周海速，王佩玉，余蓉，黃學(xué)鋒，費(fèi)前進(jìn)，鄭九嘉*

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.生殖醫(yī)學(xué)中心;2.護(hù)理部,溫州 325000)

乙型肝炎病毒(HBV)的感染呈全球性分布,我國(guó)的感染基數(shù)非常龐大,而其中很大一部分感染者表現(xiàn)為隱匿性感染[1]。HBV主要通過(guò)血液和體液途徑傳播,人體感染HBV后除肝臟外,在唾液、陰道分泌物、精液等體液中都可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒[2-3],同時(shí)它還可以通過(guò)血睪屏障進(jìn)入睪丸組織和精液中,可能造成對(duì)精子質(zhì)量的影響,降低男性生育能力[4-5]。以往的研究發(fā)現(xiàn),HBV的感染對(duì)精子的參數(shù)指標(biāo)和精子功能都具有一定影響[6-9]。本研究通過(guò)檢測(cè)生殖中心就診的男性血清HBV-DNA、HBeAg及HBsAg水平和精漿中HBV-DNA拷貝數(shù)及精子質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo),探討血清或精漿中HBV不同的存在方式對(duì)男性精子質(zhì)量及生育力的影響,以期為男性不育并HBV感染的臨床診治及乙肝的抗病毒治療提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016年1月至2021年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的男性患者臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡25～45周歲;(2)血清學(xué)標(biāo)志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和血清HBV-DNA檢查結(jié)果齊全;(3)女性配偶血清HBV標(biāo)志物陰性。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有睪丸、染色體、激素水平異常者;(2)合并細(xì)菌、支原體、衣原體感染等;(3)器質(zhì)性及功能性不育患者(如睪丸腫瘤,重度性功能障礙等器質(zhì)性疾病)。

本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(倫理審批號(hào):臨床研究倫理Issuing Number(2023)第(092)號(hào)),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.分組:根據(jù)納排標(biāo)準(zhǔn)共納入2 063例患者,首先按血清HBsAg是否陽(yáng)性分為兩大類:HBsAg陰性者和HBsAg陽(yáng)性者;HBsAg陽(yáng)性者再按血清HBsAg/HBeAg、HBV-DNA拷貝數(shù)和精漿HBV-DNA拷貝數(shù)等感染方式分組。A組:HBV未感染男性(HBsAg陰性),共1 122例;B組:僅為血清HBsAg陽(yáng)性(血清HBeAg、HBV-DNA和精漿HBV-DNA拷貝數(shù)均陰性)感染者,共460例;C組:血清HBsAg、HBeAg和血清HBV-DNA拷貝均陽(yáng)性,而精漿HBV-DNA拷貝陰性,共81例;D組:血清HBsAg、HBeAg和血清、精漿的HBV-DNA拷貝均陽(yáng)性,共112例。血清HBsAg、HBeAg陽(yáng)性而血清、精漿HBV-DNA拷貝均陰性的患者未統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。最終納入1 775例患者進(jìn)行分析。

2.精液采集及常規(guī)檢測(cè):受試者禁欲3～7 d,手淫法收集精液標(biāo)本。收集到的所有標(biāo)本在37℃水浴待完全液化后按《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第5版)》行精液常規(guī)檢查,采用計(jì)算機(jī)輔助精子自動(dòng)分析系統(tǒng)(SCA2002型,MLCRORTICS.L公司,西班牙)檢測(cè)精子活動(dòng)力和運(yùn)動(dòng)軌跡。

3.血清學(xué)檢測(cè):采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)檢測(cè)血清乙型肝炎標(biāo)志物,包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb,試劑盒、質(zhì)控品和定標(biāo)液均購(gòu)自美國(guó)雅培公司,按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行檢測(cè)。

4.血清和精漿病毒DNA拷貝水平檢測(cè):完全液化后的精液標(biāo)本于3 000g離心15 min留取上清于-80℃冰箱保存,采用熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(FQ-PCR)檢測(cè)血清和精漿病毒DNA拷貝水平,檢測(cè)試劑購(gòu)自深圳市匹基生物工程有限公司,操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行,精漿HBV-DNA水平>5.0×102U/ml為陽(yáng)性。

5.精子形態(tài)學(xué)分析:精子形態(tài)學(xué)分析根據(jù)WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)改良巴氏染色法進(jìn)行。

6.精子染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)檢測(cè)精子DNA完整性:采用精子Halosperm試劑盒(安徽安科生物工程)說(shuō)明書(shū)介紹的方法行SCD檢測(cè),并計(jì)算精子DNA碎片指數(shù)(DFI),DFI=(小暈輪精子+無(wú)暈輪精子)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的基本情況

本研究共納入2 063例患者,其中HBsAg陰性者1 122例,HBsAg陽(yáng)性者941例,符合本研究排要求的所有研究對(duì)象中HBsAg陽(yáng)性比例達(dá)45.6%。通過(guò)FQ-PCR檢測(cè)血清HBeAg和HBV-DNA拷貝均陽(yáng)性的193例感染者后發(fā)現(xiàn)精漿HBV-DNA拷貝數(shù)陽(yáng)性者112例,占HBV感染者的11.9%(112/941)。與未感染者(A組)相比,HBV感染者(B、C、D組)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平均顯著升高(P<0.05),且B、C、D組間的ALT和AST水平也有顯著差異(P<0.05);精漿HBV-DNA拷貝陽(yáng)性感染者(D組)的不育年限顯著高于未感染者(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者的基本情況比較(-±s)

二、血清和精漿中HBV的存在情況對(duì)精液常規(guī)參數(shù)的影響

分析各組間的精液參數(shù)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),與未感染者(A組)相比,B、C、D組患者的精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例均顯著下降(P<0.05),不活動(dòng)精子比例顯著增加(P<0.05);進(jìn)一步的組間分析顯示,D組的精子濃度、PR均顯著低于B組和C組(P<0.05),IM則顯著高于B組和C組(P<0.05);A組的精子濃度和PR為4組中最高(P<0.05),D組患者的精液液化時(shí)間最長(zhǎng),顯著高于其余3組(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者精液常規(guī)參數(shù)比較(-±s)

三、血清和精漿中HBV的存在情況對(duì)精子形態(tài)及DNA損傷的影響

統(tǒng)計(jì)分析各組間的精子形態(tài)學(xué)差異,結(jié)果顯示,B、C、D組的正常精子形態(tài)比例均顯著低于A組(P<0.05),但B、C、D三組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。進(jìn)一步比較各組精子的頭部、頸部、尾部缺陷率等指標(biāo),HBV感染者中B和C組的頭部缺陷精子、B組的頸中段和尾部缺陷的精子占比均顯著高于未感染者(A組)(P<0.05);D組感染者的頸中段缺陷精子占比顯著高于B組和C組,D組感染者的尾部缺陷精子占比顯著高于C組。各組間的精子畸形指數(shù)和異常指數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者的精子形態(tài)學(xué)參數(shù)比較(-±s)

我們?nèi)粘ＥR床上經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為精子DNA碎片指數(shù)(DFI)25.0%是精子DNA損傷的臨界值,分析各組間的DFI結(jié)果顯示:與A組相比,B、C、D組的精子DFI顯著增加(P<0.05),尤其是D組的DFI最高,亦顯著高于B、C兩組(P<0.05),且數(shù)值上超過(guò)了臨界值(表3)。

討 論

影響男性生育力的眾多因素中微生物感染是重要原因之一,而HBV感染已被發(fā)現(xiàn)與男性精子質(zhì)量之間有著密切的相關(guān)性,因?yàn)樵诟腥綡BV后,感染者的陰道分泌物、精液等較多的肝外組織或細(xì)胞中都可發(fā)現(xiàn)病毒的存在[10-13];同時(shí)也發(fā)現(xiàn),部分HBV感染后病毒DNA可整合到男性生殖細(xì)胞的染色體上并垂直傳給后代,影響男性生育力[14]。已有學(xué)者報(bào)道,HBV感染的男性有多項(xiàng)精液參數(shù)指標(biāo)均比未感染者顯著性降低。我們前期的研究[6-8]也已發(fā)現(xiàn),血清HBsAg及HBV-DNA呈陽(yáng)性的男性,其精子濃度、精子活力、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和精子DFI及頂體酶活性等均顯著低于未感染者。但是,目前關(guān)于HBV感染對(duì)男性生育力的影響研究,都僅僅停留在比較簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)分析,比如僅對(duì)血清HBsAg陽(yáng)性或陰性分組,或比較簡(jiǎn)單的按“大三陽(yáng)”“小三陽(yáng)”等感染模式分組,很少有進(jìn)一步細(xì)化并探究病毒在男性不同體液(血液及精液)中的存在對(duì)男性精子質(zhì)量造成的影響,也缺乏對(duì)血清和精漿HBV-DNA拷貝數(shù)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的分組研究。本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上通過(guò)HBV不同的感染模式進(jìn)一步按血清HBsAg/HBeAg、HBV-DNA是否陽(yáng)性分組,同時(shí)檢測(cè)病毒處于活躍復(fù)制期感染者的精漿中HBV-DNA拷貝水平,深入探討血清或精漿中HBV的存在情況及對(duì)男性精子質(zhì)量的影響。

本研究從2016年1月至2021年12月,歷經(jīng)6年時(shí)間共收集在本中心就診的2 063例男性精液標(biāo)本,其中HBV感染者941例;再根據(jù)其血清乙肝標(biāo)志物和HBV-DNA拷貝數(shù)進(jìn)行分組,其中460例HBV感染者僅表現(xiàn)為單純血清HBsAg陽(yáng)性(B組),另有193例為血清HBsAg、HBeAg和血清HBV-DNA拷貝同時(shí)陽(yáng)性(C組)、病毒處于復(fù)制期的患者,對(duì)其精漿病毒DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),112例患者精漿HBV-DNA水平>5.0×102U/ml,表現(xiàn)為血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA拷貝均陽(yáng)性且精漿HBV-DNA拷貝也為陽(yáng)性(D組)。組間分析顯示,HBV感染者的精子濃度、PR及正常形態(tài)精子百分?jǐn)?shù)均顯著低于未感染者,IM和精子DFI均顯著高于未感染者。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在HBV感染者的精漿中檢測(cè)出病毒DNA拷貝呈陽(yáng)性時(shí),即血清和精漿同時(shí)存在病毒復(fù)制的HBV感染者,其精子各參數(shù)指標(biāo)受到的負(fù)面影響最明顯,表現(xiàn)為精子濃度、PR均顯著低于精漿HBV-DNA拷貝陰性的感染者。男性精子濃度、活動(dòng)力和形態(tài)受到很多因素的影響,如局部環(huán)境的溫度、某些藥物、精子的核基因或線粒體基因異常、染色體蛋白組型異常等[15-18];此外,男性長(zhǎng)期慢性HBV感染也是造成精子濃度和活力降低的因素之一[4,6,9]。雖然,目前的研究表明HBV慢性感染的男性精子質(zhì)量低于未感染者,但病毒感染后是通過(guò)何種途徑或機(jī)制影響精子濃度和活力尚未完全闡明,部分學(xué)者的觀點(diǎn)是病毒在體液(包括血液和精液)中復(fù)制時(shí)病毒顆粒吸附在精子表面,從而影響其運(yùn)動(dòng)。Zhou等[19]研究發(fā)現(xiàn),HBV表面S蛋白可定向作用于精子頭部唾液酸糖蛋白受體,調(diào)動(dòng)局部的免疫反應(yīng)或造成局部環(huán)境的炎性反應(yīng),產(chǎn)生過(guò)量的活性氧類物質(zhì),損傷精子線粒體膜電位,進(jìn)而影響到氧化磷酸化能量的供應(yīng),使精子能量不足,從而降低了精子的活力,最終影響到精子獲能和受精等能力。

HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,此類病毒在自我復(fù)制時(shí)很容易整合到宿主的染色體中。已有研究證實(shí)[20],能夠穿過(guò)血睪屏障進(jìn)入睪丸的HBV-DNA在睪丸組織中復(fù)制時(shí),病毒的DNA有很高的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)整合到精子的染色體中,這種整合一旦發(fā)生就會(huì)誘導(dǎo)精子的染色體發(fā)生變異,導(dǎo)致精子遺傳物質(zhì)出現(xiàn)異常,所以HBV感染者尤其是精漿中HBV-DNA高拷貝的感染者其精子染色體畸變率要顯著高于未感染者。以往研究發(fā)現(xiàn),HBV感染男性的精子DFI顯著升高,甚至其DFI水平可達(dá)到正常男性2倍或以上[9,21]。本文研究結(jié)果顯示,HBV感染者的DFI顯著高于未感染者,與以往研究結(jié)果一致。同時(shí)我們進(jìn)一步的研究分析發(fā)現(xiàn),血清或精漿中病毒DNA的存在對(duì)精子DNA完整性有不同的影響,在HBV感染者中,當(dāng)精漿HBV-DNA陽(yáng)性時(shí)其DFI高達(dá)(26.2±15.7)%,顯著高于精漿HBV-DNA陰性的HBV感染者[(17.8±10.8)%、(16.2±7.6)%],且超過(guò)了臨床上都普遍認(rèn)為的25.0%的臨界值。通過(guò)本研究并結(jié)合其他學(xué)者的結(jié)論,我們推測(cè):HBV感染后尤其當(dāng)病毒進(jìn)入到睪丸組織在精液中復(fù)制時(shí),可能會(huì)增加精子染色體的畸變頻率,進(jìn)而影響精子遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性,如造成精子DNA損傷加劇;其次,當(dāng)病毒進(jìn)入睪丸存在于精漿中時(shí),更容易誘發(fā)一些免疫應(yīng)答或炎性反應(yīng),引起睪丸局部微環(huán)境的改變并產(chǎn)生大量的有害物質(zhì),如活性氧等。這些病毒感染所帶來(lái)的微環(huán)境的變化可能會(huì)對(duì)精子的形成或成熟造成一定程度的影響,當(dāng)這些負(fù)面影響達(dá)到或超過(guò)一定的閾值時(shí),最終影響精子的質(zhì)量和功能[22]。

我國(guó)是“乙肝”大國(guó),HBV感染基數(shù)龐大,且有眾多的感染者正處于婚育年齡,而關(guān)于HBV感染與男性精子質(zhì)量的研究相對(duì)較少,因HBV感染影響精子遺傳物質(zhì)(如精子DNA損傷等)的穩(wěn)定性從而導(dǎo)致男性不育研究在國(guó)內(nèi)外更鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),男性感染HBV后精子的各參數(shù)指標(biāo)變化顯著,尤其當(dāng)精漿中存在病毒DNA復(fù)制時(shí)精子各指標(biāo)均顯著低于精漿病毒DNA陰性的HBV感染者和未感染者,提示當(dāng)男性血清或精漿中的乙肝病毒呈陽(yáng)性狀態(tài)時(shí)對(duì)男性精子質(zhì)量會(huì)造成一定的影響,尤其當(dāng)HBV感染男性血清和精漿中HBV-DNA拷貝同時(shí)陽(yáng)性狀態(tài)時(shí)可能會(huì)對(duì)精子各參數(shù)指標(biāo)造成進(jìn)一步的負(fù)面影響。而HBV感染對(duì)精子的這些負(fù)面影響是如何造成的,其影響機(jī)理是否與氧自由基、活性氧類物質(zhì)有關(guān),我們將在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上,后續(xù)通過(guò)體外試驗(yàn)作進(jìn)一步的研究,以便揭示HBV感染引起男性生育力下降的相關(guān)機(jī)制,為HBV感染的男性不育的診治提供臨床基礎(chǔ)。