朱瑞伍, 郭曉杰, 張 慶

(河南省第二人民醫(yī)院 新生兒重癥監(jiān)護室, 河南 鄭州, 450000)

缺氧缺血性腦病(HIE)屬腦損傷疾病,是因嬰兒出生時含氧血液流向大腦受阻所致,可引起血腦屏障通透性受損、能量衰竭、細胞離子穩(wěn)態(tài)喪失、酸中毒、興奮性中毒、自由基介導的毒性、生長因子缺乏等多種病理生理學機制,導致新生兒出現(xiàn)各種急性和慢性癥狀,產(chǎn)生嚴重的后遺癥,甚至死亡[1-2]。HIE是全球新生兒腦損傷的主要原因,且早產(chǎn)兒HIE的發(fā)病率顯著高于足月兒[3]。輕度HIE可能發(fā)育正常,僅有輕度腦發(fā)育延遲或者腦損傷可以完全恢復,重度HIE有60%的死亡風險,幾乎所有的幸存者都會出現(xiàn)殘疾[4]。目前,在HIE早產(chǎn)兒的病情判斷方面,仍缺乏有效的生物學標志物。微小核糖核酸(miRNAs)具有高度的序列保守性、表達時機和組織特異性,其表達失調(diào)已被證明是多種疾病診斷和預后的生物標志物[5]。微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)是研究比較多的miRNA, 其參與持續(xù)增殖信號的調(diào)節(jié)、免疫生長抑制、侵襲性和轉(zhuǎn)移性激活、血管生成能力、抵抗細胞死亡、避免免疫損傷等多種生理機制,與呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、癌癥、腦卒中等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6-7]。微小RNA-128-3p(miR-128-3p)是miRNA的重要成員,與增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等多種細胞內(nèi)生物學過程相關。研究[8]表明miR-20a-5p、miR-128-3p均可影響神經(jīng)元分化因子的表達,與腦損傷相關。本研究檢測HIE早產(chǎn)兒血清中miR-20a-5p、miR-128-3p的表達水平,分析其與腦神經(jīng)發(fā)育的相關性,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年6月—2022年6月在河南省第二人民醫(yī)院分娩的95例HIE早產(chǎn)兒為HIE組,其中男53例,女42例; 分娩方式為順產(chǎn)34例,剖宮產(chǎn)61例; 胎齡31～36周,平均(33.37±2.23)周; 出生體質(zhì)量1 504～2 480 g, 平均(2 058.57±187.56) g。根據(jù)HIE早產(chǎn)兒病情嚴重程度[9], 將其分為輕度組(n=27)、中度組(n=46)和重度組(n=22)。納入標準: ① 符合HIE相關診斷標準者[9]; ② 胎齡<37周者; ③ 早產(chǎn)兒臨床資料完整; ④ 早產(chǎn)兒家屬詳知此項研究內(nèi)容,并自愿簽署同意書。排除標準: ① 先天畸形者; ② 先天性疾病以及外傷引起的腦損傷者; ③ 出生即存在嚴重疾病而無法存活者; ④ 急性及慢性感染性疾病者; ⑤ 肝、腎等臟器功能嚴重障礙者。本研究遵循《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。另選取同期95例無HIE早產(chǎn)兒作為對照組,其中男42例,女53例; 分娩方式為順產(chǎn)31例,剖宮產(chǎn)64例; 胎齡31～36周,平均(33.58±2.35)周; 出生體質(zhì)量1 720～2 507 g, 平均(2 064.33±177.65) g。2組性別、分娩方式、胎齡、出生體質(zhì)量等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.5), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集: HIE患兒在出生后3、14 d, 對照組在出生后3 d, 空腹采血3～5 mL收集于干燥試管中,離心半徑為12 cm, 時間為10 min, 分離血清后放入-20 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.2 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平檢測: 采用RNA提取試劑盒(上海生工生物有限公司)提取血清樣品總RNA, 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司),按其說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測血清中miR-20a-5p、miR-128-3p的相對表達量。根據(jù)ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書配置反應體系。反應程序為: 95 ℃預變性5 min, 95 ℃變性10 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s, 40個循環(huán)。在ABI 7500 Fast系統(tǒng)上進行qRT-PCR。以U6作為內(nèi)參,根據(jù)2-△△Ct計算miR-20a-5p、miR-128-3p基因的相對表達量。基因引物經(jīng)設計軟件設計后由上海生工生物工程有限公司合成,見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Apgar評分: 矯正胎齡40周后3、14 d, 從一般反應、原始反射等5個方面對早產(chǎn)兒進行新生兒神經(jīng)行為測定評分法(NBNA)評定[10], 從呼吸、心率等5個方面對早產(chǎn)兒進行出生5 min Apgar評分[11]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 HIE組與對照組血清miR-20a-5p、miR-128-3p、Apgar評分、NBNA評分比較

出生3 d時,與對照組相比, HIE組血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平升高, NBNA評分、Apgar評分降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 2組血清miR-20a-5p、miR-128-3p、Apgar評分、NBNA評分比較

2.2 不同胎齡早產(chǎn)兒出生3 d血清miR-20a-5p、miR-28-3p水平比較

不同胎齡的HIE組患兒出生3 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 不同胎齡的患兒出生3 d血清miR-20a-5p、miR-28-3p水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同胎齡的早產(chǎn)兒出生3 d血清miR-20a-5p、miR-28-3p水平比較

2.3 不同嚴重程度HIE早產(chǎn)兒血清miR-20a-5p、miR-128-3p、Apgar評分、NBNA評分比較

出生3 d時,重度組血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平高于中度組、輕度組, NBNA評分、Apgar評分低于中度組、輕度組; 中度組血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平高于輕度組, NBNA評分、Apgar評分低于輕度組; 上述指標的組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同嚴重程度HIE早產(chǎn)兒血清miR-20a-5p、miR-128-3p、NBNA評分、Apgar評分比較

2.4 出生后3 d與出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p、NBNA評分比較

HIE早產(chǎn)兒出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p低于出生后3 d, NBNA評分高于出生后3 d, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 HIE早產(chǎn)兒出生后3 d與出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p、NBNA評分比較

2.5 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平與Apgar評分、NBNA評分的相關性

Spearman分析結(jié)果顯示,出生后3 d時, HIE患兒血清miR-20a-5p水平與Apgar評分呈負相關(r=-0.659,P<0.001), 血清miR-128-3p水平與Apgar評分呈負相關(r=-0.582,P<0.001); HIE患兒血清miR-20a-5p水平與NBNA評分呈負相關(r=-0.548,P<0.001), 血清miR-128-3p水平與NBNA評分呈負相關(r=-0.499,P<0.001)。

2.6 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平對早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的預測價值

出生3 d時,血清miR-20a-5p預測早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的曲線下面積(AUC)為0.854, 血清miR-128-3p預測早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的AUC為0.786, 二者聯(lián)合預測早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的AUC為0.920。二者聯(lián)合預測早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的價值優(yōu)于miR-20a-5p、miR-128-3p單獨預測(P<0.05), 見表6、圖1。

表6 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平對早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的預測價值

3 討 論

由嬰兒大腦缺氧引起的HIE是全球新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率和病死率升高的主要原因之一,圍產(chǎn)期窒息幾乎可以影響所有器官[12]。全世界每年約有75萬例嬰兒患有中度或重度HIE, 導致約40萬例嬰兒出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙[13]。孕24～40周時,胎腦發(fā)育迅速,易受到缺氧缺血、炎癥、自由基、興奮性毒性等損傷,因此早產(chǎn)兒更容易發(fā)生HIE[14]。目前HIE腦損傷的分子機制和途徑在很大程度上仍不清楚,而且中度及重度HIE治療難、預后差,這使得HIE的診斷和治療至關重要[15]。

miRNA是重要的調(diào)節(jié)因子,在細胞增殖、分化、遷移、分泌和凋亡等不同生理條件下發(fā)揮著關鍵作用[16]。miR-20a-5p和miR-128-3p都屬于miRNA家族,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。QI Y等[17]發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p在肝細胞癌中表達上調(diào),通過參與調(diào)節(jié)肝細胞癌腫瘤微環(huán)境來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。LIU J Z等[18]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞軟骨分化過程中miR-20a-5p基因表達上調(diào),靶向成纖維細胞生長因子促進骨關節(jié)炎中的軟骨細胞凋亡、增殖和炎癥。ZHU M S等[19]發(fā)現(xiàn)miR-128-3p在骨肉瘤細胞中起致癌基因的作用,可作為骨肉瘤臨床和預后重要的生物標志物和治療靶點。YANG P等[20]發(fā)現(xiàn)miR-128-3p可通過靶向脂多糖調(diào)控細胞凋亡和炎癥反應,可能為膿毒癥的治療提供策略。本研究結(jié)果顯示, miR-20a-5p、miR-128-3p在HIE早產(chǎn)兒中表達上調(diào),輕度組、中度組、重度組血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平依次升高,早產(chǎn)兒出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p低于出生后3 d, 提示miR-20a-5p、miR-128-3p可能與HIE早產(chǎn)兒的發(fā)病機制、病情嚴重程度和發(fā)展密切相關,有望成為HIE早產(chǎn)兒診斷以及病情嚴重程度判斷的潛在標志物。BAI B等[21]發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p和miR-155-5p可能通過影響下游基因的表達潛在影響細胞凋亡和痛風的發(fā)生發(fā)展。ROC曲線顯示, miR-20a-5p、miR-128-3p二者聯(lián)合預測早產(chǎn)兒發(fā)生HIE的價值優(yōu)于各自單獨預測。

Apgar評分是常用的評估新生兒呼吸功能的指標, NBNA評分是常用的評估新生兒神經(jīng)發(fā)育的指標[22]。陳曉玲等[23]發(fā)現(xiàn), HIE組患兒的Apgar評分、NBNA評分顯著低于對照組。本研究發(fā)現(xiàn), HIE早產(chǎn)兒Apgar評分、出生3 d的NBNA評分低于對照組; 輕度組、中度組、重度組Apgar評分、NBNA評分依次降低; 早產(chǎn)兒出生后14 d的NBNA評分顯著高于出生后3 d; Spearman分析結(jié)果顯示,出生3 d時, HIE患兒血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平分別與Apgar評分、NBNA評分呈顯著負相關,提示HIE早產(chǎn)兒血清miR-20a-5p和miR-128-3p水平與腦神經(jīng)發(fā)育密切相關?？傊? HIE早產(chǎn)兒血清miR-20a-5p、miR-128-3p表達升高,二者聯(lián)合檢測可較好地判斷早產(chǎn)兒HIE的發(fā)生。