周漢紅，孫書斌，羅先學(xué)，肖金勝，甘 韜，方武軍

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430040；2.湖南省煙草專賣局張家界市公司，湖南 張家界 427000）

河南產(chǎn)區(qū)烤煙年生產(chǎn)量在10 萬t 以上，是全國重要的濃香型卷煙優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)，在卷煙品牌中發(fā)揮重要的配方作用，但河南各產(chǎn)區(qū)空間跨度大，土壤和氣候條件也存在較大區(qū)別，導(dǎo)致煙葉風(fēng)格在產(chǎn)區(qū)間存在一定的差異。學(xué)者對(duì)河南煙葉進(jìn)行了大量研究，但主要集中在施肥、烘烤等煙葉生產(chǎn)方面［1-5］以及物理特性、化學(xué)成分等質(zhì)量方面［6-13］，對(duì)各產(chǎn)區(qū)煙葉代謝物質(zhì)方面的研究比較少。

煙葉在成熟和烘烤過程中存在一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，其中代謝物的種類和含量對(duì)烤煙的感官質(zhì)量有重要的影響［14］。非靶向代謝組學(xué)旨在通過考慮數(shù)據(jù)集中存在的所有信息，在生物系統(tǒng)中收集盡可能多的代謝物的信息，廣泛應(yīng)用于植物代謝組學(xué)分析。其主要技術(shù)有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等［15-17］，其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）具有可靠的靈敏度、較高的精度和分析方法的魯棒性，是靈敏度和選擇性的最佳組合，因此在大多數(shù)代謝組學(xué)方法中必不可少。本研究運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）方法對(duì)河南省駐馬店市泌陽縣、南陽市社旗縣、信陽市羅山縣、洛陽市宜陽縣和三門峽市盧氏縣5 個(gè)產(chǎn)區(qū)的C3F 進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，探索不同產(chǎn)區(qū)煙葉的關(guān)鍵差異代謝產(chǎn)物差異，旨在更好地指導(dǎo)煙葉生產(chǎn)和工業(yè)調(diào)撥。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)對(duì)象為河南省駐馬店市泌陽縣、南陽市社旗縣、信陽市羅山縣、洛陽市宜陽縣、三門峽市盧氏縣5 個(gè)產(chǎn)區(qū)2021 年的C3F 樣品（表1），把剛調(diào)制完下炕的煙葉樣品立即放入液氮中冷凍，樣品郵寄到北京諾禾致源科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣本詳情

1.2 試驗(yàn)儀器

本試驗(yàn)委托北京諾禾致源科技股份有限公司檢測(cè)。Q Exactive?HF-X 質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC 色譜儀，德國賽默飛世爾科技公司；Hypesil GOLD Column 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），美國賽默飛世爾科技公司；D3024R 型低溫離心機(jī)，美國Scilogex品牌。甲醇、甲酸、醋酸銨均購于美國賽默飛世爾科技公司，超純水購于德國Merck 公司，以上試劑純度均為色譜級(jí)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本項(xiàng)目基于液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，試驗(yàn)設(shè)計(jì)主要包括樣本的代謝物提取、LC-MS/MS 檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析等。由于同一種代謝物可能帶正電荷或者負(fù)電荷，所以分別對(duì)帶正電荷和負(fù)電荷的代謝物進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

首先將質(zhì)譜檢測(cè)得到的原始文件（.raw）導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1（CD）軟件進(jìn)行譜圖處理及數(shù)據(jù)庫搜庫，得到代謝物的定性定量結(jié)果，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確度、可靠性。再對(duì)代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）等，揭示不同組別代謝物的差異。利用層次聚類（HCA）和代謝物相關(guān)性分析，揭示樣本之間及代謝物之間的關(guān)系。最后，通過代謝通路等功能分析解釋代謝物相關(guān)的生物學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各區(qū)域C3F 等級(jí)煙葉代謝組的多元統(tǒng)計(jì)分析

為了探究C3F 代謝物在泌陽縣、社旗縣、羅山縣、宜陽縣和盧氏縣的區(qū)域特征，對(duì)烘烤后的煙葉進(jìn)行代謝組測(cè)序和分析。正離子代謝物和負(fù)離子代謝物的主成分分析結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，5 個(gè)地區(qū)間的煙葉代謝物特征差異明顯，但各地區(qū)內(nèi)部樣本差異較小，且分離趨勢(shì)均處在95%置信區(qū)間內(nèi)。比較5 個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)，泌陽縣和社旗縣的煙葉代謝物主成分比較相近，宜陽縣和盧氏縣的煙葉代謝物主成分比較相近，而羅山縣與其他地區(qū)的煙葉代謝物主成分相對(duì)差異較大。

圖1 帶正電荷代謝物（a）與帶負(fù)電荷代謝物（b）主成分分析結(jié)果

2.2 主要代謝物及各區(qū)域特異代謝物表達(dá)分析

基于所有代謝物的表達(dá)豐度數(shù)據(jù)，利用單因素方差分析對(duì)樣本組間進(jìn)行差異比較，按照標(biāo)準(zhǔn)差（s）進(jìn)行排序，以P＜0.05 為閾值，對(duì)代謝物進(jìn)行差異表達(dá)的篩選，得到各區(qū)域差異表達(dá)代謝物數(shù)量（表2），泌陽縣、社旗縣、羅山縣、宜陽縣和盧氏縣的差異代謝物分別為477、411、319、186 和227 種，其中差異代謝物為正離子代謝物和負(fù)離子代謝物總和。圖2 為差異表達(dá)代謝物可視化熱圖，由圖2 可以看出，泌陽縣和社旗縣的差異代謝物的豐度比較相似，宜陽縣和盧氏縣代謝物比較相似（黑框標(biāo)識(shí)）。基于差異代謝物豐度，通過皮爾森相關(guān)性分析（表3）發(fā)現(xiàn)，泌陽縣和社旗縣、宜陽縣和盧氏縣煙葉代謝物相關(guān)性較高（P＜0.05）。

圖2 差異表達(dá)代謝物豐度可視化結(jié)果

表2 各區(qū)域差異表達(dá)代謝物數(shù)量（單位：種）

表3 各區(qū)域煙葉代謝物皮爾森相關(guān)性分析

基于以上差異分析的結(jié)果，得到前20 種差異表達(dá)正離子代謝物（表4）和前20 種差異表達(dá)負(fù)離子代謝物（表5）。其中前20 種差異表達(dá)正離子代謝物包括14 種酸，分別為DL-色氨酸、葡萄糖酸、檸檬酸、L-蘇糖酸、琥珀酸、水楊酸、富馬酸、D-α-羥基戊二酸、2R-2，3-二羥基丙酸、DL-4-羥基苯乳酸、檸康酸、2-羥基己酸、N-乙?；?D-別異亮氨酸和N-乙酰-DL-丙氨酸；1 種亞胺；1 種酚；1 種醇；1 種酰胺和2 種內(nèi)酯。前20 種差異表達(dá)負(fù)離子代謝物包括7 種酸類，3 種堿，2 種酮等物質(zhì)。

表4 前20 種差異表達(dá)正離子代謝物

表5 前20 種差異表達(dá)負(fù)離子代謝物

圖3 為葡萄糖酸、L-蘇糖酸、富馬酸、D-甘露醇、D-谷氨酰胺、N-乙?；?D-別異亮氨酸的豐度柱狀圖。通過L-蘇糖酸和富馬酸的豐度圖可以看出，其在泌陽縣和社旗縣的豐度比較相近。結(jié)果支持本文前述猜想。

圖3 6 種差異代謝物豐度

2.3 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫的代謝通路分析

為確定5 個(gè)區(qū)域C3F 等級(jí)煙葉差異代謝物的主要生物學(xué)功能，對(duì)這些差異代謝物進(jìn)行了KEGG 通路富集分析（以P≤0.05 為閾值），如圖4 所示。結(jié)果表明，差異代謝物主要富集在氨基酸代謝相關(guān)通路中。圖5 以三門峽市盧氏縣C3F 等級(jí)煙葉為例，色胺酸代謝通路表達(dá)差異最顯著，該條代謝通路富集到的差異代謝物為吲哚和吲哚酚，主要集中在吲哚和吲哚酚生物合成上（圖6）。

圖4 KEGG 通路富集分析

圖5 三門峽市盧氏縣C3F 等級(jí)煙葉KEGG 富集氣泡

圖6 富集差異代謝物代謝路徑

3 結(jié)論

1）泌陽縣和社旗縣煙葉代謝物相關(guān)性比較高，宜陽縣和盧氏縣相關(guān)性比較高，羅山縣與其他區(qū)域代謝物均相差較大?？梢姷乩砦恢孟嘟?，氣候相近，代謝物相關(guān)性高；地理位置遠(yuǎn)，氣候相差較大，代謝物相關(guān)性低。

2）KEGG 富集結(jié)果顯示，差異代謝物主要富集在氨基酸代謝相關(guān)通路中。以三門峽市盧氏縣C3F等級(jí)煙葉為例，以色氨酸為底物合成吲哚和吲哚酚生物合成途徑是三門峽市盧氏縣C3F 等級(jí)煙葉差異最顯著的代謝途徑。