董潔瓊, 肖 琎, 周 鑫, 李 寧,2, 王雪松*, 康俊杰*

(1. 唐山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心, 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心, 河北 唐山 063000; 2. 遵化市畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心, 河北 唐山 063000)

β-受體激動劑類藥物,俗稱“瘦肉精”,在臨床醫(yī)學(xué)中是一類用于治療哮喘類疾病的藥物,當(dāng)把治療劑量的5～10倍藥量用在動物飼養(yǎng)環(huán)節(jié)中,就會產(chǎn)生營養(yǎng)再分配效應(yīng),能促進動物體內(nèi)脂肪的分解代謝,加快蛋白質(zhì)的合成速率,顯著提高胴體的瘦肉率。當(dāng)有“瘦肉精”殘留的肉類食品被消費者食用后可能會引起心悸、頭暈、肌肉震顫等中毒癥狀,對心血管和肝臟腎臟等造成一定的損傷[1-3]。故我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已禁止β-受體激動劑類藥物在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的使用。食品安全監(jiān)管機構(gòu)和有關(guān)企業(yè)也將這類藥物作為日常檢測項目進行重點監(jiān)督。

目前,檢測β-受體激動劑類藥物的方法主要包括:膠體金免疫層析法[4]、酶聯(lián)免疫分析法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6]和液相色譜-質(zhì)譜法[7-10]等。膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫分析法檢測成本低,耗時短,適用于大批量樣品的快速篩查,但是檢測結(jié)果假陽性率高,不適用于確證檢測。氣相色譜-質(zhì)譜法需要對樣品先進行衍生化處理,過程繁瑣。而液相色譜-質(zhì)譜法準(zhǔn)確性好、靈敏度高,不需要衍生化處理,還可以同時檢測樣品中多種類藥物,在當(dāng)前的獸藥殘留檢測工作中應(yīng)用最為廣泛,我國現(xiàn)行有效的β-受體激動劑類藥物的檢測標(biāo)準(zhǔn)也以液相色譜-質(zhì)譜法居多。

在前處理過程中,動物源性食品中的蛋白質(zhì)和脂肪會隨著目標(biāo)化合物一起被提取出來,這些物質(zhì)對目標(biāo)化合物的檢測會產(chǎn)生干擾,也會對儀器造成污染。在獸藥殘留檢測中,通常采用固相萃取柱對提取液進行凈化處理。整個使用過程包括活化、平衡、上樣、淋洗、洗脫等,且各步驟所用溶液需要根據(jù)檢測參數(shù)的不同進行相應(yīng)優(yōu)化。如王守英等[11]在測定動物尿液中23種β-受體激動劑時,選用了傳統(tǒng)固相萃取柱對樣品進行凈化,整個優(yōu)化過程要考慮多種情況,步驟較為繁瑣。目前,在我國現(xiàn)行有效的β-受體激動劑的檢測標(biāo)準(zhǔn)[12,13]中,無論是針對動物性食品、動物尿液還是飼料,多使用傳統(tǒng)固相萃取柱,樣品凈化過程復(fù)雜且需要配制多種相關(guān)溶液,耗時較長,不適于大批量樣品的同時檢測。

本實驗采用無需活化、直接上樣的一步式凈化固相萃取柱。相比于文獻和國標(biāo)法中使用的傳統(tǒng)固相萃取柱,該柱在優(yōu)化處理過程時需要考慮的處理條件較少,無需多次提取、濃縮,前處理過程更加簡單快捷,且其對樣品中的脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的凈化效果與傳統(tǒng)固相萃取柱相當(dāng),也同樣具有很好的重復(fù)性和靈敏度;同時還能夠減少化學(xué)試劑的用量,安全環(huán)保,更加適用于批量樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB Sciex Triple Quad 5500+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、X500R超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); KNORTH?CAFS Clean-up LPAS食品中獸藥多功能凈化柱(北京科德諾思技術(shù)有限公司); TGL-20M臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司); ANPEL-DC24氮氣吹干儀(上海安譜實驗科技股份有限公司); 24位固相萃取裝置(美國SUPELCO公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、氯丙那林、特布他林、妥布特羅、溴布特羅、班布特羅、齊帕特羅、馬布特羅、非諾特羅、福莫特羅、西馬特羅、西布特羅(100 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司)。

內(nèi)標(biāo)物質(zhì):克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、氯丙那林-D7、西馬特羅-D7、特布他林-D9(100 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司)。

乙酸銨、氫氧化鈉、氯化鈉(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(美國Sigma公司);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國Merck公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)分別稀釋成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液,避光保存于-20 ℃冰箱。

分別取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液混勻,用10%甲醇水稀釋成100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g(精確至0.01 g)均質(zhì)試樣,置于50 mL塑料離心管中,加入0.2 mol/L乙酸銨溶液(pH 5.2)8.0 mL,再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL和100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液40 μL,渦旋混勻后,于(36±2) ℃水浴16 h。

樣品酶解后放置至室溫,加入10 mL 0.5%甲酸乙腈,振蕩提取10 min,加入3.0～3.5 g NaCl粉末,渦旋混勻,8 000 r/min離心5 min,吸取5 mL上層清液過固相萃取柱,洗脫液在50 ℃條件下氮吹至近干,殘留物用0.4 mL 0.2%甲酸水溶液復(fù)溶,超聲10 min,渦旋混勻后過0.22 μm的微孔濾膜,供UHPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex F5色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫40 ℃;流動相A: 0.1%甲酸水溶液,流動相B:乙腈;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B～10%B; 1.0～7.0 min, 10%B～70%B; 7.0～8.0 min, 70%B～100%B; 8.0～9.0 min, 100%B; 9.0～9.1 min, 100%B～5%B; 9.1～10.0 min, 5%B。流速:0.25 mL/min,進樣量:2 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子掃描方式(ESI+),MRM模式;高純氮氣,氣簾氣壓力(CUR): 241.3 kPa(35 psi);噴霧氣壓力(GS1): 344.7 kPa(50 psi);輔助加熱氣壓力(GS2): 344.7 kPa(50 psi);離子源溫度:550 ℃;離子化電壓:+5 500 V。14種β-受體激動劑的保留時間、定量與定性離子對、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

實驗對比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Phenomenex Kinetex F5(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)色譜柱對這14種β-受體激動劑的分離性能。發(fā)現(xiàn)BEH C18色譜柱對沙丁胺醇的保留能力較弱,保留時間較短且峰形展寬拖尾,通過改變流動相的種類和梯度也無法改善。對比HSS T3色譜柱和F5色譜柱,14種β-受體激動劑在兩種色譜柱上均能較好分離,保留時間適宜且峰形尖銳對稱。通過各目標(biāo)物響應(yīng)對比后發(fā)現(xiàn),非諾特羅和齊帕特羅在F5色譜柱上的響應(yīng)值比HSS T3色譜柱上高約30%,其他目標(biāo)物在兩種色譜柱上響應(yīng)相近。故最終選擇Phenomenex Kinetex F5色譜柱。

以乙腈為有機相,對比了0.1%甲酸水溶液和含5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液作為水相的區(qū)別。結(jié)果表明:在兩種流動相條件下,各化合物均峰形良好,各目標(biāo)物峰面積也相近。但考慮到鹽類物質(zhì)如果操作不當(dāng)會造成色譜柱和管路的堵塞,最后選擇0.1%甲酸水溶液作為水相。

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在儀器Mass Only模式下,用針泵注射進樣的方式,在正離子模式下掃描,每個目標(biāo)物選擇響應(yīng)最高的兩個子離子分別作為定量離子和定性離子。然后在MRM模式下分別優(yōu)化每個離子的去簇電壓和碰撞能量,優(yōu)化后的參數(shù)見表1。最后,采用質(zhì)譜和廢液切換模式,在所有目標(biāo)物從色譜柱上洗脫后,將流動相切換到廢液,這樣既保證了樣品中的雜質(zhì)能及時從色譜柱中流出,又避免過多的雜質(zhì)進入質(zhì)譜,可以起到保護儀器的作用。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取液的優(yōu)化

以陰性樣品為實驗對象,制作空白加標(biāo)樣品。在樣品中加入乙腈提取液后,用甲酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)提取液的pH值(4.0～11.0),考察不同pH值對14種β-受體激動劑提取效果的影響(見圖1)。結(jié)果表明,提取液的pH值對β-受體激動劑的提取有一定的影響,當(dāng)pH為4.0～6.0時,各β-受體激動劑的響應(yīng)值達到最高且結(jié)果相近。但是用pH計來調(diào)節(jié)每一個樣品的pH值耗時較長,不適用于批量樣品的處理。故選擇直接加入甲酸酸化乙腈的方式來調(diào)整提取液的pH值。因此實驗進一步考察了0.5%、1.5%、3.0%和5.0%的甲酸乙腈作為提取液時14種β-受體激動劑提取的提取效果,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,4種甲酸乙腈對14種β-受體激動劑提取效果相近,當(dāng)提取液為0.5%甲酸乙腈時,萊克多巴胺、特布他林、西布特羅、非諾特羅、馬布特羅、班布特羅、溴布特羅和福莫特羅的提取效率稍高,當(dāng)提取液為1.5%的甲酸乙腈時,克倫特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、西馬特羅、齊帕特羅和妥布特羅的提取效率稍高。綜合各目標(biāo)物的提取效率和實驗成本,實驗最終確定使用0.5%甲酸乙腈作為提取液。

圖1 提取液的pH值對14種β-受體激動劑提取效率的影響Fig. 1 Effects of pH value of extraction solvent on the extraction efficiencies of the 14 β-agonists

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸乙腈溶液對14種β-受體激動劑提取效率的影響Fig. 2 Effects of different volume percentages of formic acid in ACN on the extraction efficiencies of the 14 β-agonists

2.2.2固相萃取柱的選擇

實驗分別對比了4種一步式凈化固相萃取柱Captiva EMR-Lipid(SPE-A)、KNORTH?CAFS Clean-up LPAS食品中獸藥多功能凈化柱(SPE-B)、OMNI Creole Prime HLB(SPE-C)和Oasis?PRiME HLB(SPE-D)與不使用固相萃取柱的情況下空白添加樣品中各β-受體激動劑的響應(yīng),結(jié)果見圖3。由圖3可知,使用固相萃取柱的樣品中大部分β-受體激動劑的響應(yīng)比未使用的樣品響應(yīng)更高。說明這14種β-受體激動劑均能順利通過固相萃取柱,并未被柱中填料吸附。并且經(jīng)過固相萃取柱除雜后,減輕了儀器分析過程中雜質(zhì)對目標(biāo)物的干擾,使響應(yīng)增強。

圖3 不同固相萃取柱對14種β-受體激動劑提取效率的影響Fig. 3 Effects of different SPE columns on the extraction efficiencies of the 14 β-agonists SPE-A: Captiva EMR-Lipid SPE column; SPE-B: KNORTH? CAFS Clean-up LPAS SPE column; SPE-C: OMNI Creole Prime HLB SPE column; SPE-D: Oasis? PRiME HLB SPE column.

為檢驗一步式凈化固相萃取柱的凈化效果,采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀對分別使用4種一步式固相萃取柱的樣品溶液進行磷脂、鞘脂和甘油酯含量檢測,并與不使用固相萃取柱的樣品進行對比,總離子流色譜圖如圖4所示。可以看出,一步式凈化固相萃取柱能有效除去樣品提取液中大部分的磷脂、鞘脂和甘油酯類干擾物質(zhì)。以使用固相萃取柱的樣品中磷脂、鞘脂和甘油酯的含量與未凈化樣品的比值進行比較,發(fā)現(xiàn)在本實驗的前處理方法下,SPE-A、SPE-B、SPE-D柱凈化效果更好,均能除去樣品提取液中98%以上的磷脂、鞘脂和甘油酯類物質(zhì)。

圖4 不同凈化方式下樣品中磷脂、鞘脂和甘油酯類物質(zhì)的總離子流色譜圖Fig. 4 Total ion chromatograms of phospholipids, sphingolipids and triglycerides in samples with different purification methods

最后,綜合各目標(biāo)化合物的響應(yīng)強度、凈化效果以及固相萃取柱價格等方面的考慮,選擇凈化效果好且價格較低的SPE-B柱對提取液進行凈化。

2.2.3凈化方式的選擇

根據(jù)文獻[14-16]報道,一步式凈化固相萃取柱的上樣溶液通常選擇70%～85%乙腈水溶液,因此,本實驗對比了以下3種處理方式對目標(biāo)物儀器分析的影響:(1)取5 mL乙腈層上清液與1 mL超純水混合后過柱,氮吹至近干。(2)取5 mL乙腈層上清液與1 mL超純水混合后過柱,氮吹至1 mL(不足1 mL時用蒸餾水定容到1 mL); (3)取5 mL乙腈層上清液直接上樣后,氮吹至近干。結(jié)果表明:(1)中各參數(shù)的響應(yīng)值均低于(2)和(3),可能是因為氮吹時間過長,造成了目標(biāo)物的損失。(3)中沙丁胺醇定性離子中的雜峰峰面積比(2)小,其他參數(shù)(2)與(3)結(jié)果類似,且(3)的氮吹時長比(2)短,操作也更簡便,故最終選擇處理方式(3)。

2.2.4定容溶液的選擇

分別用0.2%甲酸水溶液、10%乙腈水溶液、20%乙腈水溶液、30%乙腈水溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液,考察溶劑對目標(biāo)物儀器分析的影響。結(jié)果表明,用0.2%甲酸水溶液或10%乙腈水溶液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各目標(biāo)物響應(yīng)高,色譜峰形尖銳、對稱,重復(fù)性好。但隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大,所有藥物峰展寬越來越嚴(yán)重,響應(yīng)也變得不穩(wěn)定,峰面積重復(fù)性變差。故選擇0.2%甲酸水溶液、10%乙腈水溶液為樣品氮氣吹干后的復(fù)溶液做進一步驗證。

將空白加標(biāo)樣品進行前處理,氮氣吹干后分別用0.2%甲酸水溶液和10%乙腈水溶液定容,超聲10 min,渦旋過膜后上機分析。結(jié)果表明:兩種定容溶液對儀器分析結(jié)果影響不大,各目標(biāo)物響應(yīng)相近。但是在定容后過0.22 μm的微孔濾膜時,用0.2%甲酸水溶液定容的樣品更加澄清且過膜阻力更小,推測可能是10%乙腈水溶液能將氮氣吹干后附著在管壁的殘留脂類物質(zhì)溶解下來,使定容溶液呈乳濁液,以致過膜時阻力更大。因此,本實驗最終選擇0.2%甲酸水溶液作為定容溶液。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的一個重要因素,也是評價前處理方法好壞的一個重要指標(biāo)?；|(zhì)效應(yīng)越強,方法的準(zhǔn)確性越低[17,18]。本實驗以豬肉、牛肉和羊肉陰性樣品為基質(zhì),用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法分別繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)文獻[19]報道的方法,通過公式ME=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%來計算14種β-受體激動劑的基質(zhì)效應(yīng),用以評價不同基質(zhì)中的干擾物對目標(biāo)物的影響以及內(nèi)標(biāo)法降低基質(zhì)效應(yīng)的效果。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)小于20%時,為弱基質(zhì)效應(yīng);20%～50%時為中等基質(zhì)效應(yīng);大于50%時為強基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,在3種基質(zhì)中,當(dāng)使用外標(biāo)法時,大部分目標(biāo)物會產(chǎn)生中等基質(zhì)效應(yīng)甚至強基質(zhì)效應(yīng),但使用內(nèi)標(biāo)法后,大部分目標(biāo)物為弱基質(zhì)效應(yīng),表明在這14種β-受體激動劑的檢測中,使用內(nèi)標(biāo)法可以有效減小基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

配制14種β-受體激動劑的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,班布特羅以目標(biāo)化合物的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, ng/mL),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其余目標(biāo)物以目標(biāo)化合物的定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(y),相應(yīng)的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以陰性樣品為基質(zhì),做標(biāo)準(zhǔn)添加樣品,以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的加標(biāo)濃度作為檢出限,以10倍信噪比對應(yīng)的加標(biāo)濃度作為定量限。結(jié)果如表2所示,14種β-受體激動劑在1.0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.99,方法的檢出限為0.1～0.2 μg/kg,定量限為0.3～0.6 μg/kg?，F(xiàn)行有效的動物源性食品中β-受體激動劑檢測的國標(biāo)方法[13]中,檢出限為0.25 μg/kg,定量限為0.5 μg/kg,說明該方法與國標(biāo)方法靈敏度相當(dāng),能夠滿足樣品中β-受體激動劑的定量檢測需求。

表2 14種β-受體激動劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r), LODs and LOQs for the 14 β-agonists

2.3.3加標(biāo)回收率與精密度

選擇陰性豬肉、牛肉、羊肉樣品,分別添加低、中、高3個不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.1節(jié)進行前處理,每個水平重復(fù)測定6次,其中班布特羅用外標(biāo)法定量,其余目標(biāo)物用內(nèi)標(biāo)法定量,計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果如表3所示,14種β-受體激動劑的平均回收率為70.25%～117.48%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～14.29%。

表3 14種β-受體激動劑在實際樣品中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 14 β-agonists in real samples (n=6)

2.4 實際樣品的測定

為了進一步驗證方法的可行性和準(zhǔn)確性,選取經(jīng)國標(biāo)方法[13]測定含有克倫特羅的豬肉樣品(3.6 μg/kg)、牛肉樣品(5.7 μg/kg),以及含有沙丁胺醇的羊肉樣品(2.8 μg/kg),用所建方法對這3份樣品進行檢測,定性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法相同。定量結(jié)果顯示,豬肉樣品中克倫特羅的含量為3.9 μg/kg,牛肉樣品中克倫特羅的含量為5.5 μg/kg,羊肉樣品中沙丁胺醇的含量為3.0 μg/kg,結(jié)果均與國標(biāo)方法接近,說明本方法準(zhǔn)確可靠,可以用于畜肉中β-受體激動劑的定性和定量測定。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定畜肉中14種β-受體激動劑的方法。采用一步式凈化固相萃取柱,既能有效去除樣品中的干擾物質(zhì),又簡化了固相萃取的操作,節(jié)省了實驗時間。同時利用同位素內(nèi)標(biāo)法有效降低了實際樣品的基質(zhì)效應(yīng)。此方法簡單快捷,重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,溶劑消耗量少,適合批量樣品中β-受體激動劑殘留的檢測。