郭朋程 王 婷 童應(yīng)鵬 謝振達(dá) 姜春筱 周 戚 王建新,

(1 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)系,智能化遞藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海,201203; 2 復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院藥物研究所,上海,201203; 3 臺(tái)州學(xué)院,高等研究院天然產(chǎn)物與健康產(chǎn)品研究所,臺(tái)州,318000)

哮喘是一種以氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征的慢性免疫疾病,也是最常見(jiàn)的兒童慢性疾病,對(duì)不同年齡段的人群均有影響,目前,全球約有3億人患有哮喘[1-2]。哮喘的發(fā)病與環(huán)境污染密切相關(guān),研究表明,48%的兒童哮喘與空氣污染有關(guān)[3]。此外,遺傳因素、影響健康的社會(huì)壓力均密切相關(guān),使其發(fā)病率和死亡率均急劇增加,尤其是中低收入的國(guó)家[4]。

維吾爾醫(yī)學(xué)(簡(jiǎn)稱(chēng)“維醫(yī)”)在哮喘的治療上積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),根據(jù)維醫(yī)體液論,哮喘可分為異常黑膽質(zhì)型哮喘、異常黏液質(zhì)型哮喘、異常膽液質(zhì)型哮喘[5]。異常黏液質(zhì)型哮喘患者的臨床表現(xiàn)主要體現(xiàn)為喉中聞及哮鳴有聲、咳痰稀白、不易咯、面色白澤或晦黃、唇色淡白、口不干、胸膈滿(mǎn)悶、大便溏薄,色淡黃氣腥臭、小便清長(zhǎng)舌質(zhì)淡舌形胖,舌涎多,舌苔薄而潤(rùn),或白膩,脈粗緩弱[5]。維醫(yī)認(rèn)為羅歐咳祖帕(LKZP)是治療異常黏液質(zhì)型哮喘的有效方劑,它主要由神香草和鳶尾根組成,具有溫肺平喘、止咳化痰作用[6]。方中神香草為唇形科(Labiatea)硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)干燥全草,可調(diào)節(jié)異常黏液質(zhì),為主藥[7];鳶尾根為鳶尾科(Iridanceae)植物喜堿鳶尾(IrishalophilaPall.)的干燥根莖,在方中主要是協(xié)助神香草清理膿性黏液質(zhì)的作用[8]。藥理學(xué)研究也結(jié)果顯示,神香草和(或)鳶尾根均具有抗哮喘[9]、抗炎[10-11]、調(diào)節(jié)免疫力[12]等活性,但是目前還尚未對(duì)神香草和鳶尾根的組合方劑——LKZP抗哮喘的活性進(jìn)行藥理學(xué)評(píng)價(jià),其抗哮喘作用機(jī)制研究也不深入,為此,本研究首先采用卵蛋白(Ovalbumin,OVA)誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠評(píng)價(jià)了LKZP抗哮喘活性,隨后采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)分析了LKZP治療哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,為后期制劑開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 BALB/c雌性小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào)為SCXK(滬)2018-0004。所有小鼠被置于模擬晝夜變化(12 h白天,12 h黑夜)的清潔室內(nèi),溫度20～24 ℃,濕度50%。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均獲得復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2020華山醫(yī)院JS-675)。

1.1.2 藥物 LKZP提取物由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院制備,制備方法為取神香草250 g和鳶尾根250 g,加入3.6 L水溶液,煎煮2次,1 h/次,然后濃縮至1 000 mL(相當(dāng)于500 g生藥材/1 000 mL),臨用前稀釋成15 g生藥材/kg動(dòng)物重量。陽(yáng)性對(duì)照藥為醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H33020822)。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白(OVA)(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):A5503),氫氧化鋁佐劑(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó),貨號(hào):77161),戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):P3621進(jìn)口分裝),乙酰甲膽堿(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):A2251)。氣道阻力及肺順應(yīng)性測(cè)量系統(tǒng)(FinePointe RC System,Buxco公司,美國(guó),型號(hào):RC),光學(xué)顯微鏡(Nikon公司,日本,型號(hào):ECLIPSE 80i)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 48只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組、模型組、水提組和地塞米松組。模型組、水提組和地塞米松組小鼠于第0天一次性腹腔注射OVA20 μg和氫氧化鋁2 mg的生理鹽水混懸液0.2 mL,使小鼠處于致敏狀態(tài)。分別在第7天、第14天和第21天以相同的方法再加強(qiáng)致敏3次。第25天起每天超聲霧化吸入3%OVA誘發(fā)哮喘約30 min,以小鼠出現(xiàn)呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為模型建立成功的標(biāo)志,連續(xù)7 d。

1.2.2 給藥方法 給藥組小鼠于第24天開(kāi)始灌胃服用相應(yīng)的藥物,每次霧化吸入前30 min給藥,每次灌胃給藥0.3 mL,連續(xù)灌服藥物8 d。

1.2.3 哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性(Airway Hyperresponsiveness,AHR)的測(cè)定 最后一次超聲霧化吸入3%OVA的24 h后,用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,然后采用氣道阻力及肺順應(yīng)性測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量小鼠的氣道阻力。實(shí)驗(yàn)是通過(guò)霧化吸入不同劑量的乙酰甲膽堿(0、3.125、6.25和12.5 mg/mL)以激發(fā)小鼠發(fā)生后的產(chǎn)生的變化,以評(píng)估藥物對(duì)哮喘小鼠AHR的影響,數(shù)據(jù)以與基線值的百分比變化表示。

1.2.4 肺組織病理學(xué)分析 AHR測(cè)定結(jié)束后,迅速取出肺組織,把肺組織周?chē)B接的組織剝離干凈后,在4 ℃生理鹽水中迅速漂洗,去除血漬和污物。將右肺上葉連同右主支氣管置于4%的中性甲醛中浸泡固定,石蠟包埋,用5 μm切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析。肺切片用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,以評(píng)估肺部組織的變化。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照,并對(duì)所得圖像進(jìn)行分析。

1.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的LKZP抗哮喘的活性成分和作用機(jī)制研究

1.3.1 LKZP的化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的收集和整理 通過(guò)檢索國(guó)家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(kù)(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)和web of science等數(shù)據(jù)庫(kù)[13],收集硬尖神香草和喜堿鳶尾的化學(xué)成分[8-9,11,14-21],并采用chemdraw 16.0軟件繪制化合物的結(jié)構(gòu)式,整理成SMILES格式;將所有化合物導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch/),篩選出符合Lipinski規(guī)則的化合物,再通過(guò)SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)上述化合物的作用靶點(diǎn)。

1.3.2 LKZP抗哮喘的作用靶點(diǎn) 以“asthma”為關(guān)鍵詞,分別檢索在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,(https://www.omim.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)的與哮喘相關(guān)的基因[22-26],然后通過(guò)交集分析,確定LKZP作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集,上述交集靶點(diǎn)被認(rèn)為是LKZP治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。

1.3.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)[27],物種選擇為“homo sapiens”,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),將最小互作值設(shè)定為high confidence(0.7),同時(shí)隱藏了網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有連接的節(jié)點(diǎn),PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果以tsv數(shù)據(jù)格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中,進(jìn)行拓?fù)浞治?以Degree值大于中位數(shù)2倍的靶點(diǎn)作為L(zhǎng)KZP治療哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3.4 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 采用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對(duì)LKZP治療哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路的富集分析[28],采用Prism 7軟件繪制GO功能柱狀圖,采用聯(lián)川生物云分析平臺(tái)(https://www.omicstudio.cn/tool/11)繪制KEGG氣泡圖。

1.3.5 活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.2軟件[29],以LKZP化學(xué)成分、抗哮喘作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路為節(jié)點(diǎn),將化合物及其作用的抗哮喘疾病靶點(diǎn)以及抗哮喘作用靶點(diǎn)與其富集的KEGG信號(hào)通路分別以邊相連接;若化合物的作用靶點(diǎn)富集到某一信號(hào)通路中,則將化合物與該信號(hào)通路也以邊相連接,構(gòu)建出LKZP抗哮喘活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)。再利用Analyze Network工具對(duì)上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,將化合物、靶點(diǎn)和信號(hào)通路三類(lèi)節(jié)點(diǎn)中,Degree值排名前10的節(jié)點(diǎn)提取出來(lái),構(gòu)建出LKZP抗哮喘的核心網(wǎng)絡(luò),從而確定其抗哮喘關(guān)鍵活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路。

1.4 分子對(duì)接研究 依據(jù)1.3項(xiàng)下LKZP抗哮喘活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果,使用ChemOffice 2014軟件繪制關(guān)鍵活性成分的結(jié)構(gòu)并使其能量最小化,保存為mol2格式;接著從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的PDB格式數(shù)據(jù),采用Pymol軟件完成去水和去掉配體等操作;然后采用AutoDock Tools 1.5.6軟件將關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的格式都轉(zhuǎn)換為pdbqt格式;最后采用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接,采用Pymol軟件進(jìn)行可視化操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 LKZP對(duì)哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的影響 如圖1所示,隨著乙酰甲膽堿劑量的增加,短期OVA致敏和激發(fā)能夠明顯增加小鼠氣道阻力,在12.5 mg/mL乙酰甲膽堿劑量下,小鼠氣道阻力(P<0.01)增加尤為顯著。與哮喘模型組比較,水提組能顯著降低氣道阻力。隨著乙酰甲膽堿劑量增加,降低氣道阻力的作用越明顯(P<0.05),且與陽(yáng)性對(duì)照藥物地塞米松組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 LKZP對(duì)哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的影響

2.2 LKZP不同提取物對(duì)哮喘小鼠肺組織病變的影響 肺部病理學(xué)結(jié)果顯示,正常組中肺組織支氣管結(jié)構(gòu)、輪廓相對(duì)完整。與正常小鼠比較,OVA激發(fā)引起大量炎癥細(xì)胞向支氣管周?chē)?rùn),OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺部有大量黏液分泌,炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn),基底膜顯著增厚,氣管平滑肌明顯增厚,肺組織結(jié)構(gòu)被破壞。LKZP水提取物干預(yù)顯著降低支氣管和血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn),緩解氣道的損傷,改善平滑肌的增厚。見(jiàn)圖2。

圖2 LKZP對(duì)哮喘小鼠肺組織病理學(xué)的影響(HE染色,×200)

2.3 LKZP抗哮喘網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果

2.3.1 LKZP潛在活性成分和潛在靶點(diǎn) LKZP中符合Lipinski規(guī)則的化合物共有136個(gè),其中硬尖神香草和喜堿鳶尾根的成分分別有53個(gè)和83個(gè)。在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得上述成分的無(wú)重復(fù)作用靶點(diǎn)共841個(gè)。

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 通過(guò)LKZP作用靶點(diǎn)與哮喘疾病靶點(diǎn)的交集分析,共獲得312個(gè)交集靶點(diǎn)。在由STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.8.2軟件繪制的PPI網(wǎng)絡(luò)中,共含有297個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 457條邊,節(jié)點(diǎn)Degree值的中位數(shù)為12,其中Degree值>24的核心靶點(diǎn)共66個(gè)。

2.3.3 核心靶點(diǎn)的GO功能富集及KEGG通路富集分析 依據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)66個(gè)核心靶點(diǎn)的GO功能和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)共有391個(gè)GO條目(P<0.05),其中生物過(guò)程(Biological Process,BP),細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)的條目分別有298、32和61條,分別占條目總數(shù)的76.21%,8.18%和15.60%。見(jiàn)圖3A。每組前10個(gè)條目的GO富集分析條形圖見(jiàn)圖3B(按照P值從小到大排列)。由此可見(jiàn),LKZP的核心靶點(diǎn)主要參與了胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控(Positive Regulation of Cytosolic Calcium Ion Concentration)、血小板活化(Platelet Activation)、炎癥反應(yīng)(Inflammatory Response)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控(Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process)、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控(Regulation of Phosphatidylinositol 3-kinase Signaling)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive Regulation of Transcription from RNA PolymeraseⅡ Promoter)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控(Positive Regulation of Smooth Muscle Cell Proliferation)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控(Positive Regulation of ERK1 and ERK2 Cascade)、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Phosphatidylinositol-mediated Signaling)和脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路(Lipopolysaccharide-mediated Signaling Pathway)等生物過(guò)程。細(xì)胞組分主要涉及質(zhì)膜(Plasma Membrane)、質(zhì)膜的組成部分(Integral Component of Plasma Membrane)、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物(Phosphatidylinositol 3-kinase Complex)、細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasml)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(Protein Complex)等方面。分子功能主要與蛋白磷酸酶結(jié)合(Protein Phosphatase Binding)、酶結(jié)合(Enzyme Binding)、相同蛋白結(jié)合(Identical Protein Binding)、蛋白結(jié)合(Protein Binding)、磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸3-激酶活性(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase Activity)等有關(guān)。

圖3 LKZP作用靶點(diǎn)的GO功能分析

共富集得到了119條信號(hào)通路(P<0.05),其中有39條信號(hào)通路的P<1×10-9。在上述39條信號(hào)通路中,有16條與疾病相關(guān)的途徑,又分為癌癥和微生物感染性疾病等2大類(lèi)。見(jiàn)圖4A。在非疾病信號(hào)通路中。見(jiàn)圖4B。有12條信號(hào)通路是與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān),包括PI3K-AKT信號(hào)通路(PI3K-AKT Signaling Pathway,hsa04151)、FcεRI信號(hào)通路(Fc Epsilon RI Signaling Pathway,hsa04664)、TNF信號(hào)通路(TNF Signaling Pathway,hsa04668)、ErbB信號(hào)通路(ErbB Signaling Pathway,hsa04012)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like Receptor Signaling Pathway,hsa04620)、催乳素信號(hào)通路(Prolactin Signaling Pathway,hsa04917)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell Receptor Signaling Pathway,hsa04660)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(Natural Killer Cell Mediated Cytotoxicity,hsa04650)、趨化因子信號(hào)通路(Chemokine Signaling Pathway,hsa04062)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(Leukocyte Transendothelial Migration,hsa04670)、Jak-STAT信號(hào)通路(Jak-STAT Signaling Pathway,hsa04630)和B細(xì)胞受體信號(hào)通路(B Cell Receptor Signaling Pathway,hsa04662)等。有3條信號(hào)通路是與調(diào)節(jié)支氣管血管有關(guān)的,包括HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 Signaling Pathway,hsa04066)、VEGF信號(hào)通路(VEGF Signaling Pathway,hsa04370)和鈣信號(hào)通路(Calcium Signaling Pathway,hsa04020)。剩余的8條信號(hào)通路,包括鞘脂信號(hào)通路(Sphingolipid Signaling Pathway,hsa04071)、破骨細(xì)胞分化(Osteoclast Differentiation,hsa04380)、FoxO信號(hào)通路(FoxO Signaling Pathway,hsa04068)、甲狀腺激素信號(hào)通路(Thyroid Hormone Signaling Pathway,hsa04919)、黏著斑(Focal Adhesion,hsa04510)、雌激素信號(hào)通路(Estrogen Signaling Pathway,hsa04915)、mTOR信號(hào)通路(mTOR Signaling Pathway,hsa04150)和胰島素抵抗(Insulin Resistance,hsa04931)等。

圖4 LKZP核心靶點(diǎn)富集的KEGG信號(hào)通路

2.3.4 活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的分析 在構(gòu)建的LKZP抗哮喘的“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的網(wǎng)絡(luò)中(圖5A),共包含了120個(gè)化合物(綠色和黃色節(jié)點(diǎn)分別代表來(lái)源于硬尖神香草和喜堿鳶尾的化學(xué)成分)、66個(gè)核心靶點(diǎn)(藍(lán)色節(jié)點(diǎn))及其富集到的119條信號(hào)通路(紅色節(jié)點(diǎn)),上述3類(lèi)節(jié)點(diǎn)的中位數(shù)Degree值分別為80、25和76,說(shuō)明LKZP中很多化合物可以干預(yù)多個(gè)作用靶點(diǎn),從而作用于多條信號(hào)通路。而在LKZP抗哮喘“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的核心網(wǎng)絡(luò)中(圖5B),化合物、靶點(diǎn)和信號(hào)通路等三類(lèi)節(jié)點(diǎn)的平均Degree值可達(dá)到118.5、79.9和117.2,均遠(yuǎn)高于Degree中位數(shù)值,因此,這些靶點(diǎn)是LKZP抗哮喘作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵樞紐。

圖5 LKZP化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)(A)及其核心網(wǎng)絡(luò)(B)

從圖5B和表1中也可知,LKZP可能主要通過(guò)作用于MAPK1、EGFR、MAPK3、PIK3CA、AKT1、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PRKCA、ESR1等關(guān)鍵靶標(biāo)發(fā)揮治療哮喘的作用。其中MAPK1和MAPK3為編碼細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK),PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3R1均編碼磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K),EGFR、AKT1、PRKCA和ESR1分別編碼表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白(EGFR)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、蛋白激酶C alpha(PKCα)和雌激素受體1(ESR1)。

表1 LKZP抗哮喘的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路

LKZP作用的關(guān)鍵信號(hào)通路包括HIF-1信號(hào)通路(hsa04066)、VEGF信號(hào)通路(hsa04370)、鈣信號(hào)通路(hsa04020)、PI3K-AKT信號(hào)通路(hsa04151)、ErbB信號(hào)通路(hsa04012)、甲狀腺激素信號(hào)通路(hsa04919)、黏著斑(hsa04510)、雌激素信號(hào)通路(hsa04915)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway,hsa04015)、催產(chǎn)素信號(hào)通路(Oxytocin signaling pathway,hsa04921)。這些信號(hào)通路基本和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和支氣管血管有關(guān)。

按照化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi),LKZP中治療哮喘的關(guān)鍵活性成分可以分為3大類(lèi)。見(jiàn)表1和圖6。分別為萜類(lèi),共計(jì)6種,包括(7S,10R)-11-hydroxy-4,5-seco-guai-1-ene-4-one(S15)、desacetylmatricarin(S36)、(4aR,5R)-6-hydroxy-4a,5-dimethyl-3-(prop-1-en-2-yl)-3,4,4a,5,6,7-hexahydronaphthalen-1(2H)-one(S8)、Hyssopusin A(S17)、eudesmane-1β,5α,11-triol(S4)和Cryptomeridiol(S6);苯丙素類(lèi)成分2種,包括Caffeic Acid(S92,Y11)和(+)-isolariciresinol(S43);黃酮類(lèi)成分2種,分別為5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78)和Naringenin(Y36)。其中來(lái)源于神香草和鳶尾根的活性成分分別有8種和3種,二者共有成分有1種,為Caffeic Acid。

圖6 LKZP治療哮喘潛在的關(guān)鍵活性成分

2.4 分子對(duì)接分析 將LKZP抗哮喘的7個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)蛋白ESR1(1A52)、EGFR(1M17)、AKT1(1UNQ)、MAPK1(2Y9Q)、PIK3CA(4JPS)、MAPK3(4QTB)和PIK3CD(5DXU)與前10種關(guān)鍵活性成分進(jìn)行了分子對(duì)接。從表2可知,僅AKT1與Hyssopusin A(S17)、Caffeic Acid(S92,Y11)之間的結(jié)合能>-5 kcal/mol;結(jié)合能<-7 kcal/mol(1 cal=4.184 J)的有43組,占總數(shù)的61.42%。并且有5組之間的結(jié)合能<-9.0 kcal/mol,分別為MAPK1與Desacetylmatricarin(S36)、5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78),MAPK3與Desacetylmatricarin(S36)、5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78)、Naringenin(Y36),二者的共有高結(jié)合能成分為Desacetylmatricarin(S36)、5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78),其與MAPK1和MAPK3的結(jié)合模式見(jiàn)圖7。其中MAPK1與Desacetylmatricarin結(jié)合的氨基酸殘基為L(zhǎng)YS-54 GLN-105和LYS-114,MAPK1與5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone結(jié)合的氨基酸殘基為L(zhǎng)YS-54和MET-108,二者相同的氨基酸殘基為L(zhǎng)YS-54;MAPK3與desacetylmatricarin和5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone則沒(méi)有相同的氨基酸殘基。

表2 LKZP抗哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分之間的結(jié)合能

圖7 LKZP抗哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分分子對(duì)接可視化

3 討論

哮喘是由多種氣道炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,在臨床治療上,藥物首先需要抑制炎癥細(xì)胞活化和介導(dǎo)產(chǎn)生抗炎因子,以減輕氣道炎癥反應(yīng),緩解哮喘癥狀。實(shí)驗(yàn)中LKZP水提組能顯著降低氣道阻力,同時(shí)病理結(jié)果LKZP水提組中OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺部有大量黏液分泌,炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),基底膜顯著增厚,氣管平滑肌明顯增厚,肺組織結(jié)構(gòu)被破壞的情況具有改善作用。本研究發(fā)現(xiàn),LKZP治療哮喘的排前10位關(guān)鍵靶點(diǎn)中,至少有8個(gè)靶點(diǎn)是參與介導(dǎo)了炎癥反應(yīng),包括MAPK、PI3K、AKT、PKC等,它們可能主要參與介導(dǎo)HIF-1信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的通路。在LKZP治療哮喘的潛在活性成分中,有6種倍半萜類(lèi)成分(S15,S36,S8,S17,S4和S6),這些成分均來(lái)源于神香草,已有研究表明,神香草中的倍半萜類(lèi)成分能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放[19]。此外,黃酮類(lèi)成分也能減輕氣道炎癥反應(yīng),如周旋等[30]利用OVA誘導(dǎo)建立哮喘大鼠模型發(fā)現(xiàn)柚皮素(Y36)能顯著性降低哮喘大鼠的氣道炎癥反應(yīng)。

氣道重塑也是哮喘的重要病理機(jī)制之一,它與氣道炎癥在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起同樣重要的作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Intracellular Ca2+)可以調(diào)控氣道平滑肌的收縮,影響氣道平滑肌管徑大小和氣道阻力大小,對(duì)氣道重塑發(fā)揮重要作用[31]。有研究表明,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放相應(yīng)的因子導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖是氣道重塑的前提條件[32]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)可調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá),因此也被認(rèn)為參與了哮喘的氣道重塑[32]。本研究發(fā)現(xiàn),LKZP的化學(xué)成分可能可以通過(guò)同時(shí)調(diào)控鈣信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路等發(fā)揮調(diào)控氣道重塑的作用的。很多黃酮類(lèi)成分都可以通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子水平,舒張血管平滑肌[33]。

此外,LKZP還可能通過(guò)作用于雌激素信號(hào)通路發(fā)揮治療哮喘的作用,目前發(fā)現(xiàn)女性哮喘患者的臨床癥狀更各生命階段(青春期、月經(jīng)期、懷孕和更年期)有關(guān),推測(cè)哮喘可能與雌激素密切相關(guān)[34]。而雌激素有可能是通過(guò)干預(yù)核因子κB/NLRP3信號(hào)通路減輕氣道炎癥,從而緩解哮喘癥狀的[35]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對(duì)維藥LKZP治療哮喘的潛在活性成分和作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LKZP中的倍半萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和苯丙素類(lèi)成分可能是其治療哮喘的主要活性成分,它們主要通過(guò)調(diào)節(jié)氣道炎癥和氣道重塑發(fā)揮哮喘的治療作用。

利益沖突聲明:無(wú)。