翟洪穩(wěn), 馬紅玉, 曹梅榮, 張明星, 馬俊美, 張 巖, 李 強(qiáng)

(河北省食品檢驗(yàn)研究院, 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(特殊食品監(jiān)管技術(shù)), 特殊食品安全與健康河北省工程研究中心, 河北 石家莊 050227)

在常規(guī)化學(xué)分析過程中,樣品制備是最耗時(shí)、最費(fèi)力的步驟,占據(jù)了整個(gè)過程2/3的時(shí)間,同時(shí)超過1/3的分析誤差是在樣品制備過程中產(chǎn)生的[1]。優(yōu)化樣品制備程序、縮短樣品制備時(shí)間,同時(shí)減少分析誤差、提高檢測精度是化學(xué)分析領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。樣品制備過程需要考慮多個(gè)因素,包括人力、時(shí)間、耗材等經(jīng)濟(jì)成本以及方法準(zhǔn)確性和適用性。傳統(tǒng)的樣品制備過程多為離線方法,需人工操作,耗時(shí)長、誤差大且重復(fù)性差[2]。在線樣品制備技術(shù)是近年來發(fā)展的一種前處理手段,其將樣品制備過程與液相色譜系統(tǒng)在線耦合,自動(dòng)化處理樣品,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的在線凈化和富集,具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)利用在線設(shè)備處理樣品,減少人為操作誤差,精密度和準(zhǔn)確性高;(2)與離線方法相比,樣品制備時(shí)間短,溶劑消耗少;(3)樣品制備過程在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行,有效避免樣品污染以及目標(biāo)物的降解[3-5]。

20世紀(jì)80年代,Barceló等[6]將SPE和液相色譜系統(tǒng)結(jié)合測定環(huán)境水體中痕量農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物,為在線分析提供了思路。此后,在線樣品制備技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境、生物以及食品樣品檢測領(lǐng)域[7-11]。我們實(shí)驗(yàn)室也對在線樣品制備技術(shù)進(jìn)行了一些研究,建立了一系列準(zhǔn)確高效的在線分析方法,包括將SPE與二維液相色譜儀在線耦合測定特醫(yī)食品中營養(yǎng)元素維生素A、D、E[12];在線SPE-HPLC-MS/MS測定玉米粉和小麥粉中的伏馬毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等毒素[13,14];在線SPE-HPLC-MS/MS測定豬肉和羊肉中的10種β-受體激動(dòng)劑[15];湍流色譜法(TFC)耦合HPLC-MS/MS測定白菜和黃瓜中的15種農(nóng)藥殘留[16]。在分析食品基質(zhì)中各類危害物時(shí),圖1是一個(gè)典型的分析工作流程。首先是樣品制備,可以采用在線(主要有在線固相萃取(on-line SPE)、管內(nèi)固相微萃取(in-tube SPME)、TFC等)和離線(包括液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、攪拌棒吸附萃取(SBSE)和填充吸附微萃取(MEPS)等)兩種方式[17];樣品經(jīng)前處理后,利用色譜系統(tǒng)(氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、超臨界流體色譜(SFC)和多維色譜(MDC)等)將目標(biāo)化合物進(jìn)一步分離;最后進(jìn)入不同檢測器進(jìn)行定性定量分析。在離線模式下,兩個(gè)設(shè)備之間沒有物理連接,樣品溶液需要手動(dòng)傳輸?shù)缴V系統(tǒng)[17]。而在線模式,則將樣品制備過程(作為第一個(gè)維度)和色譜分離(作為第二個(gè)維度)之間建立物理耦合,樣品直接從制備步驟流向色譜分離步驟,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化傳輸[18,19]。在線樣品制備設(shè)備主要是基于閥切換技術(shù),通常利用六通閥或十通閥,將目標(biāo)物自第一維度轉(zhuǎn)移至第二維度。其中,針對SPE、SPME、TFC與液相色譜系統(tǒng)耦合的研究較多,應(yīng)用較廣。本文主要對這三類技術(shù)進(jìn)行綜述,詳細(xì)介紹其原理、儀器裝置特點(diǎn)及相似之處,最后討論其在食品分析領(lǐng)域的主要應(yīng)用進(jìn)展。

圖1 典型在線樣品制備技術(shù)耦合色譜技術(shù)的工作流程圖Fig. 1 Workflow diagram for typical on-line sample preparation with chromatography technology LLE: liquid-liquid extraction; SBSE: stir bar sorptive extraction; MEPS: microextraction by a packed sorbent; TFC: turbulent flow chromatography; SFC: supercritical fluid chromatography; EI: electron impact; CI: chemical ionization; ESI: electrospray ionization; APCI: atmospheric pressure chemical ionization; APPI: atmospheric pressure photoionization ionization; VWD: variable-wavelength ultraviolet detector; DAD: diode array detector; FLD: fluorescence detector; FID: hydrogen flame ionization detector; ECD: electron capture detector.

1 在線樣品制備技術(shù)

1.1 在線固相萃取技術(shù)

固相萃取技術(shù)與色譜分離原理類似,所以其與液相色譜設(shè)備在線聯(lián)用易實(shí)現(xiàn)在線多維分離[20]。與離線固相萃取相比,在線固相萃取更具有優(yōu)勢,如自動(dòng)化程度高、樣品處理步驟簡單等[21,22]。

如圖2所示,SPE-LC在線聯(lián)用裝置是較為簡單的多維分離設(shè)備,不僅可用于在線固相萃取,進(jìn)行微小調(diào)整后,也可以用于其他樣品制備技術(shù),如In-tube SPME和TFC。該系統(tǒng)主要由六通閥(或十通閥)、加載泵、洗脫泵、SPE柱(第一維)、色譜分析柱(第二維)組成。在線SPE的工作步驟為平衡、上樣、淋洗、洗脫和洗滌。具體工作流程為(1)平衡:六通閥位于加載(Load)位置,由加載泵載入流動(dòng)相沖洗SPE柱,達(dá)到平衡狀態(tài),為接下來的步驟做準(zhǔn)備;(2)上樣:六通閥位于Load位置,自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品注入SPE柱;(3)淋洗:六通閥位于Load位置,加載泵不斷淋洗流動(dòng)相帶走雜質(zhì)化合物,SPE柱對目標(biāo)物富集凈化,此步需要優(yōu)化淋洗時(shí)間,太短不能充分去除雜質(zhì)化合物,太長則有可能導(dǎo)致目標(biāo)物損失;(4)洗脫:六通閥切換到進(jìn)樣(Inject)位置,由洗脫泵將目標(biāo)物洗脫下來,轉(zhuǎn)入第二維進(jìn)行分析檢測;(5)洗滌:六通閥切換到Load位置,利用高比例有機(jī)相進(jìn)一步去除殘留在SPE柱上的雜質(zhì)化合物,清洗完成后流動(dòng)相回到初始比例,等待下次進(jìn)樣,并重復(fù)以上步驟[23,24]。在線SPE過程一般使用低于5 mL/min的流速和合適的洗脫溶劑,避免峰展寬、峰拖尾等現(xiàn)象。

圖2 在線SPE-LC裝置示意圖Fig. 2 Schematic representation of on-line SPE-LC

SPE-LC在線聯(lián)用裝置洗脫過程根據(jù)洗脫溶劑與萃取溶劑流動(dòng)方向分為正向沖洗和反向沖洗。圖2所選用的反沖模式在實(shí)際工作中應(yīng)用較為廣泛,SPE柱頭部高度保留的目標(biāo)物通過反向洗脫充分轉(zhuǎn)移至分析色譜柱,最大限度地減少峰展寬效應(yīng)。但采用反向沖洗模式,特別是進(jìn)樣量較大(大于100 μL)時(shí),容易將雜質(zhì)帶入分析柱,造成堵塞,因此樣品提取后,需要適當(dāng)?shù)倪^濾或者離心后進(jìn)入在線SPE裝置[24]。

在實(shí)際樣品檢測中,目標(biāo)分析物含量低,基質(zhì)效應(yīng)影響大,在線SPE柱填料的選擇尤為重要。在線SPE柱填料通?？煞譃?種類型:鍵合硅膠型填料、高分子聚合物型填料、吸附型填料、混合型填料及專用填料。硅膠基質(zhì)柱主要用于弱極性和中性目標(biāo)物的分析,適用范圍廣,應(yīng)用廣泛,但是pH耐受范圍窄[25]。聚合物基質(zhì)填料對極性和中性大分子物質(zhì)分離性能良好,且使用pH范圍寬、化學(xué)穩(wěn)定性高,但是針對性差,選擇性低,共提取樣品溶液雜質(zhì)成分多,給二維分析檢測帶來不便[26]。離子交換吸附劑主要適用于帶電荷的目標(biāo)物質(zhì)。分子印跡聚合材料和免疫親和吸附劑可以特異性識別目標(biāo)物,具有良好的選擇性,從而大大提高二維分析柱的分析效率[27]。目前Waters公司開發(fā)了不同填料的商用在線SPE柱,包括C18柱、HLB柱、MCX柱、MAX柱、WCX柱和WAX柱,為在線制備技術(shù)的研究提供了便捷。

各類目標(biāo)分析物千差萬別,建立在線樣品制備方法要根據(jù)其性質(zhì)選擇相適應(yīng)的在線凈化柱。為促進(jìn)在線分析方法在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用,研究人員針對不同物質(zhì)特性開發(fā)制備出了各種新型凈化柱填料。Nian等[28]開發(fā)校偶介孔聚合物(scholl-coupling mesoporous polymer, NH2@SMPA)作為在線固相萃取填料分析豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑。Lu等[29]合成了溴化共價(jià)有機(jī)骨架(brominated covalent organic framework, Br-COF)作為在線凈化柱填料,將在線SPE與液相色譜耦合測定食品中6種多溴聯(lián)苯醚,Br-COF與商業(yè)吸附劑相比,萃取效果更好,特異性更強(qiáng)。Sun等[30]采用SPE-UPLC-MS/MS測定海產(chǎn)品中痕量全氟和多氟烷基物質(zhì),制備了對全氟和多氟烷基物質(zhì)具有快速吸附平衡和高吸附量的離子共價(jià)有機(jī)骨架(ionic covalent organic framework, TPB-BFBIm-iCOF)填料。分子印記材料Polymyxin E能夠特異性地保留與其分子大小和空間結(jié)構(gòu)相似的多肽類抗生素, Song等[11]將其作為填料制備在線固相萃取柱,有效富集和純化動(dòng)物組織中的多肽類抗生素。

1.2 在線管內(nèi)固相微萃取技術(shù)

In-tube SPME是一種微型樣品制備技術(shù),在細(xì)管或者毛細(xì)管內(nèi)涂有固定相,樣品共提取液通過毛細(xì)管時(shí)目標(biāo)物質(zhì)被保留,雜質(zhì)成分被去除。在線In-tube SPME系統(tǒng)萃取目標(biāo)物的方式有兩種:一種是樣品溶液以一個(gè)方向通過毛細(xì)管系統(tǒng)進(jìn)行萃取;另外一種是在毛細(xì)管內(nèi)重復(fù)抽吸樣品溶液進(jìn)行萃取[31,32]。目標(biāo)物解吸后被轉(zhuǎn)移至色譜分析柱進(jìn)行分離和測定,解吸分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種方式[33]。

流動(dòng)萃取模式需配置一個(gè)自動(dòng)閥,類似于在線SPE裝置(圖2)。在In-tube SPME裝置中,毛細(xì)管(第一維度)連接在六通閥相應(yīng)的端口上,加載泵將樣品溶液經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器載入毛細(xì)管內(nèi),洗脫泵載入洗脫溶劑,并將被提取的目標(biāo)物質(zhì)洗脫至二維分析柱以分離檢測。利用閥門的切換來完成在線分析的所有步驟:當(dāng)閥門處于加載位置時(shí),樣品溶液進(jìn)入到毛細(xì)管內(nèi),同時(shí)目標(biāo)分析物被固定到毛細(xì)管內(nèi);閥門切換至進(jìn)樣位置時(shí),洗脫溶液進(jìn)入毛細(xì)管內(nèi)對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行洗脫[34]。

重復(fù)抽提模式(圖3)需要重新對自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行配置,將毛細(xì)管連接于進(jìn)樣針和樣品環(huán)之間。這種模式下,六通閥和計(jì)量泵包含于自動(dòng)進(jìn)樣器模塊之中,計(jì)量泵用于在進(jìn)樣瓶中循環(huán)吸取樣品,直至完成提取過程。但是,這種模式需要匹配相應(yīng)的軟件,能夠自動(dòng)控制不斷抽取樣品。如圖3,當(dāng)六通閥保持在加載位置時(shí),洗脫泵直接連接至二維分析柱。此時(shí),樣品被重復(fù)抽取,直至目標(biāo)物提取完全,這個(gè)過程需要持續(xù)較長時(shí)間。因此,為提高目標(biāo)物的回收率,必須優(yōu)化循環(huán)提取的次數(shù)。洗脫步驟,六通閥切換到進(jìn)樣位置,流動(dòng)相通過毛細(xì)管,將提取的目標(biāo)物解吸下來,轉(zhuǎn)移至分析柱進(jìn)行定量分析[35]。

圖3 在線In-tube SPME-LC裝置示意圖Fig. 3 Schematic representation of on-line in-tube SPME-LC

毛細(xì)管內(nèi)徑較小(大多小于1 mm,研究中常用的有0.32、0.50和0.53 mm等)導(dǎo)致系統(tǒng)壓力較高,增加了重復(fù)提取的難度。不同類型的萃取相被用于In-tube SPME,特別是壁涂開口管柱(WCOT柱),其萃取相以薄膜的形式涂在毛細(xì)管壁上,可以提供更好的滲透性,在實(shí)際分析中被普遍應(yīng)用[36]。

In-tube SPME萃取體系的效率和選擇性取決于萃取速率、樣品體積、樣品pH值、固定相類型以及毛細(xì)管柱內(nèi)徑、長度和膜厚等因素。選擇性材料被用于制備毛細(xì)管,除了聚二甲基硅氧烷等傳統(tǒng)涂料外,還引入了許多新的In-tube SPME涂料,如單壁碳納米管、聚合物、單片材料等[32]。將In-tube SPME與LC在線耦合的優(yōu)勢有很多,如小型化和自動(dòng)化能力、高通量性能以及低溶劑消耗[36]。

1.3 湍流色譜法在線凈化技術(shù)

TFC是在20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一種分析工具,它是基于流體在高流速下表現(xiàn)出來的非流體特征,將樣品中的大分子(如蛋白質(zhì)、色素、藥物)與小分子分析物分離開來[37]。TFC在線凈化技術(shù)是近年來發(fā)展起來的自動(dòng)在線樣品制備技術(shù),與液相色譜結(jié)合,將復(fù)雜樣品直接注入儀器分析系統(tǒng)中。

TFC在線凈化技術(shù)通常使用粒徑大且不規(guī)則的顆粒作為填料,是一種將渦流擴(kuò)散、化學(xué)作用以及體積排阻的原理相結(jié)合的樣品前處理技術(shù)[38]。TFC柱可采用不同的萃取相,表面修飾不同化學(xué)基團(tuán)使其具有特殊的吸附性,主要有3種類型:(1)硅膠基質(zhì)柱(如C8、C18、Cyclone C2、Cyclone Fluro)對非極性物質(zhì)保留性較強(qiáng);(2)離子交換柱(如MCX、MAX、WCX、WAX)適用于酸性(如磺酸鹽類)或堿性(如季銨鹽類)化合物;(3)聚合物基質(zhì)柱(如HLB、Cyclone、Cyclone-P)可用于分析極性目標(biāo)物。Thermo Scientific公司特有大孔填料TFC柱,包括保留極性和非極性分析物的HyperSep Retain PEP,保留堿性和非極性分析物的HyperSep Retain CX,保留酸性和非極性分析物的HyperSep Retain AX和保留高極性分析物的HyperSep Hypercarb等。在線TFC柱平均顆粒直徑為30～60 μm。最初,TFC色譜柱被設(shè)計(jì)為內(nèi)徑1 mm,流速大于4 mL/min才能達(dá)到渦流條件,隨著柱徑從1 mm減小到0.5 mm,溶劑消耗減少,且流速大于1.5 mL/min就能達(dá)到湍流流動(dòng)條件[39]。高流速產(chǎn)生的渦流增加了流動(dòng)相內(nèi)的傳質(zhì)作用,大分子物質(zhì)傳質(zhì)作用差,擴(kuò)散效率低,小分子化合物可以進(jìn)入到填料表面的孔隙中,因此,TFC在線凈化柱能夠保留小分子,而排除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[40]。

TFC-LC耦合方式有多種,其中聚焦模式是最常用的(圖4)。聚焦模式系統(tǒng)適用于復(fù)雜基質(zhì)中多殘留分析,有良好的靈敏度和重現(xiàn)性。聚焦模式是完全自動(dòng)化的系統(tǒng),需要2個(gè)六通閥(V1和V2)和2個(gè)色譜泵(四元加載泵和二元洗脫泵)來實(shí)現(xiàn)不同流路的自動(dòng)切換,同時(shí)六通閥V2僅需4個(gè)端口,剩余2個(gè)未使用的端口安裝盲塞。樣品加載、轉(zhuǎn)移、洗脫和調(diào)節(jié)(再平衡)是TFC在線系統(tǒng)的主要分析步驟。樣品加載時(shí),閥門V1和V2處于Load位置,樣品自進(jìn)樣器隨高流速流動(dòng)相進(jìn)入到TFC柱(第一維),小分子分析物被提取出來,固定在TFC柱中,大分子雜質(zhì)則被排除,流入廢液;接下來,閥門V1和V2切換到Inject位置,流路中的洗脫溶劑通過TFC柱將目標(biāo)分析物解吸出來,并轉(zhuǎn)移至分析柱(第二維),在這一過程中,進(jìn)樣泵的流速降低,從而將分析物富集在分析柱的柱頭上;此后,閥門V2重新轉(zhuǎn)到Load位置,分析柱對目標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步分離檢測,同時(shí)沖洗TFC柱,避免遺留效應(yīng)和交叉污染[41,42]。閥門V1保持在Inject位置,使回路充滿解吸溶劑。最后,2個(gè)閥門回到初始位置(Load位置),平衡TFC柱,為分析下一個(gè)樣品做準(zhǔn)備。

圖4 在線TFC-LC裝置示意圖Fig. 4 Schematic representation of on-line TFC-LC

Franco等[43]提出了一種基于聚焦模式下的TFC在線凈化新裝置,僅使用一個(gè)自動(dòng)化的十通閥來替代上述2個(gè)六通閥,該系統(tǒng)其他元件與上述相同,額外增加了一個(gè)盲塞和一個(gè)三通接頭,將來自加載泵和洗脫泵的流動(dòng)相與分析柱連接起來。但是,在這種設(shè)置中,TFC柱只能進(jìn)行正向沖洗(與提取液流動(dòng)方向一致),而在前面描述的2個(gè)閥門設(shè)置中,既可進(jìn)行正向沖洗又可進(jìn)行反向沖洗。因此,這種裝置可能需要更長的清洗時(shí)間,以確保TFC柱中的基質(zhì)干擾化合物完整、有效地去除。

在線SPE結(jié)構(gòu)配置也可以用于TFC系統(tǒng),但是需將SPE柱替換為TFC柱,或者使用可以適應(yīng)高流速的SPE柱。在線SPE結(jié)構(gòu)配置相對簡單,但存在局限性,不能有效地將分析物聚焦于分析柱的頭部,二維分析柱分離目標(biāo)物時(shí),導(dǎo)致峰形變寬,分離效率降低,不利于多種化合物的分析[42]。

2 在線樣品制備技術(shù)耦合液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在食品檢測中的應(yīng)用

農(nóng)藥、獸藥在促進(jìn)農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)生產(chǎn)方面做出了巨大貢獻(xiàn),但殘留在食品中的藥物對人體健康會(huì)產(chǎn)生多方面不利影響,如變態(tài)反應(yīng)、過敏反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性等。此外,食品中的生物毒素因毒性強(qiáng)、污染面廣,也成為食品安全檢測中重點(diǎn)關(guān)注的對象。因此,政府機(jī)構(gòu)規(guī)定了食品中有害物質(zhì)的最大殘留限量(maximum residue limit, MRL)以確保食品安全,MRL通常對應(yīng)非常低的分析物濃度,需要更加先進(jìn)的樣品制備技術(shù)來滿足實(shí)際檢測需求[7]。離線樣品制備一般需要提取和凈化,耗費(fèi)人力和時(shí)間,而采用在線樣品制備技術(shù),樣品在經(jīng)簡單的提取(甲醇、乙腈等溶劑)后,即可使用儀器自動(dòng)化分析,省去了樣品凈化過程,更加高效、準(zhǔn)確,在食品檢測中應(yīng)用廣泛。

2.1 食品中獸藥殘留檢測

在線樣品制備技術(shù)應(yīng)用于食品中各類獸藥殘留的檢測,如磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類抗生素,表1列舉了3種在線聯(lián)用設(shè)備在獸藥殘留檢測方面的應(yīng)用。針對磺胺類抗生素,Li等[44]對其在魚類中的在線分析方法進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在樣品預(yù)處理過程中使用單一在線柱,如HLB或C18,無法從樣品中去除可能引起基質(zhì)效應(yīng)的磷脂,創(chuàng)新性地將混合陽離子交換柱(Oasis?MCX)與親水親脂平衡柱(Oasis?HLB)串聯(lián)用于在線固相萃取凈化,以消除基質(zhì)干擾,其中Oasis?MCX柱用于純化,Oasis?HLB柱用于Oasis?MCX柱與色譜柱之間的轉(zhuǎn)換,這種在線固相萃取結(jié)合UHPLC-MS/MS的方法為復(fù)雜基質(zhì)中抗生素的自動(dòng)化、高效率檢測指出了新的方向。此研究對實(shí)際樣品所有目標(biāo)物檢出的準(zhǔn)確度為80%～101%,與傳統(tǒng)方法相比,檢出限(1.46～15.5 ng/kg)和定量限(49～51.6 ng/kg)更低,準(zhǔn)確度更高。顧欣等[51]建立了在線SPE-LC-MS/MS檢測牛奶中14種磺胺藥物殘留的方法,有效避免了牛奶中含有的蛋白質(zhì)和乳脂對儀器的干擾和污染,方法的檢出限為0.05 μg/kg,定量限為0.1 μg/kg,回收率在60%～90%范圍內(nèi),批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,比離線固相萃取凈化方法成本低,效率高,準(zhǔn)確性好。除了在線SPE外,TFC和In-tube SPME也被用于食品中獸藥殘留的檢測。Zheng等[50]將管內(nèi)固相微萃取與液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/ESI-QTOF-MS)相結(jié)合,建立了測定牛奶、雞蛋、雞肉和魚肉中7種微量喹諾酮類抗生素的方法。樣品制備過程采用在線聚甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱萃取,然后采用LC/ESI-QTOF-MS識別目標(biāo)化合物,7種喹諾酮類抗生素在雞蛋、牛奶、雞肉和魚肉中的檢出限分別為0.3～1.2、0.2～3.0、0.2～0.7和0.2～1.0 ng/g,回收率在80.2%～115.0%范圍內(nèi),RSD<14.5%,該方法檢出限低,精密度和靈敏度較高。高分辨質(zhì)譜的使用,進(jìn)一步提高了檢測精確度和靈敏度,也成為在線樣品制備技術(shù)發(fā)展的新趨勢。Bousova等[47]建立了7類(氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和甲氧芐氨嘧啶類)36種抗生素的鑒別和定量方法,可用于雞肉中抗生素的檢測。樣品利用乙腈-2%三氯乙酸(45∶55, v/v)渦旋提取5 min,即可將提取液注入TFC在線系統(tǒng),自動(dòng)化除去大分子和小分子雜質(zhì),根據(jù)2002/657/EC對方法進(jìn)行驗(yàn)證,均符合要求,與傳統(tǒng)的凈化技術(shù)相比,該方法簡單、快捷、高效。

表1 在線樣品制備技術(shù)耦合液相色譜-質(zhì)譜在食品獸藥殘留檢測中的應(yīng)用Table 1 Applications of on-line sample preparation with LC-MS system for determination of veterinary drug residues in foods

2.2 食品中農(nóng)藥殘留檢測

在水果、蔬菜以及糧食作物的生產(chǎn)加工等過程中,農(nóng)藥的使用越來越頻繁,農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重。因此,針對農(nóng)藥殘留問題,研究人員不斷開發(fā)新方法,采用新手段,在線分析方法也不斷被應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(表2)。Pérez-Mayán等[52]將基于反相聚苯乙烯-二乙烯苯吸附劑的SPE柱與LC-MS/MS在線耦合,自動(dòng)監(jiān)測葡萄酒中37種殺菌劑和11種殺蟲劑。通過優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù),如進(jìn)樣體積、洗脫條件等,48種農(nóng)藥的定量限均低于2.5 μg/L,并且回收率和重復(fù)性良好,為葡萄酒中殺菌劑和殺蟲劑的檢測提供了新的解決方法。張海超等[53,54]對采用在線凈化技術(shù)檢測農(nóng)藥殘留物質(zhì)進(jìn)行了多項(xiàng)研究。一是將TFC在線凈化技術(shù)與四極桿軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q-Orbitrap HRMS)相結(jié)合,可在無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下完成果蔬中212種農(nóng)殘的高通量篩查和確證,定量限均可達(dá)到5 μg/kg,準(zhǔn)確性和靈敏度良好,方法采用的TFC在線前處理方法不僅簡化了樣品制備過程,而且有效避免了傳統(tǒng)凈化方式中固相萃取填料石墨化炭黑及PSA對含平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥或酸性農(nóng)藥的吸附[53];二是采用poly(BMA-co-EDMA)整體柱作為第一維度,對大米中15種酰胺類除草劑進(jìn)行在線凈化提取后,耦合LC-MS/MS進(jìn)行定性定量分析,該方法定量限為0.5～5.0 μg/kg,回收率為75.5%～121.3%,精密度均小于15%。實(shí)驗(yàn)表明TFC在線凈化方法可以有效去除大米中的淀粉和油脂,且整體柱性質(zhì)穩(wěn)定,兼容性良好,可以反復(fù)使用,節(jié)約成本[54]。

表2 在線樣品制備技術(shù)耦合液相色譜-質(zhì)譜在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用Table 2 Applications of on-line sample preparation with LC-MS system for determination of pesticide residues in foods

2.3 食品中生物毒素的檢測

生物毒素主要包括真菌毒素和海洋生物毒素,毒素污染影響食品安全,因此需要不斷發(fā)展檢測技術(shù),加強(qiáng)檢測水平[57]。表3總結(jié)了不同基質(zhì)中各類毒素的在線測定方法,可以看出在線凈化技術(shù)在毒素檢測領(lǐng)域也起到重要作用。Xu等[58]利用在線SPE對魚類樣品進(jìn)行凈化,優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件(SPE柱類型、洗脫溶劑以及閥切換時(shí)間等),建立了在線SPE-UHPLC-MS/MS同時(shí)測定魚類中8種常見微囊藻毒素的方法,方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,該方法基質(zhì)效應(yīng)干擾較弱,為0.88～1.09,加標(biāo)回收率為70.5%～98.9%, RSD為1.3%～3.5%,符合美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)《標(biāo)準(zhǔn)方法性能要求指南》的精密度和準(zhǔn)確度要求。此外,本方法微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-RR檢出限為0.1 μg/kg,約為GB 5009.273-2016(檢出限0.3 μg/kg)的1/3,證明方法可行性良好。

表3 在線樣品制備技術(shù)耦合液相色譜-質(zhì)譜在食品毒素檢測中的應(yīng)用Table 3 Applications of on-line sample preparation with LC-MS system for determination of toxin in foods

赭曲霉毒素A(OTA)是污染葡萄及其深加工產(chǎn)品的主要真菌毒素之一,為了準(zhǔn)確測定其在葡萄酒中的含量,Campone等[59]和Andrade等[60]分別基于在線SPE和In-tube SPME在線樣品凈化方法,為OTA的自動(dòng)富集、純化以及測定提供新方法。Campone等[59]利用在線SPE-HPLC-MS/MS方法,將OTA濃縮于Oasis MAX SPE柱上,洗滌去除干擾基質(zhì)后,以反沖模式將目標(biāo)物洗脫下來,在整體柱上實(shí)現(xiàn)了色譜分離。該方法無顯著基質(zhì)效應(yīng)(95%～108%),檢出限(0.012～0.014 ng/mL)和定量限(0.041～0.045 ng/mL)遠(yuǎn)低于歐盟委員會(huì)規(guī)定的限值;回收率和重復(fù)性符合歐盟法規(guī)No 519/2014。與傳統(tǒng)方法相比,該方法顯示出更好的分析性能,而且能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測和分析程序的完全自動(dòng)化。Andrade等[60]則將In-tube SPME與HPLC-MS/MS耦合,其將C18填充的PEEK毛細(xì)管作為萃取柱,優(yōu)化萃取溶劑乙腈的比例和樣品加載的時(shí)間來提高在線凈化效率,該方法靈敏度和精密度良好,檢出限為0.02 μg/L,在巴西農(nóng)業(yè)、牲畜和食品供應(yīng)部(MAPA)的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)主要污染各種農(nóng)產(chǎn)品,而黃曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的羥基化代謝產(chǎn)物,是鮮牛奶中最常見的一種污染物。Nonaka等[61]采用In-tube SPME-HPLC-MS/MS技術(shù),建立了一種簡便、靈敏的自動(dòng)測定堅(jiān)果、谷物、干果和香料中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的方法,該方法采用Supel-Q PLOT毛細(xì)管柱作為第一維凈化柱,Zorbax Eclipse XDB-C8柱作為第二維分析柱,該方法檢出限為2.1～2.8 pg/mL,回收率>80%,重復(fù)性RSD<11.2%,已成功應(yīng)用于食品樣品的分析。Campone等[62]報(bào)告了一種快速自動(dòng)分析牛奶和乳制品中AFM1的方法。該方法首先進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀和AFM1提取,然后采用在線SPE耦合UHPLC-MS/MS分析,實(shí)現(xiàn)AFM1的自動(dòng)預(yù)富集和定量測定。對不同的乳制品進(jìn)行了驗(yàn)證研究,方法定量限(1.5～2.4 ng/kg)約為歐盟法規(guī)No 1881/2006允許的人類直接食用的牛奶和乳制品中AFM1最高水平的1/25;加樣回收率(86%～102%)和重復(fù)性(RSD<8%)符合歐盟法規(guī)No 401/2006規(guī)定的測定食品中真菌毒素水平的性能標(biāo)準(zhǔn)。此外,在研究的不同牛奶和乳制品中沒有觀察到基質(zhì)效應(yīng)。該方法測定精確度高于傳統(tǒng)方法,同時(shí)優(yōu)化了樣品制備程序,減少了分析時(shí)間和成本,實(shí)現(xiàn)了高通量樣品檢測。

2.4 食品中其他化學(xué)危害物的檢測

食品中危害物種類復(fù)雜繁多,除農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和生物毒素外,研究人員也將在線樣品制備技術(shù)應(yīng)用于其他污染物和殘留物的測定,開發(fā)和建立了簡單高效的檢測方法。Cuthbertsona等[65]建立了在線SPE-LC-MS/MS定量測定飲用水中10種鹵代苯醌類化合物的新方法,該方法定量限為0.2～166 ng/L,回收率為70%～111%, RSD<20%,滿足實(shí)際檢測需求,與離線方法相比,減少了濃縮步驟,節(jié)約樣品、溶劑和標(biāo)準(zhǔn)品。Hou等[66]針對豆芽和綠豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑,建立了在線SPE-LC-MS/MS,并對在線凈化條件進(jìn)行優(yōu)化,包括上樣溶劑、上樣溶液pH、洗脫溶劑、上樣和洗脫流速等,該方法檢出限低(2.34～20.2 ng/kg),回收率(86.0%～109%)和重復(fù)性(RSD≤9.8%)良好,可用于豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的在線測定。

總體來看,對于食品中各類危害物的測定,與離線樣品制備相比,在線樣品制備分析時(shí)間和溶劑消耗大大減少,且靈敏度和準(zhǔn)確度更好,表明在線樣品制備技術(shù)可以應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域。

3 總結(jié)與展望

本文主要討論了在線樣品制備技術(shù)耦合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用,詳細(xì)介紹了常用在線樣品制備技術(shù)(在線SPE、In-tube SPME和TFC)的原理和基本設(shè)備。3種在線樣品制備技術(shù)原理和儀器具有相似性,均基于閥切換技術(shù),將樣品制備過程作為第一維度,通過六通閥(或十通閥)物理耦合到第二維度,實(shí)現(xiàn)在線自動(dòng)化分析。本文對近十年來在線樣品制備技術(shù)在獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、毒素污染以及其他危害物方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,發(fā)現(xiàn)基于在線樣品制備技術(shù)所開發(fā)的方法樣品制備過程簡單,具有樣品用量小、溶劑消耗少、樣品通量高、分析成本低、結(jié)果準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),滿足食品安全檢測的要求。在線樣品制備技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速,今后可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行更深入研究:(1)目前應(yīng)用較為成熟的在線凈化柱常以十八烷基鍵合硅膠或聚合物基質(zhì)為填料,開發(fā)制備更多種類填料的在線凈化柱,有助于擴(kuò)大在線樣品制備技術(shù)的應(yīng)用范圍;(2)與普通的檢測器相比,高分辨質(zhì)譜具有更好的精密度和準(zhǔn)確度,嘗試將在線樣品制備技術(shù)與高分辨質(zhì)譜儀串聯(lián)起來,有利于在線樣品制備技術(shù)方法的進(jìn)一步發(fā)展;(3)針對不同食品基質(zhì)進(jìn)行評估對比,持續(xù)優(yōu)化檢測流程,提高檢測效率。隨著在線樣品制備技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,特別是食品安全問題社會(huì)關(guān)注度不斷提高,其在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。