中抗性基因和intI1 基因的分布特征

定量PCR 結(jié)果表明,在不同土壤樣品中磺胺類ARGs (sul1和sul2)、四環(huán)素類ARGs (tetA、tetC、tetG、tetL、tetO、tetM、tetW、tetQ)以及整合酶基因(intI1)豐度差異較大(圖1a)?；前奉怉RGssul1和sul2平均豐度分別為8.47×108copies?g-1(干土)和5.76×108copies?g-1(干土),四環(huán)素類ARGs 平均豐度范圍為4.58×105(tetM)～1.21×108(tetL) copies?g-1(干土),磺胺類ARGs 的總絕對(duì)豐度[9.96×109copies?g-1(干土)]高于四環(huán)素類ARGs [1.07×109copies?g-1(干土)]。intI1基因的絕對(duì)豐度范圍為2.11×105(OF)～5.48×107(CF2)copies?g-1(干土)。tetL[8.45×108copies?g-1(干土)]和tetW[1.31×108copies?g-1(干土)]絕對(duì)豐度較高,而tetA、tetC、tetG、tetO、tetM、tetQ絕對(duì)豐度相對(duì)較低,平均值范圍為4.58×105～7.81×106copies?g-1(干土)。對(duì)比不同施肥類型蔬菜地土壤中的ARGs,CF2 土壤中的ARGs 總絕對(duì)豐度最高[6.34×109copies?g-1(干土)],而CF1 [5.64×108copies?g-1(干土)]與施畜禽糞肥土壤中ARGs 平均豐度 [8.24×108copies?g-1(干土)]相比差異較小。對(duì)比不同糞肥處理土壤中ARGs 總絕對(duì)豐度,FM [1.23×109copies?g-1(干土)]>CM [1.06×109copies?g-1(干土)]>SM [4.67×108copies?g-1(干土)]>OF [3.09×108copies?g-1(干土)]。其中,FM 土壤中磺胺類ARGs 的絕對(duì)豐度[9.61×108copies?g-1(干土)]是OF [3.05×108copies?g-1(干土)]的3 倍。

圖1 不同施肥類型蔬菜地土壤中sul1、sul2、tetA、tetC、tetG、tetL、tetO、tetM、tetW、tetQ 和intI1 基因的絕對(duì)豐度(a)及土壤環(huán)境因子與抗性基因豐度間的冗余分析(b)Fig.1 Absolute abundances of sul1, sul2, tetA, tetC, tetG, tetL, tetO, tetM, tetW, tetQ and intI1 genes in soils under different fertilization treatments (a) and redundancy analysis of absolute abundance of antibiotic resistance genes and soil environmental factors (b)

2.2 抗性基因與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性分析

RDA 分析結(jié)果表明,土壤環(huán)境因子SOM、SWC、TN 和pH 顯著影響了土壤中ARGs 的分布,RDA1和RDA2 共解釋了總變量的79.20% (圖1b)。SOM和TN 分別與CM1 和CF2 中的ARGs 呈顯著正相關(guān)(P<0.01),與OF、SM 和CF1 中的ARGs 呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01) (圖1b)。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明(表3),SOM 和TN 分別與sul2、tetG、tetQ及tetW基因呈顯著正相關(guān)(P<0.05,P<0.01),pH 與ARGs 的相關(guān)性不顯著(P>0.05),intI1基因與TN、SOM 呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。intI1基因與sul2、tetG、tetQ、tetW基因呈顯著正相關(guān)(P<0.01),這表明intI1基因在ARGs 的傳播擴(kuò)散中起著重要的作用。編碼不同抗生素類型的ARGs 之間也存在一定的相關(guān)性,例如tetQ 和tetW基因均與sul1(P<0.05)、sul2(P<0.01)基因呈顯著正相關(guān)。

表3 抗性基因、intI1 基因和土壤環(huán)境因子的Pearson 相關(guān)性分析Table 3 Pearson’s correlation analysis among antibiotic resistance genes,intI1 gene and soil environmental factors

2.3 土壤中的細(xì)菌群落

2.3.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

本研究對(duì)21 個(gè)土壤樣品進(jìn)行了16S rRNA 基因測(cè)序分析,質(zhì)量篩選后共得到了2 341 622 條特征序列,平均每個(gè)土壤樣品111 505 條特征序列,共檢測(cè)到43 個(gè)細(xì)菌門,其中變形菌門(Proteobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、放線菌門(Actinobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetota)、厚壁菌門(Firmicutes)和芽單胞菌門(Gemmatimonadota)占土壤總細(xì)菌相對(duì)豐度的85.97%～94.82% (圖2a)。不同施肥類型蔬菜地土壤中細(xì)菌群落組成存在顯著差異。例如,變形菌門在CM1 和FM 處理中的相對(duì)豐度分別為34.75%和34.68%,而在CF1 和CF2 處理中的相對(duì)豐度分別為26.94%和24.03%。擬桿菌門的相對(duì)豐度在CF2 處理中高達(dá)43.49%,在CF1 處理為12.59%,在OF 處理僅占6.70%。不同施肥類型土壤中酸桿菌門與放線菌門相對(duì)豐度也較高,其在SM 處理比重最高,分別占細(xì)菌群落的20.89%和16.42%,CF2 處理相對(duì)豐度最低,僅分別占5.00%和7.80%。不同處理間綠彎菌門的相對(duì)豐度差異最小,豐度范圍為4.66%～7.00%,平均豐度為5.74%。此外,CF2 處理中除擬桿菌門外,其余細(xì)菌門類豐度都較有機(jī)肥處理組低,而CF1 處理中各細(xì)菌門豐度相較于有機(jī)肥處理組差異較小。

圖2 不同施肥類型蔬菜地土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(相對(duì)豐度>1%)的相對(duì)豐度(a)和基于Bray-Curtis 距離(NMDS)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(b)Fig.2 Relative abundance of bacterial dominance phyla (relative abundance >1%) in soils (a) and structural composition of the bacterial community based on Bray-Curtis distance (NMDS) (b) under different fertilization treatments

2.3.2 細(xì)菌群落多樣性

NMDS 結(jié)果表明(圖2b),不同有機(jī)肥施用處理間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異,與低化肥施加量處理(CF1)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似,而與高化肥施加量處理(CF2)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P<0.05)。不同的施肥類型影響土壤細(xì)菌群落多樣性(圖3)。例如,高化肥施加量(CF2)的Shannon 和Chao1 指數(shù)顯著低于各畜禽糞肥處理組;低化肥施加量(CF1)的Shannon 和Chao1 指數(shù)與有機(jī)肥施用處理無(wú)顯著差異。此外,不同有機(jī)肥施用處理間的Shannon 和Chao1 指數(shù)也無(wú)顯著差異。

圖3 不同施肥處理土壤細(xì)菌α 多樣性Fig.3 Soil bacterial α diversity under different fertilization treatments

2.3.3 土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子和抗性基因的關(guān)系

土壤細(xì)菌群落組成與土壤環(huán)境因子密切相關(guān)。土壤樣品中16S rRNA 基因的絕對(duì)豐度范圍為1.67×109～1.41×1010copies?g-1(干土)。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明(圖4a),16S rRNA 基因絕對(duì)豐度與Chao1、Shannon、SWC、SOM、pH 和TN 均不存在顯著相關(guān)性,而Chao1、Shannon 與SWC、SOM、TN呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05,P<0.01),與pH 呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。

圖4 土壤細(xì)菌α 多樣性與土壤環(huán)境因子Pearson 相關(guān)性(a)和主要細(xì)菌門與抗性基因的Pearson 相關(guān)性(b)Fig.4 Pearson’s correlation of soil bacterial α diversity and environmental factors (a) and Pearson’s correlation of major bacterial phyla with antibiotic resistance genes (b)

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明,細(xì)菌門水平豐度與ARGs 豐度存在顯著相關(guān)性(圖4b)。例如sul1和sul2基因豐度與擬桿菌門豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.01),與酸桿菌門、粘球菌門(Myxococcota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota)、芽單胞菌門豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01,P<0.05)。tetA、tetC、tetG、tetL、tetM基因豐度與放線菌門豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01,P<0.05),tetG、tetL、tetQ、tetW基因豐度與擬桿菌門豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.01,P<0.05),與粘球菌門豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01,P<0.05)。tetW基因豐度與疣微菌門、硝化螺旋菌門、甲基肌酐門(Methylomirabilota)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),tetO基因豐度與變形菌門豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。intI1基因與擬桿菌門豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),和酸桿菌門、甲基肌酐門豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

3 討論和結(jié)論

本研究在不同施肥類型蔬菜地土壤中都檢測(cè)到較高豐度的磺胺類ARGs (sul1、sul2)和四環(huán)素類ARGs (tetA、tetC、tetG、tetL、tetO、tetM、tetW、tetQ),表明農(nóng)田土壤中施用畜禽糞肥或化肥均會(huì)造成不同程度的ARGs 污染。在低化肥施加量(CF1)[5.64×108copies?g-1(干土)]和高化肥施加量(CF2)[6.34×109copies?g-1(干土)]處理中檢測(cè)到高豐度的ARGs。有研究發(fā)現(xiàn)施加化肥促進(jìn)了作物生長(zhǎng),提高了土壤有機(jī)碳和細(xì)菌群落豐度,同時(shí)可能會(huì)增加某些ARGs 的豐度[28]。此外,CF2 處理中ARGs 豐度顯著高于CF1 處理,CF2 處理的施肥量約是CF1 處理的4 倍,施肥量的較大差異也可能是造成ARGs 豐度差異的主要原因。

許多研究表明,動(dòng)物糞便是ARB 和ARGs 的重要儲(chǔ)存庫(kù)[29-32],施用糞肥可以顯著提高土壤中ARGs豐度[28,33]。研究發(fā)現(xiàn),在施加畜禽糞肥土壤中檢測(cè)到較高豐度的ARGs,總絕對(duì)豐度為3.09×108～1.23×109copies?g-1(干土)。不同畜禽糞肥土壤中的ARGs 豐度對(duì)比發(fā)現(xiàn),雞糞>牛糞>羊糞>商品有機(jī)肥,施加鮮雞糞土壤中的ARGs 豐度最高,這可能是由于雞的養(yǎng)殖密度大、銷售期短,養(yǎng)殖期抗生素的使用劑量較高。錢勛[34]在雞糞中檢出134 種ARGs,種類和總相對(duì)豐度均大于豬糞和牛糞。本研究通過(guò)對(duì)比已檢測(cè)到的ARGs 豐度發(fā)現(xiàn)施用不同類型肥料蔬菜地土壤中磺胺類ARGs 豐度高于四環(huán)素類ARGs,且施加雞糞、羊糞和牛糞土壤中磺胺類ARGs 相對(duì)豐度均顯著高于四環(huán)素類ARGs。Zhao 等[35]利用qPCR 技術(shù)分析了長(zhǎng)期施用雞糞的農(nóng)田土壤ARGs 的污染程度,結(jié)果表明土壤中磺胺類抗性基因(sul1和sul2)的相對(duì)豐度均高于四環(huán)素類。Mu 等[16]檢測(cè)牛場(chǎng)土壤中的ARGs 發(fā)現(xiàn),磺胺類ARGs 和部分喹諾酮類ARGs 的污染程度高于四環(huán)素類。有研究指出,sul1基因通常位于更容易傳播的第Ⅰ類整合子上,而sul2基因存在于小的非結(jié)合抗性質(zhì)粒和大的可傳播多抗性質(zhì)粒中[36],因此土壤中更容易殘留較高豐度的sul1和sul2基因。

土壤中ARGs 分布特征與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和土壤環(huán)境因子密切相關(guān)[37]。施肥引起土壤營(yíng)養(yǎng)條件和土壤環(huán)境條件的改變,直接或間接影響土壤微生物區(qū)系組成[38],不同施肥類型會(huì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn),施畜禽糞便蔬菜地土壤細(xì)菌α 多樣性顯著高于高化肥施加量的土壤。施用畜禽糞肥可以顯著提升土壤氮、磷和有機(jī)碳含量[39-40]以及微生物活性、多樣性和豐富度[41-42]。長(zhǎng)期過(guò)量施加化肥會(huì)引起土壤酸化、氮淋失、板結(jié)、有機(jī)質(zhì)減少等問(wèn)題[43],同時(shí)還會(huì)降低土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性[44-45]。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化是影響ARGs 分布的重要因素[46-47]。在本研究中,土壤中主要的細(xì)菌門類是變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門以及放線菌門,已有研究表明這些細(xì)菌門類是ARGs 的重要潛在宿主[48-49],與四環(huán)素類ARGs 顯著相關(guān)(P<0.05)。本研究還發(fā)現(xiàn)一些豐度較低的細(xì)菌門類,例如粘球菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門、甲基肌酐門,均與磺胺類和四環(huán)素類ARGs 呈顯著相關(guān)(P<0.05),說(shuō)明低豐度細(xì)菌門類的變化對(duì)ARGs 分布也有一定影響。此外,intI1基因在一定程度上也影響ARGs 的分布。研究發(fā)現(xiàn),intI1基因與sul2、tetG、tetQ和tetW基因呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。intI1基因常存在于各種可移動(dòng)遺傳元件和染色體上,與ARGs 在環(huán)境中的傳播、擴(kuò)散聯(lián)系十分緊密[20,50]。不同類型的ARGs 也存在一定的相關(guān)性,如編碼四環(huán)素類抗生素抗性的tetQ與編碼磺胺類抗生素抗性的sul1和sul2以及編碼四環(huán)素類抗生素抗性的tetG和tetW呈顯著正相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。Wang 等[51]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中一種抗生素的選擇性壓力可能會(huì)導(dǎo)致多種類型的ARGs 豐度增加。

綜上所述,施用畜禽糞肥增加了蔬菜地土壤中ARGs 豐度和多樣性,其中施用鮮雞糞蔬菜地土壤中ARGs 檢出豐度最高,施用商品有機(jī)肥蔬菜地土壤中ARGs 豐度低于施用鮮畜禽糞肥。相比施用畜禽糞肥,高化肥施用量顯著增加了蔬菜地土壤中ARGs 豐度。不同施肥類型蔬菜地土壤中檢出的磺胺類ARGs豐度均顯著高于四環(huán)素類ARGs。intI1基因在蔬菜地土壤ARGs 的傳播和擴(kuò)散中起著重要作用。此外,土壤環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均會(huì)影響土壤ARGs分布。本研究結(jié)果為評(píng)估施用不同類型畜禽糞肥蔬菜地土壤中ARGs 污染現(xiàn)狀提供了相應(yīng)的數(shù)據(jù)參考。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展蔬菜地土壤中畜禽糞肥來(lái)源ARGs在土壤-蔬菜系統(tǒng)中傳播擴(kuò)散途徑的研究,特別關(guān)注畜禽糞肥中ARGs 能否通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移到病原體宿主菌中,及其對(duì)人體健康造成的潛在危害。