郭冬梅, 夏一然, Mujeeb ur RAHMAN, 王建忠, 劉家瑋, 白 泉

(合成與天然功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所,陜西省現(xiàn)代分離科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710127)

抗體藥物因其靶向性強(qiáng)、特異性高、毒副作用小、療效好,已廣泛用于癌癥等疑難雜癥的治療。由于抗體原料液的復(fù)雜性及對抗體產(chǎn)品高純度的要求,抗體的分離純化成為抗體藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵,約占抗體生產(chǎn)成本的50%～80%[1]。目前抗體的分離純化主要采用蛋白A親和層析[2-5]或其他色譜分離技術(shù),如親硫色譜[6]、疏水電荷誘導(dǎo)色譜[7,8]、混合模式色譜[9]及仿生多肽親和色譜[10]等,但抗體蛋白通常需在酸性條件下進(jìn)行洗脫,易導(dǎo)致抗體聚集失活。這些聚集體必須除去,這不僅增加操作單元和生產(chǎn)成本,還降低了產(chǎn)量。

溫敏色譜是近年來發(fā)展起來的新型色譜分離技術(shù)[11]。它是將溫敏聚合物,如聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)修飾到固定相表面,利用PNIPAM對環(huán)境溫度的響應(yīng)特性,以純水作為流動相,通過調(diào)節(jié)柱溫來改變固定相表面的親疏水性,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的有效分離[12]。溫敏色譜分離條件溫和,避免使用有機(jī)溶劑,綠色環(huán)保,其最低臨界溶液溫度(LCST)為32 ℃,且其相變行為不易受其他環(huán)境因素(如pH或鹽濃度)的影響,在接近生理?xiàng)l件下分離不會破壞生物大分子的活性,為生物大分子的分離提供了新思路[13,14]。

Ooi等[15]將PNIPAM與配體4-巰基乙基吡啶(MEP)偶聯(lián)后接枝到瓊脂糖微球,制備了一種溫敏親和吸附劑用于抗體分離。該吸附劑在40 ℃可吸附γ-球蛋白,在5 ℃可解吸90%的γ-球蛋白(γ-globulin)。證明了利用溫敏親和吸附劑通過調(diào)控溫度可對抗體蛋白進(jìn)行有效吸附和解吸。隨后,該課題組[16]將PNIPAM與4-乙烯基吡啶(4-VP)共聚,將溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]接枝到聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)聚合物微球上,制備了一種溫度和pH雙控響應(yīng)色譜分離介質(zhì)用于抗體分離,但γ-球蛋白必須在5 ℃酸性(pH 3.0)條件下才能完全洗脫。Nagase等[17]用PNIPAM和聚(4-乙烯基吡啶)(P4VP)對二氧化硅表面進(jìn)行改性,制備了一種混合聚合物刷改性的溫敏色譜固定相。利用混合聚合物刷的特殊性質(zhì),只需改變柱溫即可分離利妥昔單抗和牛血清白蛋白(BSA)。此外,該課題組[18]還制備了溫敏陰離子交換聚合物刷修飾的溫敏離子交換色譜固定相,通過溫度調(diào)節(jié)抗體蛋白與固定相之間的疏水和靜電相互作用力,實(shí)現(xiàn)了對西妥昔單抗、貝伐單抗和利妥昔單抗混合物的分離。最近,我們課題組[19]以MEP為配體,以硅膠為基質(zhì),以溫敏樹枝狀聚合物聚酰胺-胺-PNIPAM(PAMAM-PNIPAM)為間隔臂,制備了高容量的溫敏仿生親和色譜固定相,構(gòu)建了一種用于抗體分離純化的高容量、綠色環(huán)保的溫敏仿生親和色譜方法。該方法以純水為流動相,BSA和γ-球蛋白在40 ℃上樣,5 ℃進(jìn)行洗脫,僅通過改變溫度可一步實(shí)現(xiàn)對二者的完全分離。將其應(yīng)用于人血清中IgG和蛋黃中IgY的分離純化,一步純化后IgG和IgY的純度為99%,質(zhì)量回收率大于90%。但該固定相對BSA和γ-球蛋白均有保留,對抗體蛋白的特異選擇性較低。

研究表明,將PNIPAM與親水或疏水性單體共聚成嵌段共聚物可調(diào)節(jié)溫敏聚合物的親疏水性[20]。P4VP是一種兩親性聚合物,具有懸垂的可電離吡啶基團(tuán),這些吡啶環(huán)提供了與蛋白質(zhì)的多個相互作用位點(diǎn),作為固定相配基用于抗體的分離純化[16,21]。為了進(jìn)一步提高溫敏親和色譜固定相對抗體的選擇性,本研究將4-VP與PNIPAM共聚,以硅膠為基質(zhì),制備嵌段共聚溫敏親和固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP。以BSA和γ-球蛋白為模型蛋白,對制備的溫敏親和固定相的色譜性能進(jìn)行了表征。分別考察了流動相鹽濃度和溫度對二者分離性能的影響。結(jié)果表明,該溫敏親和色譜固定相在40 ℃時可選擇性保留γ-球蛋白,而不保留BSA,僅通過改變溫度和鹽濃度在5 ℃時即可一步實(shí)現(xiàn)對抗體的分離純化。該溫敏親和色譜固定相不僅對抗體表現(xiàn)出特異的選擇性,而且洗脫條件溫和,綠色環(huán)保,從根本上解決了傳統(tǒng)親和色譜采用酸性洗脫易使抗體蛋白變性失活的難題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀(LC10A, Shimadzu,日本), X-射線光電子能譜儀(PH15000 Versa Probe Ⅲ, Ulvac,日本),傅里葉變換紅外光譜儀(TENSOR, Bruker,德國),凝膠滲透色譜儀(GPC, Agilent1260 Infinity Ⅱ,安捷倫,美國)。

硅膠微球(5 μm,孔徑30 nm)購于中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所。N-異丙基丙烯酰胺、4-VP、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、安息香雙甲醚(DMPA)購于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。偶氮二異丁腈(AIBN)購于上海山浦化工有限公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購于上海思域化工科技有限公司。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購于成都科隆化學(xué)品有限公司。BSA和γ-球蛋白(來源于牛血)購于Sigma-Aldrich(美國)。

1.2 溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]的制備

依據(jù)文獻(xiàn)[15],采用可逆加成-斷裂轉(zhuǎn)移法(RAFT)制備3 kDa的溫敏聚合物-鏈轉(zhuǎn)移劑(PNIPAM-CTA)。將3.15 g PNIPAM-CTA和8.0 mL DMF加入25 mL圓底燒瓶中攪拌溶解,再分別加入14.53 g AIBN和1.05 g 4-VP,接入雙排管,充分排氣后將圓底燒瓶移入70 ℃油浴中反應(yīng)18 h。取出燒瓶置于冰水浴中猝滅反應(yīng),用截留1 kDa的透析袋對反應(yīng)產(chǎn)物透析3 d,然后冷凍干燥除去產(chǎn)物中的水分,得到溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]-CTA[16]。

1.3 嵌段溫敏親和配基P[NIPAM-b-4VP]-MEP的制備

將0.86 g 的P[NIPAM-b-4VP]-CTA和4 mL DMF加入到25 mL圓底燒瓶中,攪拌溶解后再加入6.2 mg的TCEP,通入N25 min后,再加入0.15 g的正己胺,繼續(xù)通入N2攪拌反應(yīng)3 h,將P[NIPAM-b-4VP]-CTA中的三硫酯完全還原成巰基,溶液顏色變?yōu)樯罹G色。用錫紙包裹燒瓶,在避光條件下加入6 mg光催化劑DMPA和0.15 g 4-VP,通入N215 min,在365 nm的紫外光照射下攪拌3 h。反應(yīng)結(jié)束后,溶液變?yōu)樽厣Ｓ媒亓? kDa的透析袋將產(chǎn)物透析3 d,冷凍干燥后得到P[NIPAM-b-4VP]-MEP。

1.4 嵌段溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的制備

將0.35 g P[NIPAM-b-4VP]-MEP和40 mL去離子水加入到100 mL三頸瓶中,冰水浴中攪拌使其完全溶解。再加入0.59 g的EDC·HCl和0.36 g的NHS,繼續(xù)攪拌2 h后加入1.2 g的氨基化硅膠SiO2-NH2, 25 ℃攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,依次用蒸餾水和甲醇洗滌產(chǎn)物3次,在30 ℃真空干燥箱中干燥12 h,得到嵌段溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP。

1.5 色譜柱裝填及色譜條件

將0.8 g制備的溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP超聲分散到25 mL甲醇中,采用勻漿法在35 MPa壓力下裝填入50 mm×4.6 mm的不銹鋼色譜柱內(nèi)。

將色譜柱浸入40 ℃恒溫水浴內(nèi)恒溫,采用流動相A液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)平衡色譜柱30 min,進(jìn)樣10 μL, 10 min后停泵。將色譜柱移至5 ℃恒溫水浴中恒溫10 min,然后用在5 ℃預(yù)冷的流動相B液(50 mmol/L Tris-HCl+0.6 mol/L NaCl, pH 8.0)等度洗脫。流速為1.0 mL/min,檢測波長280 nm。

1.6 吸附等溫線的測定

分別準(zhǔn)確稱取10份20 mg溫敏親和色譜固定相材料于10個2 mL離心管中,隨后依次向其中加入1 mL不同質(zhì)量濃度(0.1～1.0 mg/mL)的γ-球蛋白溶液。將離心管置于不同溫度(10、20、30和40 ℃)的恒溫?fù)u床中以1 000 r/min恒溫振蕩1 h。吸附平衡后,以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,收集上清液。采用Bradford法測定各上清液中γ-球蛋白的含量,依據(jù)下式計算溫敏親和色譜固定相對γ-球蛋白的吸附量:

Qe=(C0-Ce)V/m

式中,C0為初始蛋白含量(mg/mL),Ce為平衡時蛋白含量(mg/mL),V為蛋白溶液總體積(mL),m為所用吸附劑質(zhì)量(g)。

1.7 SDS-PAGE電泳分析

收集色譜餾分,冷凍干燥后,用100 μL去離子水溶解。取15.6 μL樣品溶液于2 mL離心管中,再加入4.4 μL樣品溶解液(不含二硫蘇糖醇),將離心管置于沸水中加熱3 min,冷卻后離心,取上清液上樣10 μL。采用10%分離膠和8%濃縮膠進(jìn)行非還原SDS-PAGE電泳分析,濃縮膠分離電壓為90 V,分離膠分離電壓為180 V。電泳結(jié)束后,采用考馬斯亮藍(lán)染色3～4 h,使用脫色液完全脫色后,利用凝膠成像系統(tǒng)分析γ-球蛋白的含量和純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 嵌段溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的表征

嵌段溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的合成過程如圖1所示。首先將線性溫敏聚合物PNIPAM-CTA與4-VP共聚制備溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]-CTA,然后利用TCEP將三硫酯還原為巰基,再利用“巰-烯”點(diǎn)擊化學(xué)與4-VP反應(yīng),在P[NIPAM-b-4VP]的末端構(gòu)建親和配基MEP,最后將嵌段溫敏親和配體P[NIPAM-b-4VP]-MEP與氨基硅膠反應(yīng),制備得到嵌段共聚溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP。

圖1 嵌段共聚溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的制備流程圖Fig. 1 Scheme of preparation of block copolymer-based temperature-responsive affinity chromatography stationary phase SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP NIPAM: N-isopropylacrylamide; DDTTC: S-1-dodecyl-S′-(1-α′-dimethyl-α″-acetic acid) trithiocarbonate; AIBN: azobisisobutyronitrile; 4-VP: 4-vinyl pyridine; PNIPAM-CTA: poly(N-isopropylacrylamide)-chain transfer agent; P[NIPAM-b-4VP]-CTA: poly[N-isopropylacrylamide-b-4VP]-chain transfer agent; TCEP: tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride; MEP: 4-mercapto-ethylpyridine; EDC: N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; NHS: N-hydroxysuccinimide.

利用GPC測定了溫敏聚合物PNIPAM-CTA和溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]-CTA的分子質(zhì)量,分別為3 148 Da和9 272 Da,后者較前者的分子質(zhì)量增加約6 000 Da,證明PNIPAM與4-VP成功實(shí)現(xiàn)共聚。結(jié)合1H-NMR測試結(jié)果,經(jīng)計算PNIPAM的聚合度m為28, P4VP的聚合度n為56。

分別利用FT-IR和XPS對所制備的嵌段溫敏親和色譜固定相的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。圖2為嵌段溫敏親和配基P[NIPAM-b-4VP]-MEP和溫敏親和固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的FT-IR圖。從圖中可看出,在P[NIPAM-b-4VP]-MEP中,1 640 cm-1處為羰基的特征吸收峰,1 550 cm-1處對應(yīng)的峰是酰胺Ⅱ帶的特征峰,1 495 cm-1和1 398 cm-1處是吡啶基團(tuán)的特征振動峰,表明4-VP成功地與溫敏聚合物PNIPAM共聚為嵌段聚合物。當(dāng)溫敏親和配基通過羰基與硅膠表面的氨基反應(yīng)后,除上述特征峰保留外,在472、807和1 096 cm-1處還出現(xiàn)了Si-O-Si的彎曲和伸縮振動峰,表明嵌段溫敏親和配基已成功鍵合到硅膠表面。

圖2 P[NIPAM-b-4VP]-MEP和SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的FT-IR圖Fig. 2 FT-IR spectra of P[NIPAM-b-4VP]-MEP and SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP

圖3是SiO2、SiO2-NH2和SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的XPS圖。從圖中可以看出,固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP除含有與SiO2-NH2相同的特征峰外,如O 1s(532.2 eV)、N 1s(400.2 eV)、C 1s(283.4 eV)、Si 2p(102.3 eV)和Si 2s(153.2 eV)等,還含有S元素的特征峰S 2s(226.1 eV)和S 2p(164.3 eV)。表1中列出了利用XPS測得的SiO2-NH2、SiO2-PNIPAM-MEP與SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP中各元素的含量。從表1中可以看出,接枝了嵌段溫敏共聚物的固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP中C、O、S、N等元素的含量均高于接枝線性溫敏聚合物的固定相SiO2-PNIPAM-MEP,進(jìn)一步表明PNIPAM與4-VP共聚為嵌段共聚物,且成功接枝到硅膠表面。

表1 SiO2-NH2、SiO2-PNIPAM-MEP和SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的元素分析Table 1 Elemental analysis of SiO2-NH2, SiO2-PNIPAM-MEP and SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP

圖3 SiO2、SiO2-NH2和SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP的XPS圖Fig. 3 XPS spectra of SiO2, SiO2-NH2 and SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP

2.2 溫敏親和色譜固定相對BSA和γ-球蛋白的分離

由于PNIPAM的疏水性會因聚合物的水化和脫水隨外界溫度的變化而變化,因此接枝了溫敏聚合物PNIPAM的溫敏色譜固定相的表面性質(zhì)很容易通過改變柱溫而改變[11]。當(dāng)溫度高于其LCST時,固定相表面由于PNIPAM的脫水卷曲收縮而呈疏水性,相反,當(dāng)溫度低于其LCST時,PNIPAM鏈的伸展水化導(dǎo)致固定相表面呈親水性,因此可通過改變色譜柱的溫度來調(diào)節(jié)分析物與固定相之間的親疏水作用,從而將其分離。我們分別以線性溫敏聚合物PNIPAM和溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]為間隔臂,以MEP為配體,制備了兩種溫敏親和色譜固定相SiO2-PNIPAM-MEP與SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP,將其用于BSA與γ-球蛋白的分離,結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫敏親和色譜對BSA和γ-球蛋白的分離色譜圖Fig. 4 Chromatograms of bovine serum albumin (BSA) and γ-globulin separated with temperature-responsive chromatography The column was equilibrated at 40 ℃ with 100% mobile phase A (50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0) for 30 min, 10 μL of sample was injected and then the pump was stopped after 10 min. Move the column to 5 ℃ water bath for 10 min, and elute it with pre-cooled mobile phase B (50 mmol/L Tris HCl+0.6 mol/L NaCl, pH 8.0) at 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm.

從圖4可以看出,BSA和γ-球蛋白均可在線性溫敏親和色譜固定相SiO2-PNIPAM-MEP上保留,且BSA的保留較γ-球蛋白強(qiáng)。雖然該固定相對二者可實(shí)現(xiàn)基線分離,但對γ-球蛋白的特異選擇性較差。從嵌段溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP對二者的色譜分離圖可以看出,BSA在該固定相上不保留,僅洗脫得到γ-球蛋白一個色譜峰,表明嵌段溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP對γ-球蛋白表現(xiàn)出特異的選擇性,一步純化其質(zhì)量回收率為92.7%。測定了γ-球蛋白在SiO2-PNIPAM-MEP和SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP兩種固定相的平均最大吸附量分別為(43.1±1.3) mg/g和(71.5±2.1) mg/g(n=3),后者較前者對γ-球蛋白的吸附量提高了近1倍。這是由于采用溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]為間隔臂時,P4VP是一種疏水性的線性聚合物鏈,不僅可以調(diào)節(jié)溫敏嵌段共聚物的疏水性,而且在溫度高于PNIPAM的LCST時,PNIPAM發(fā)生脫水卷曲收縮,由于P4VP嵌段的存在,使聚合物末端構(gòu)建的親和配體MEP更容易暴露在外而不被包埋在聚合物內(nèi)部,有助于配基與γ-球蛋白的結(jié)合。此外,P4VP主鏈上有大量的吡啶基,可與γ-球蛋白產(chǎn)生疏水作用力,故能夠提供更多的吸附位點(diǎn)[17,21],因此嵌段共聚溫敏親和色譜固定相對γ-球蛋白具有更高的吸附量。

2.3 溫度的影響

如前所述,溫度可影響溫敏色譜固定相表面的親疏水性,從而影響蛋白質(zhì)在溫敏色譜固定相上的保留與洗脫。本文詳細(xì)研究了不同溫度下嵌段溫敏親和色譜固定相對γ-球蛋白和BSA色譜分離的影響,結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出,采用50 mmol/L Tris-HCl+0.6 mol/L NaCl(pH 8.0)為流動相B液,當(dāng)洗脫溫度為40 ℃時,僅有79.8%的γ-球蛋白被洗脫。隨著溫度的降低,更多的γ-球蛋白被洗脫,色譜峰變得越來越高。當(dāng)溫度降低至5 ℃時,γ-球蛋白的色譜峰變得更尖銳。這表明5 ℃時,溫敏色譜固定相的表面親水性顯著增強(qiáng),有利于蛋白質(zhì)的洗脫,同時,低溫亦使γ-球蛋白與親和配基MEP的結(jié)合常數(shù)減小,更有利于γ-球蛋白的洗脫[19]。此外,還測定了該固定相在10、20、30、40 ℃時對γ-球蛋白的最大吸附量,分別為(6.1±1.4)、(21.1±0.8)、(46.6±1.2)和(71.5±2.1) mg/g(n=3),表明該嵌段溫敏親和色譜固定相對γ-球蛋白的吸附量隨溫度的升高而增大,進(jìn)一步證明高溫更有利于γ-球蛋白吸附,而低溫更有助于γ-球蛋白的洗脫。

圖5 洗脫溫度對γ-球蛋白和BSA色譜分離的影響Fig. 5 Effects of elution temperature on the separation of γ-globulin and BSA The column was equilibrated at 40 ℃ with 100% mobile phase A for 30 min, 10 μL of sample was injected and then the pump was stopped after 10 min. Move the column to water bath at constant temperature for 10 min under different temperature, and elute it with mobile phase B at 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm.

2.4 鹽濃度的影響

親和色譜中,在流動相中添加一定濃度的鹽有利于蛋白質(zhì)的洗脫。我們在流動相B液中添加不同濃度的NaCl,研究了鹽濃度對γ-球蛋白洗脫的影響,結(jié)果如圖6所示。當(dāng)流動相B液中不含NaCl時,無法將γ-球蛋白從溫敏親和色譜固定相上洗脫下來。當(dāng)流動相中添加0.2 mol/L NaCl時,僅有少量γ-球蛋白被洗脫下來。隨著NaCl濃度增大,γ-球蛋白的色譜峰逐漸增高,表明越來越多的γ-球蛋白被洗脫。當(dāng)NaCl的濃度為0.6 mol/L時,γ-球蛋白的回收率達(dá)到了92.7%±1.2%(n=3); NaCl濃度為1.0 mol/L時,其回收率大于95%?？紤]到高鹽濃度對抗體蛋白穩(wěn)定性[22]及后處理的影響,采用溫敏親和色譜分離BSA和γ-球蛋白時,選擇在流動相B液中添加0.6 mol/L的NaCl。

圖6 流動相中NaCl濃度對γ-球蛋白洗脫的影響Fig. 6 Effect of the concentration of NaCl in the mobile phase on γ-globulin elution The column was equilibrated at 40 ℃ with 100% mobile phase A for 30 min, 10 μL of sample was injected and then the pump was stopped after 10 min. Move the column to 5 ℃ water bath for 10 min, and elute it with pre-cooled mobile phase B at 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm.

2.5 應(yīng)用

將嵌段共聚溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP用于人血清中免疫球蛋白lgG的分離純化,在40 ℃進(jìn)樣,5 ℃時進(jìn)行洗脫,分離結(jié)果和電泳分析如圖7所示。由圖7a可以看出,雜蛋白無法在該色譜柱中保留,僅有IgG保留,而且僅通過調(diào)節(jié)溫度和洗脫液中NaCl濃度就可以從血清中純化IgG,如圖7b所示,平行3次純化的IgG的平均純度為97.4%±0.7%(n=3)。

圖7 溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP對人血清中IgG的(a)色譜分離圖及(b)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果 Fig. 7 (a) Chromatogram and (b) SDS-PAGE assay of IgG from human serum with temperature-responsive affinity chromatography stationary phase SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP The column was equilibrated at 40 ℃ with 100% mobile phase A for 30 min, 10 μL of sample was injected and then the pump was stopped after 10 min. Move the column to 5 ℃ water bath for 10 min, and elute it with pre-cooled mobile phase B at 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm. Lane 1: human serum; Lane 2-4: purified IgG in triplicate.

3 結(jié)論

本研究將NIPAM與4-VP共聚以調(diào)節(jié)溫敏嵌段共聚物P[NIPAM-b-4VP]的親疏水性,所制備的嵌段共聚溫敏親和色譜固定相SiO2-P[NIPAM-b-4VP]-MEP不僅對抗體具有特異的選擇性,而且可提供更多的作用位點(diǎn),使抗體的吸附容量提高了1倍。所構(gòu)建的嵌段共聚溫敏親和色譜僅通過調(diào)節(jié)溫度和流動相鹽濃度即可實(shí)現(xiàn)對抗體一步分離純化,操作簡單,綠色環(huán)保,從根本上解決了傳統(tǒng)色譜采用酸性洗脫易使抗體蛋白變性失活的難題。該技術(shù)在抗體藥物的分離純化和工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。