周謙 孟寧 劉晟楠 郝向東

胃癌(gastric cancer,GC)是消化道常見惡性腫瘤[1]。早期治療方法以手術(shù)為主,但大多數(shù)病人被發(fā)現(xiàn)時為晚期,術(shù)后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差[2]。尋找可準(zhǔn)確進(jìn)行病情及預(yù)后評估的標(biāo)志物具有重要價值?？坩樀鞍?(fibulin 5,FBLN5)是一種胞外基質(zhì)糖蛋白,與多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、血管修復(fù)等密切相關(guān)[3]。Rho GTPase激活蛋白4(Rho GTPase activating protein 4,ARHGAP4)是Rho GAP家族成員,其作為腫瘤抑制因子在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[4-5]。研究檢測并比較胃癌病人中ARHGAP4、FBLN5的表達(dá),探討二者對預(yù)后的影響。

對象與方法

一、對象

2013年12月～2018年12月我院收治的胃癌病人100例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷符合《CSCO原發(fā)胃癌診療指南(2017 版)》中胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)均在我院進(jìn)行手術(shù)治療;(3)手術(shù)后均經(jīng)過臨床病理證實(shí);(4)未進(jìn)行放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有其他惡性腫瘤;預(yù)計生存期<6個月;臨床資料不完整。

二、方法

1.標(biāo)本采集和處理:收集病人胃癌組織及>5 cm癌旁組織于液氮中保存,迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存,待測。

2.臨床資料收集:包括病人年齡、性別、臨床病理特征;血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖類抗原(carbohydrate antigen,CA)19-9、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)水平。CEA、CA19-9和CA125的臨界值分別為5 ng/ml、39 U/ml、35 U/ml。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

3.免疫組織化學(xué)法:免疫組化分析采用EnVision兩步法進(jìn)行。染色結(jié)果進(jìn)行病理圖像分析。采用半定量方法,≤3分為陰性,>3分為陽性。CD3+T、CD8+T陽性結(jié)果判讀采用細(xì)胞計數(shù)法,先在低倍鏡下觀察整張切片,分別尋找具有代表性的腫瘤中心及侵襲性邊緣陽性淋巴細(xì)胞浸潤密度較高處進(jìn)行觀察,高倍視野內(nèi)分別計數(shù)CD3+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目,并計算該切片內(nèi)不同區(qū)域內(nèi)的平均著色細(xì)胞數(shù)目作為該例CD3+T、CD8+T均值,以所有切片CD3+T、CD8+T陽性細(xì)胞數(shù)目的均數(shù)為基準(zhǔn),大于該計數(shù)值即為陽性表達(dá)記1分,低于該計數(shù)值即為陰性表達(dá)記0分,將2個區(qū)域內(nèi)的免疫浸潤細(xì)胞分別評分并計入總分,可以得到I0、I1、I2、I3、I4五個不同免疫評分值,I0～I(xiàn)2定義為低免疫評分,I3～I(xiàn)4定義為高免疫評分。

4.胃癌組織及癌旁正常組織中FBLN5、ARHGAP4 mRNA表達(dá)檢測:TRIzol法提取組織總RNA,分光光度儀檢測RNA濃度后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用ABI 7500型PCR儀實(shí)時熒光定量檢測組織中FBLN5、ARHGAP4 mRNA相對表達(dá)水平,采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。FBLN5、ARHGAP4及內(nèi)參引物序列見表1。

5.隨訪:所有病人自術(shù)后開始定期隨訪(門診或電話),觀察病人的生存時間和生存率。病人均隨訪3年,隨訪終點(diǎn)為病人死亡或至隨訪截止時間。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1.胃癌組織中ARHGAP4、FBLN5的表達(dá)比較:ARHGAP4的陽性表達(dá)率為18.00%,低于癌旁組織的83.00%;FBLN5的陽性表達(dá)率為70.00%,高于癌旁組織的22.00%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.胃癌組織及癌旁正常組織中FBLN5、ARHGAP4 mRNA表達(dá)水平比較:胃癌組織中FBLN5 mRNA表達(dá)水平為(2.52±0.51),癌旁正常組織為(1.01±0.23);ARHGAP4 mRNA表達(dá)水平為(0.65±0.17),癌旁正常組織為(1.02±0.14),兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.ARHGAP4、FBLN5與胃癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系:ARHGAP4表達(dá)與腫瘤部位、Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度顯著相關(guān)(P<0.05);FBLN5、與TNM分期、Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、CEA、CA19-9、CA125、免疫評分有關(guān)(P<0.05)。見表2。

4.Kaplan-Meier生存分析:本研究100例病人中,共有88例病人完成3年隨訪,末次隨訪日期2019年5月。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,FBLN5高表達(dá)組病人3年累積生存率為57.53%(42/73),低于低表達(dá)組病人的86.67%(13/15)(Log rank χ2=4.040,P=0.044);ARHGAP4高表達(dá)組病人3年累積生存率80.00%(20/25),高于低表達(dá)組病人的55.55%(35/63)(Log rank χ2=5.294,P=0.021)。

表2 ARHGAP4、FBLN5與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

5.影響胃癌病人生存狀況的單因素分析:根據(jù)隨訪結(jié)果統(tǒng)計,胃癌病人總的1年、3年生存率分別為79.55%和62.50%。單因素分析結(jié)果顯示,FBLN5和ARHGAP4表達(dá)、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、TNM分期、CEA、CA19-9、CA125、免疫評分均是影響病人預(yù)后的因素(P<0.05)。

6.影響胃癌病人生存狀況的Cox回歸分析:以是否死亡為因變量,以單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素為自變量進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、FBLN5陽性、CEA>5 ng/ml、CA19-9>39 u/ml、CA125>35 u/ml、高免疫評分是影響胃癌病人生存狀況的危險因素(OR分別為2.335、1.455、2.967、2.302、7.111、6.993、7.548、5.678;95%CI分別為1.151～4.738、1.037～2.042、1.079～8.157、1.095～4.839、2.084～24.266、2.079～23.524、1.269～44.907、1.123～28.704;P<0.05)。ARHGAP4高表達(dá)是胃癌病人生存狀況的保護(hù)因素(OR:0.516,95%CI:0.281～0.947;P<0.05),FBLN5高表達(dá)是胃癌病人生存狀況的危險因素(OR:2.302,95%CI:1.095～4.839)。見表3。

表3 多因素Cox回歸分析胃癌病人生存狀況的影響因素

討論

FBLN5是一種纖維蛋白,可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力[7]。有研究表明,FBLN5在前列腺癌、肺癌中作為一個抑癌基因發(fā)揮作用[8-9]。FBLN5在鼻咽癌、乳腺癌及胃癌中發(fā)揮促癌基因作用[10-11]。在本研究中,胃癌組織中FBLN5表達(dá)升高,與文獻(xiàn)報道相一致[11],表明FBLN5在胃癌中發(fā)揮促癌基因作用,與疾病關(guān)系密切,對胃癌的預(yù)防具有重要參考價值;與胃癌病人的臨床病理特征相關(guān)性分析表明,FBLN5與TNM分期、Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤直徑有關(guān),提示FBLN5與胃癌的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。FBLN5低表達(dá)病人3年累積生存率高于高表達(dá)病人,FBLN5可能通過影響或調(diào)控某個促癌基因的表達(dá),從而影響病人預(yù)后,提示FBLN5可作為預(yù)測胃癌病人預(yù)后的潛在指標(biāo)。

ARHGAP4可通過催化活性GTP結(jié)合態(tài)向無活性GTP結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化,從而發(fā)揮其功能[12],并參與抑制多種細(xì)胞過程,如基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等[13]。有研究發(fā)現(xiàn),ARHGAP4在肝癌組織中表達(dá)升高,可通過正向調(diào)控己糖激酶2的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長[14]。胃癌組織中ARHGAP4表達(dá)較癌旁組織降低,提示ARHGAP4在胃癌發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用。ARHGAP4表達(dá)與腫瘤部位、TNM分期、Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān),提示ARHGAP4可為病情評估提供參考依據(jù)。胃癌組織中ARHGAP4表達(dá)降低,其抑制腫瘤細(xì)胞活性的能力下降,間接促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增值及遷移,從而影響疾病發(fā)展進(jìn)程;生存分析結(jié)果顯示,ARHGAP4高表達(dá)組病人3年累積生存率顯著高于低表達(dá)組,可見ARHGAP4表達(dá)與胃癌病人預(yù)后關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、FBLN5、ARHGAP4、CEA>5 ng/ml、CA19-9>39 u/ml、CA125>35 u/ml、高免疫評分均是影響胃癌病人預(yù)后的因素,進(jìn)一步證明FBLN5、ARHGAP4在胃癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,胃癌組織中FBLN5高表達(dá),ARHGAP4呈低表達(dá),二者共同參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,均是影響胃癌生存狀況的因素,聯(lián)合檢測二者在胃癌病人中的表達(dá)可為臨床胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供指導(dǎo)。二者在胃癌中的具體作用機(jī)制還不明確,其結(jié)果需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行驗證。