羅麗娟，周勁松，2，馬恩耀，2，孫心恒，梁朝鵬，謝珊珊

（1.廣東漢潮中藥科技有限公司/廣東省傳統(tǒng)中藥創(chuàng)新中心，廣州 510000；2.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣州 510360）

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實。夏、秋二季果實呈紅色時采收，熱風(fēng)烘干，或晾至皮皺后，曬干，除去果梗。枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的作用，用于虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽萎遺精、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明［1-3］。枸杞是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，原產(chǎn)地為寧夏，2002 年被列入國家衛(wèi)生部藥食兩用物品名單。枸杞具有良好的保健功效，每年的消費群體和消費量較大［4］。枸杞的果期較長，規(guī)?；N植使得病蟲害的發(fā)生較為頻繁和嚴(yán)重，為了提高產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用不可避免。本研究以枸杞子為對象展開試驗，前處理方法為QuECh-ERS 法［5-10］，檢測方法選用GC-MS/MS 與UPLC-MS/MS，對枸杞子中33 種禁用農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（8890-7000D，美國Agilent 公司），超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290-6470，美國Agilent 公司），搖擺式高速粉碎機(jī)（DFY-400C，溫嶺市林大機(jī)械有限公司），電子天平（AP225WD，日本島津公司），全自動氮吹儀（Auto EVA 60，廣州市錦泉儀器科技有限公司），多管渦旋混合儀（EOAA-HM-01，廣州利輝生物科技有限公司），DB-17MS 氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）。

1.2 試劑

55 種禁用農(nóng)藥混合對照溶液（CDAA-M-490407-TY-1.2 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司），磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（CDAA-S-412134-JD-1 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司），提取鹽（Q221214，納譜分析技術(shù)有限公司），凈化管（Q221230，納譜分析技術(shù)有限公司），乙腈（2022081023，CNW），甲酸（GR，廣州化學(xué)試劑廠），甲酸銨（GR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），純化水。

1.3 樣品

20 批枸杞子樣品產(chǎn)地見表1。

表1 枸杞子樣品相關(guān)信息

1.4 方法

1.4.1 樣品快速處理方法（QuEChERS） 精密稱取樣品粉末（過三號篩）3 g 于50 mL 離心管中，加入1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）冰乙酸溶液15 mL，渦旋2 min直至均勻，浸泡30 min，再準(zhǔn)確加入15 mL 乙腈，以2 500 次/min 速率振蕩5 min，在冰浴中冷卻10 min，加入一包QuEChERS 凈化鹽包并立即搖勻，以2 500次/min 速率振蕩5 min，以4 500 r/min 速率離心5 min，緩慢倒取上清液15 mL 于QuEChERS 凈化鹽管中，搖勻，以2 500 次/min 速率振蕩5 min，以4 500 r/min 速率離心5 min，精密吸取上清液5 mL，于38 ℃氮吹濃縮至基本干燥的狀態(tài)，用乙腈溶液稀釋至1 mL，加入0.3 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，混合搖勻，通過0.22 μm 濾膜，取濾液進(jìn)行測定。

1.4.2 溶液的配制

1）混合對照品儲備溶液的制備。精密量取0.25 mL 55 種禁用農(nóng)藥混合對照溶液（20～200 mg/L，介質(zhì)為丙酮），置10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2）混合對照品工作溶液的制備。精密量取混合對照品儲備溶液2 mL，置10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

3）內(nèi)標(biāo)溶液的制備。精密量取磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加乙腈制成濃度為0.1 mg/L 的溶液。

4）空白基質(zhì)溶液的制備。取空白樣品枸杞子藥材，同“1.4.1”的制備方法制成空白基質(zhì)溶液。

5）基質(zhì)混合對照溶液的制備。分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0 mL（6 份），置氮吹儀上，40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL，分別加入混合對照品工作溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀釋至1 mL，渦旋混勻，即得。

1.4.3 分析條件

1）高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L 甲酸銨）為流動相A，0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L 甲酸銨）-乙腈溶液（體積比為5∶95）為流動相B；梯度洗脫，0～1 min 70%A；1～12 min 70%A→0%A；12～14 min，0%A；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧（ESI）；正離子掃描；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度250 ℃；干燥氣溫度350 ℃；霧化器壓力310 kPa；毛細(xì)管電壓4 000 V。

2）氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱Agilent DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣；升溫程序為初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 的速率升溫至160 ℃，再以2 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，最后以15 ℃/min 的速率升溫至300 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口模式為恒壓模式。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源（EI）；監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測；進(jìn)樣口溫度250 ℃；質(zhì)譜傳輸接口溫度250 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 線性和范圍 選取空白基質(zhì)枸杞子樣品，按基質(zhì)混合對照溶液制備得到含有6 個濃度點的基質(zhì)曲線，分別在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上進(jìn)行跑樣分析，觀察其線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2、表3。由表2、表3可以看出，各化合物在設(shè)計的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、范圍、檢測限和定量限

表3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、范圍、檢測限和定量限

2.1.2 定量限和檢測限 以信噪比為3（S/N=3）確定方法的檢測限（LOD），以信噪比為10（S/N=10）確定方法的定量限（LOQ），結(jié)果見表2、表3。從表2 和表3 可以看出，UPLC-MS/MS 方法的LOD在0.000 1～0.001 2 mg/kg，LOQ在0.000 1～0.004 0 mg/kg；GCMS/MS 方法的LOD在0.000 1～0.001 3 mg/kg，LOQ在0.000 1～0.004 3 mg/kg，定量限均小于《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中的定量限。

2.1.3 準(zhǔn)確度和重復(fù)性 選取空白基質(zhì)枸杞子樣品，在樣品制備過程中同時進(jìn)行低、中、高3 個不同濃度的樣品加標(biāo)，每個濃度的樣品加標(biāo)各做3 個平行，計算這3 組樣品的加標(biāo)回收率，分析其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。結(jié)果表明，GC-MS/MS 各農(nóng)藥化合物加標(biāo)回收率為65.0%～102.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.2%～11.4%。其中，滴滴涕、硫丹、殺螨醇具有較好的回收率。UPLC-MS/MS 各農(nóng)藥化合物加標(biāo)回收率為65.8%～112.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.1%～9.3%。其中，克百威、涕滅威、蠅毒磷具有較好的回收率，表明該方法回收率良好，準(zhǔn)確度高。

2.2 樣品測定

本研究選取了20 批次的枸杞子樣品，按上述QuEChERS 進(jìn)行前處理，用UPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測，33 種禁用農(nóng)藥中克百威有檢出，其余32 種禁用農(nóng)藥均未檢出?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版規(guī)定33 種禁用農(nóng)藥中克百威與3-羥基克百威之和以克百威表示，結(jié)果大于0.05 mg/kg的為不合格產(chǎn)品。由表4 可以看出，20 批次的枸杞子樣品中有14 批次的樣品檢出農(nóng)藥殘留，其中8 批次為農(nóng)藥殘留不合格樣品，占比40%，其中克百威最大含量為0.350 mg/kg。

表4 20 批枸杞子中檢出的農(nóng)藥殘留量

3 討論

2020 版《中華人民共和國藥典》對藥材和飲片中的33 種禁用農(nóng)藥殘留進(jìn)行了規(guī)定，本試驗亦借此契機(jī)建立對應(yīng)的檢測方法，靈敏度與準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。在隨機(jī)檢測中，發(fā)現(xiàn)部分批次枸杞子有不合格或陽性檢出的情況，表明枸杞子在種植過程中存在著農(nóng)藥超標(biāo)使用的問題以及環(huán)境污染嚴(yán)重等現(xiàn)象。應(yīng)當(dāng)建立一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測限低的方法，對枸杞子中的禁用農(nóng)藥殘留含量進(jìn)行監(jiān)測，為中藥材的質(zhì)量控制提供支持。