顧亞琴，丁勁峰，陳金娥，謝文娜，肖林霞

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,鹽城 224002）

所有活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)都含有胞內(nèi)細(xì)胞器和生物大分子，如蛋白質(zhì)和核酸［1，2］.這些細(xì)胞器執(zhí)行其職責(zé)并影響重要的生物功能，包括代謝、能量運(yùn)輸和細(xì)胞增殖［3，4］.所有這些功能都需要能量，而能量則由線粒體產(chǎn)生.它是活細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的樞紐，是細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞自噬、凋亡的關(guān)鍵參與者［5，6］.線粒體功能障礙通常會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病以及肥胖癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）等在內(nèi)的代謝疾?。?，7］.因此，開展對(duì)線粒體的動(dòng)態(tài)成像將有助于揭示相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程.自19 世紀(jì)50 年代以來(lái)，通過(guò)測(cè)量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH/NAD+）的自發(fā)熒光來(lái)監(jiān)測(cè)線粒體活性一直是最實(shí)用的方法［8］，但因受到背景熒光干擾、低靈敏度及短發(fā)射波長(zhǎng)的限制，制約了其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用.在過(guò)去的十年中，熒光分子成像技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，并隨著高分辨率顯微鏡技術(shù)的完善及細(xì)胞內(nèi)分子事件的可視化［9］，種類繁多的有機(jī)熒光分子被應(yīng)用于線粒體的監(jiān)測(cè)，如羅丹明類［10～12］、花菁或半花菁類［13，14］、BODIPY類［15］以及香豆素類［16］，然而大部分線粒體熒光探針受到短發(fā)射波長(zhǎng)以及小Stokes位移的限制，難以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的熒光成像.近紅外熒光探針的出現(xiàn)較好地克服了傳統(tǒng)熒光探針的缺點(diǎn)，其具有發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)（650～900 nm）［17，18］、對(duì)細(xì)胞損傷小［19，20］、組織穿透性強(qiáng)［21］和自發(fā)熒光背景低［22］等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織等復(fù)雜生物系統(tǒng)中生物分子的檢測(cè)、示蹤和成像.

咔唑是一類芳香類含氮雜環(huán)化合物.在結(jié)構(gòu)上，咔唑由2 個(gè)苯環(huán)和1 個(gè)吡咯環(huán)組成，具有雙對(duì)稱軸、優(yōu)良的空孔傳輸能力［23］和剛性的平面結(jié)構(gòu)，通常被用作電子給體分子，其衍生物由于原料容易獲得［24］、熱穩(wěn)定性好且結(jié)構(gòu)易于修飾［25］，在有機(jī)發(fā)光二極管（OLEDs）和熒光傳感器等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.本文基于咔唑衍生物優(yōu)良的物理化學(xué)和光學(xué)特性，設(shè)計(jì)合成了一系列具有大Stokes位移的近紅外熒光探針（化合物6g～6j）.大Stokes位移熒光探針由于減少了熒光傳感中的自猝滅和自熒光，從而顯著改善了生物成像應(yīng)用中的信噪比.目前，大多數(shù)大Stokes位移的熒光染料通過(guò)引入給電子基使HOMO能級(jí)上升，能帶隙變窄，斯托克斯位移變大，但卻導(dǎo)致其熒光量子產(chǎn)率降低，而咔唑類熒光染料卻在擁有大Stokes 位移的同時(shí)具有高熒光量子產(chǎn)率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物6j 在水溶液中發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)668 nm，且具有大Stokes位移（146 nm）和高熒光量子產(chǎn)率（Φ=0.45），并表現(xiàn)出極好的線粒體靶向能力（P=0.90）.該探針能對(duì)裸鼠卵巢癌移植瘤組織進(jìn)行熒光成像，并能持續(xù)16 h以上，為臨床上腫瘤的精準(zhǔn)診斷和治療提供了新策略.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

2，3，3-三甲基-3H-吲哚、1，1，2-三甲基-1H-苯并［e］吲哚、4-甲基喹啉、4-甲基吡啶、碘甲烷（CH3I）、氫化鈉（NaH）、溴化芐和甲基溴化鎂，分析純，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；4-甲基吡啶、苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮、碘化鉀（KI）、溴乙烷和咔唑，分析純，上海笛柏生物科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、石油醚、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙腈、四氫呋喃（THF）和三氯氧磷，分析純，安徽澤升科技有限公司；鹽酸、哌啶、氫氧化鉀和無(wú)水硫酸鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

Bruker AVANCE NEO 400M 和AVANCE 600M 型核磁共振波譜儀（NMR），瑞士Bruker 公司；RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)（FL），日本島津公司；UV-1800PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-VIS），中國(guó)菁華儀器有限公司；IVIS Spectrum小動(dòng)物成像系統(tǒng)，美國(guó)PerkinElmer公司；Leica TCS SP5 LSM共聚焦顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；Agilent Technologies LC/MSD TOF液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司.

1.2 中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的合成

化合物6g～6j的合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthesis route of compound 6g—6j

1.2.1 1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚-1-碘鹽（1A）的合成 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.59 g（10 mmol）2，3，3-三甲基-3H-吲哚、1.44 g（10.1 mmol）碘甲烷和50 mL MeCN混合，于80 ℃攪拌反應(yīng)8 h.將所得混合物減壓濃縮并用乙酸乙酯洗滌殘余固體，干燥后得到2.77 g粉紅色固體粉末，粗收率92%.產(chǎn)品未經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng).1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：7.94～7.88（m，1H），7.86～7.80（m，1H），7.66～7.58（m，2H），3.98（s，3H），2.78（s，3H），1.53（d，J=1.1 Hz，6H）.

1.2.2 1，1，2，3-四甲基-1H-苯并［e］吲哚-3-碘鹽（1B）的合成 以2.09 g（10 mmol）1，1，2-三甲基-1H-苯并［e］吲哚代替2，3，3-三甲基-3H-吲哚，采用合成化合物1A的方法合成化合物1B，得到3.16 g灰白色固體，產(chǎn)率90%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.36（d，J=8.4 Hz，1H），8.29（d，J=8.9 Hz，1H），8.22（d，J=8.2 Hz，1H），8.09（d，J=8.5 Hz，1H），7.79（dd，J=8.4，6.9 Hz，1H），7.73（t，J=7.5 Hz，1H），4.08（s，3H），2.86（s，3H），1.75（d，J=1.1 Hz，6H）.

1.2.3 1，4-二甲基吡啶-1-碘鹽（2A）的合成 以0.93 g（10 mmol）4-甲基吡啶代替2，3，3-三甲基-3H-吲哚，采用合成化合物1A 的方法合成化合物2A，得到2.12 g 黃色固體，產(chǎn)率90%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.86～8.79（m，2H），7.96（d，J=6.3 Hz，2H），4.28（s，3H），2.60（s，3H）.

1.2.4 1，4-二甲基喹啉-1-碘鹽（2B）的合成 以1.43 g（10 mmol）4-甲基喹啉代替2，3，3-三甲基-3H-吲哚，采用合成化合物1A 的方法合成化合物2B，得到2.54 g 黃色固體，產(chǎn)率89%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.35（d，J=6.1 Hz，1H），8.62～8.39（m，2H），8.34～8.19（m，1H），8.07（dd，J=14.2，6.8 Hz，2H），4.58（s，3H），3.01（s，3H，CH3）.

1.2.5 甲基苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮的合成 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將5 g（29.6 mmol）苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮與50 mL DMF 混合，在0 ℃及攪拌下加入2.8 g（118.3 mmol）NaH，攪拌反應(yīng)30 min 后，加入8.4 g（59.2 mmol）碘甲烷并在室溫下攪拌反應(yīng)5 h.將混合物倒入冰水中淬滅反應(yīng)，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，用飽和食鹽水洗滌并用乙酸乙酯多次萃取，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮.殘留物經(jīng)硅膠色層析分離純化，用乙酸乙酯/石油醚（體積比1∶20）展開劑沖洗，得到4.95 g 黃綠色固體，產(chǎn)率91%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.18（d，J=8.1 Hz，1H），8.05（d，J=7.0 Hz，1H），7.80（dd，J=8.1，7.0 Hz，1H），7.64（d，J=8.3 Hz，1H），7.55（dd，J=8.5，7.0 Hz，1H），7.15（d，J=7.0 Hz，1H），3.35（s，3H）.

1.2.6 1，2-二甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽（3）的合成 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將986 mg（5 mmol）甲基苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮與10 mL THF 混合，加入2 mL 3 mol/L 甲基溴化鎂的THF 溶液，將混合物于60 ℃攪拌1 h.向混合物中加入10 mL 2 mol/L 鹽酸.減壓干燥除去THF，加入5 mL 1 mol/L KI 溶液，得到紅色沉淀.粗產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾后，用水和乙酸乙酯洗滌，得到1.36 g 橙色固體化合物3，產(chǎn)率84%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.99（d，J=7.2 Hz，1H），8.81（d，J=7.9 Hz，1H），8.57～8.40（m，2H），8.18（t，J=7.6 Hz，1H），8.02（t，J=7.8 Hz，1H），4.22（s，3H），3.20（s，3H）.

1.2.7 化合物4a，4b，5a，5b 的合成 參照文獻(xiàn)［26］方法合成化合物4a，4b，5a 和5b，其中化合物4a（N-乙基咔唑）為已知化合物.

化合物4b：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.18（dt，J=7.7，1.0 Hz，2H），7.63（dt，J=8.2，1.0 Hz，2H），7.43（ddd，J=8.3，7.1，1.2 Hz，2H），7.29～7.15（m，7H），5.67（s，2H）.

化合物5a：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：10.06（d，J=1.4 Hz，1H），8.76（d，J=1.6 Hz，1H），8.29（d，J=7.8 Hz，1H），8.00（dd，J=8.5，1.9 Hz，1H），7.78（d，J=8.5 Hz，1H），7.70（d，J=8.2 Hz，1H），7.54（t，J=7.7 Hz，1H），7.31（t，J=7.5 Hz，1H），4.51（q，J=7.1 Hz，2H），1.34（t，J=7.1 Hz，3H）.

化合物5b：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：10.07（s，1H），8.80（d，J=1.6 Hz，1H），8.33（dt，J=7.8，1.0 Hz，1H），7.99（dd，J=8.5，1.6 Hz，1H），7.84（d，J=8.6 Hz，1H），7.72（dt，J=8.3，0.9 Hz，1H），7.52（ddd，J=8.3，7.1，1.2 Hz，1H），7.37～7.15（m，6H），5.76（s，2H）.

1.2.8 （E）-2-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，3，3-三甲基-3H-吲哚-1-碘鹽（6a）的合成 將3 g（10 mmol）化合物1A，2.28 g（10.2 mmol）化合物5a與50 mL 乙醇混合，滴加3～4滴哌啶作催化劑，將混合物于80 ℃攪拌反應(yīng)6 h.將混合物減壓濃縮，抽濾，濾餅用少量乙醇洗滌，干燥后得到4.25 g紅色固體粉末狀化合物6a，收率84%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.11（d，J=1.7 Hz，1H），8.65（d，J=16.1 Hz，1H），8.38（dd，J=8.6，1.6 Hz，1H），8.28～8.23（m，1H），7.89～7.82（m，3H），7.77～7.70（m，2H），7.65～7.57（m，3H），7.41～7.34（m，1H），4.55（q，J=6.5 Hz，2H），4.16（s，3H），1.85（s，6H），1.41～1.35（m，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：181.62，155.62，143.67，143.43，142.42，140.88，129.34，129.11，127.48，126.27，123.63，123.27，122.86，121.04，115.03，110.69，109.76，52.17，44.24，38.02，34.57，26.30，22.68，22.07，14.33.HRMS-ESI（M+）calcd.for C27H27N2+，m/z：379.2169；found：379.2174.

1.2.9 （E）-2-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，3，3-三甲基-3H-吲哚-1-碘鹽（6b）的合成 以2.91 g（10.2 mmol）化合物5b 代替化合物5a，采用合成化合物6a 的方法合成化合物6b，得到4.66 g 紅色固體，產(chǎn)率82%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.12（d，J=2.6 Hz，1H），8.69～8.60（m，1H），8.40～8.32（m，1H），8.26（dd，J=8.1，2.7 Hz，1H），7.92～7.84（m，3H），7.77～7.69（m，2H），7.64～7.53（m，3H），7.31～7.19（m，6H），5.79（d，J=3.4 Hz，2H），4.23～4.06（m，3H），1.84（d，J=3.0 Hz，6H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：181.68，155.47，144.06，143.70，142.43，141.44，137.61，129.36，129.18，128.00，127.58，127.30，126.63，123.70，123.28，122.92，121.30，115.09，111.23，111.17，110.05，52.21，46.44，44.25，34.53，26.24，22.69，22.08.HRMS-ESI（M+）calcd.for C32H29N2+，m/z：441.2325；found：441.2332.

1.2.10 （E）-2-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，1，3-三甲基-1H-苯并［e］吲哚-3-碘鹽（6c）的合成 以3.51 g（10 mmol）化合物1B代替化合物1A，采用合成化合物6a的方法合成化合物6c，得到4.45 g紅色固體，產(chǎn)率80%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.38（d，J=1.1 Hz，1H），9.24（d，J=2.3 Hz，1H），8.71（d，J=16.3 Hz，1H），8.50～8.43（m，3H），8.13（d，J=9.0 Hz，1H），8.03～7.90（m，3H），7.87～7.79（m，2H），4.80～4.52（m，2H），4.32（s，3H），2.08（s，6H），1.06（t，J=7.0 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：192.34，182.42，154.49，143.53，140.87，140.01，137.82，133.42，131.22，130.51，128.74，127.24，126.31，123.51，122.88，121.34，120.60，110.07，60.23，53.82，44.26，37.86，35.15，26.06，22.69，22.06，14.18.HRMS-ESI（M+）calcd.for C31H29N2+，m/z：429.2325；found：429.2328.

1.2.11 （E）-2-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，1，3-三甲基-1H-苯并［e］吲哚-3-碘鹽（6d）的合成 以3.51 g（10 mmol）化合物1B代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6d，得到4.82 g紅色固體，產(chǎn)率78%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.87～8.79（m，3H），8.58（d，J=16.1 Hz，1H），8.35～8.26（m，4H），8.22（dd，J=7.8，1.1 Hz，1H），8.16（dd，J=8.6，1.7 Hz，1H），7.92（ddd，J=8.4，6.1，1.8 Hz，2H），7.75（d，J=8.7 Hz，1H），7.72～7.64（m，2H），7.52（ddd，J=8.3，7.0，1.2 Hz，5H），7.30～7.23（m，1H），4.51（q，J=7.1 Hz，2H），2.42（s，6H），1.36（q，J=6.9 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：192.35，182.47，154.35，143.96，141.45，137.66，137.64，129.18，127.30，127.20，121.25，120.90，110.84，110.56，65.38，56.51，53.87，44.28，35.12，26.01，22.72，19.04，15.64.HRMS-ESI（M+）calcd.for C36H31N2+，m/z：491.2481；found：491.2490.

1.2.12 （E）-4-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基吡啶-1-碘鹽（6e）的合成 以2.35 g（10 mmol）化合物2A代替化合物1A，采用合成化合物6a的方法合成化合物6e，得到3.78 g橙黃色固體，產(chǎn)率86%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.83～8.75（m，2H），8.58（d，J=1.7 Hz，1H），8.20（ddd，J=13.4，6.6，1.4 Hz，4H），7.94～7.87（m，1H），7.75（dd，J=8.6，1.2 Hz，1H），7.68（dd，J=8.0，1.3 Hz，1H），7.57～7.49（m，2H），7.33～7.25（m，1H），4.50（q，J=7.2 Hz，2H），4.24（d，J=1.3 Hz，3H），1.39～1.31（m，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.57，145.22，142.82，141.42，140.63，126.95，126.70，123.25，123.21，122.61，121.66，120.99，120.42，120.16，110.35，110.20，47.15，37.74，14.26.HRMS-ESI（M+）calcd.for C22H21N2+，m/z：313.1699；found：313.1702.

1.2.13 （E）-4-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基吡啶-1-碘鹽（6f）的合成 以2.35 g（10 mmol）化合物2A代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6f，得到4.40 g 紅色固體，產(chǎn)率90%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.81（d，J=6.7 Hz，2H），8.62（d，J=1.6 Hz，1H），8.27～8.13（m，4H），7.88（dd，J=8.8，1.6 Hz，1H），7.79（d，J=8.7 Hz，1H），7.69（d，J=8.3 Hz，1H），7.57～7.47（m，2H），7.33～7.18（m，6H），5.73（s，2H），4.24（s，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.49，145.15，142.61，142.02，141.21，137.84，129.14，127.91，127.22，126.94，123.31，122.68，121.65，121.05，120.62，110.76，47.17，46.26.HRMSES（IM+）calcd.for C27H23N2+，m/z：375.1856；found：375.1860.

1.2.13 （E）-4-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基喹啉-1-碘鹽（6g）的合成 以2.85 g（10 mmol）化合物2B 代替化合物1A，采用合成化合物6a 的方法合成化合物6g，得到3.97 g 紅色固體，產(chǎn)率81%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.28（d，J=6.6 Hz，1H），9.14（d，J=8.6 Hz，1H），8.88（s，1H），8.51（d，J=6.6 Hz，1H），8.48～8.35（m，3H），8.27（t，J=9.5 Hz，2H），8.14（d，J=8.6 Hz，1H），8.08（t，J=7.8 Hz，1H），7.78（d，J=8.6 Hz，1H），7.70（d，J=8.2 Hz，1H），7.55（t，J=7.7 Hz，1H），7.32（t，J=7.4 Hz，1H），4.52（s，5H），1.37（t，J=7.2 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.51，148.02，145.37，141.74，140.69，139.29，135.34，129.43，128.00，127.17，127.01，126.59，123.34，122.75，122.37，121.06，120.26，119.73，116.65，115.58，110.27，44.88，37.78，14.29.HRMS-ES（IM+）calcd.for C26H23N2+，m/z：363.1856；found：363.1862.

1.2.14 （E）-4-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基喹啉-1-碘鹽（6h）的合成 以2.85 g（10 mmol）化合物2B代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6h，得到4.80 g 紅色固體，產(chǎn)率87%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.30（d，J=6.7 Hz，1H），9.14（d，J=7.8 Hz，1H），8.91（s，1H），8.52（d，J=6.6 Hz，1H），8.44～8.38（m，2H），8.29（d，J=7.9 Hz，2H），8.15～8.06（m，2H），7.84（d，J=8.6 Hz，1H），7.72（d，J=8.2 Hz，1H），7.51（d，J=7.7 Hz，1H），7.37～7.28（m，2H），7.23（d，J=7.1 Hz，2H），5.77（s，2H），4.54（s，3H），1.24（s，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.47，148.08，145.17，142.37，141.29，139.28，137.91，135.35，129.46，129.14，128.93，128.12，127.90，127.55，127.29，127.13，126.93，126.61，123.44，122.84，122.30，121.09，120.56，119.75，116.97，115.69，110.75，46.31，44.92.HRMSES（IM+）calcd.for C31H25N2+，m/z：425.2012；found：425.2019.

1.2.15 （E）-2-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽（6i）的合成 以3.09 g（10 mmol）化合物3代替化合物1A，采用合成化合物6a的方法合成化合物6i，得到3.19 g藍(lán)色固體，產(chǎn)率62%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.35～9.31（m，1H），9.19（d，J=1.1 Hz，1H），9.12～9.09（m，1H），9.06（s，1H），8.51（d，J=6.5 Hz，1H），8.47～8.39（m，4H），8.35（s，1H），8.32～8.25（m，1H），8.18～8.05（m，2H），7.92～7.86（m，2H），4.60（q，J=6.2 Hz，2H），4.55（s，3H），1.39（t，J=7.1 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：155.97，150.39，143.80，142.21，140.71，138.51，135.29，130.74，129.05，128.33，128.16，127.16，123.32，123.24，122.68，121.19，120.43，119.22，114.80，110.40，46.75，37.84，14.60，14.29.HRMS-ESI（M+）calcd.for C28H23N2+，m/z：387.1856；found：387.1860.

1.2.16 （E）-2-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽（6j）的合成 以3.09 g（10 mmol）化合物3代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6j，得到3.34 g藍(lán)色固體，產(chǎn)率58%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.04～8.98（m，1H），8.88（s，1H），8.67（d，J=9.2 Hz，1H），8.59～8.51（m，2H），8.38～8.33（m，1H），8.29（dd，J=7.7，0.9 Hz，1H），8.20～8.12（m，2H），7.97～7.91（m，1H），7.90～7.83（m，2H），7.73（d，J=8.2 Hz，1H），7.58～7.49（m，1H），7.38～7.16（m，6H），5.20（d，J=7.3 Hz，2H），4.57（s，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：155.91，150.06，146.08，143.95，142.76，141.26，138.47，137.73，135.79，135.39，131.10，130.75，129.51，129.16，128.33，128.17，127.97，127.26，126.83，125.98，123.42，123.19，122.72，121.27，120.75，119.14，115.10，110.80，47.64，46.83，46.32，22.74，14.53，13.84.HRMS-ESI（M+）calcd.for C33H25N2+，m/z：449.2012；found：449.2019.

1.3 性能表征

1.3.1 紫外和熒光光譜測(cè)定 在脫氧DMSO 中制備熒光探針6a～6g 的儲(chǔ)備溶液（1.0 mmol/L）.熒光探針（5，10，20 μmol/L）檢測(cè)溶液由含1%（體積分?jǐn)?shù)）DMSO 的水、乙腈和甲醇溶液配制，紫外吸收光譜用UV1800PC型分光光度計(jì)記錄.然后以最大吸收波長(zhǎng)的激光作為激發(fā)源，記錄550～900 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜.

1.3.2 熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［27］方法獲得熒光探針6a～6g在不同溶劑中的熒光量子產(chǎn)率，結(jié)果列于表1.

Table 1 Photophysical properties of carbazole derivatives in different solvents

1.3.3 熒光穩(wěn)定性測(cè)試 光穩(wěn)定性：將探針溶液以200 μL/孔的濃度加入96 孔不透明板中，采用NIR小動(dòng)物成像系統(tǒng)成像.選擇600～700 nm濾光片連續(xù)照射6 h，激光功率為3 W.生理?xiàng)l件穩(wěn)定性：對(duì)照組將探針溶液加入等體積的PBS 緩沖液中；其余各組探針溶液分別添加20 μmol/L H2O2，GSH，Na+，K+，Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Vc，NQO1，NTR和H+；于37 ℃孵育60 min后，測(cè)定上述溶液的熒光光譜.

1.3.4 細(xì)胞毒性 采用HeLa 細(xì)胞系評(píng)估近紅外熒光探針（6a～6j）的細(xì)胞毒性.首先，將細(xì)胞在37 ℃，5% CO2的96 孔板中培養(yǎng)24 h，然后去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞暴露于不同濃度（1，10，100，1000，10000 和20000 nmol/L）的熒光探針中再培養(yǎng)24 h.隨后，采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）評(píng)估HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力.

1.3.5 細(xì)胞共聚焦成像 通過(guò)共聚焦激光顯微鏡評(píng)估了化合物在HeLa細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器定位.將1×105HeLa細(xì)胞接種到35 mm玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中并孵育12 h，然后將所有細(xì)胞用PBS溶液洗滌2次，并在DMEM 培養(yǎng)基中與20 μmol/L 的熒光探針一起孵育4 h.然后，用PBS 溶液洗滌細(xì)胞并用Mito-tracker green 或Lyso-tracker green 染色1 h.熒光成像采用Leica TCS SP5 LSM 共聚焦顯微鏡成像，使用40×物鏡；熒光探針激光激發(fā)：450～550 nm，濾光片組：600～700 nm.Mito Tracker Green，激光激發(fā)：490 nm激光，濾光片組：490～550 nm.Lyso-tracker green，激光激發(fā)：510 nm 激光，濾光片組：510～550 nm.

1.3.6 體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn) BALB/c裸鼠（6～8周齡，18～20 g）購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約500 mm3時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)前將BALB/c 小鼠隨機(jī)分組，將熒光探針6j（40 mg/kg）尾靜脈注入荷瘤BALB/c裸鼠體內(nèi)，在選定的時(shí)間點(diǎn)用含2.5%異氟烷的氧氣麻醉小鼠，并使用IVIS Lumina成像系統(tǒng)捕獲全身NIR熒光圖像.最后，小鼠被安樂(lè)死，并立即收集它們的心、肝、脾、肺、腎、腸道和腫瘤組織器官，在IVIS Lumina系統(tǒng)上進(jìn)行離體熒光成像.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光探針的合成與結(jié)構(gòu)表征

熒光探針?lè)肿?a～6g的結(jié)構(gòu)和合成路線如Scheme 1所示.首先，發(fā)色團(tuán)在乙腈和碘甲烷作用下季胺化，以較高產(chǎn)率獲得季銨鹽1A，1B，2A和2B.另外，以1，8-萘內(nèi)酰亞胺為原料，通過(guò)在NaH和碘甲烷作用下發(fā)生N-甲基化反應(yīng)，并與格氏試劑甲基溴化鎂進(jìn)一步反應(yīng)獲得發(fā)色團(tuán)3，產(chǎn)率較高且無(wú)需純化.接著咔唑9 位N 在氫氧化鉀條件下與鹵代烷烴發(fā)生烷基化反應(yīng)，并在POCl3和DMF 作用下發(fā)生Vilsmeier-Haack反應(yīng)，獲得醛基咔唑衍生物5a和5b.最后，發(fā)色團(tuán)3與咔唑醛基發(fā)生Knoevenagel縮合反應(yīng)，以較高產(chǎn)率和純度獲得目標(biāo)化合物.上述反應(yīng)條件溫和、后處理方便且不需要貴金屬催化，有利于降低制備成本.所有產(chǎn)物在空氣中都非常穩(wěn)定，并通過(guò)核磁共振波譜和高分辨質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征.

2.2 熒光探針的光譜特性

圖1及表1示出了熒光探針的紫外-可見(jiàn)吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、Stokes 位移以及熒光量子產(chǎn)率數(shù)據(jù).該系列咔唑熒光探針的最大發(fā)射波長(zhǎng)均＞580 nm，其中發(fā)色團(tuán)為1，4-二甲基喹啉-1-碘鹽和1，2-二甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽的熒光探針6g～6j 最大發(fā)射波長(zhǎng)均＞650 nm（其中6i 的最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)到672 nm）.值得注意的是，即使在水溶液中其最大發(fā)射波長(zhǎng)也都達(dá)到近紅外區(qū).另外，熒光探針6g～6j的Stokes位移＞100 nm，熒光量子產(chǎn)率也較高，優(yōu)異的光學(xué)特性為體內(nèi)外熒光成像提供了基礎(chǔ).不同溶劑對(duì)探針熒光量子產(chǎn)率及其最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)的影響并不是特別顯著，表明探針?lè)肿邮苋軇┯绊戄^小.

Fig.1 Normalized absorbance and emission spectra of probes 6g—6j(A—D) in different solvents

2.3 熒光探針的穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步探究熒光探針6g～6j的穩(wěn)定性，進(jìn)行了光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示，熒光探針6g～6j在長(zhǎng)達(dá)6 h的光照下仍能夠保持較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度（圖2）.另外，生命體擁有復(fù)雜的生理環(huán)境，實(shí)驗(yàn)中考察了各種生理環(huán)境中的物種對(duì)探針熒光的影響.結(jié)果表明，絕大多數(shù)的生理物種對(duì)探針的熒光沒(méi)有顯著影響，但是酸性環(huán)境能夠提高探針的熒光強(qiáng)度，可能是季銨鹽基團(tuán)在不同酸堿環(huán)境中使探針光學(xué)特性發(fā)生變化所致.

Fig.2 Optical and physiological stability of different probes

2.4 探針的細(xì)胞毒性及細(xì)胞攝取能力

采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）評(píng)估了探針6a～6j 的細(xì)胞毒性.結(jié)果表明，探針細(xì)胞毒作用較弱（IC50＞20 μmol/L）（圖3），可見(jiàn)熒光探針安全性高.用正常人卵巢上皮細(xì)胞（IOSE-80）和人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）對(duì)探針的攝取能力進(jìn)行了分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用探針6j 處理兩種細(xì)胞后，隨著孵育時(shí)間的變化，可以觀察到探針的紅色通道熒光增強(qiáng)，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性變化.其中，HeLa 細(xì)胞對(duì)探針6j 的攝取速率明顯高于正常細(xì)胞，且在6 h后比正常細(xì)胞的熒光值提高了約3倍（圖4）.

Fig.3 Cytotoxicity of probes

Fig.4 Normal and HeLa cell uptake capacity in vitro

2.5 熒光探針對(duì)線粒體的靶向能力

研究表明，線粒體代謝與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，從而使線粒體成為癌癥治療的有前途的新靶點(diǎn)［28］.目前，帶正電荷的三苯基膦（TPP）在線粒體靶向癌癥治療中占據(jù)優(yōu)勢(shì)［29～31］，這歸因于超極化的腫瘤細(xì)胞膜和線粒體膜可能允許選擇性地積累線粒體靶向藥物［28］.因此，基于腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位高于正常細(xì)胞，使用離域親脂性陽(yáng)離子作為載體的線粒體靶向策略是提高小分子抗腫瘤作用的優(yōu)勢(shì)策略.設(shè)計(jì)之初，我們選擇芳香親脂性陽(yáng)離子片段作為發(fā)色團(tuán)，并與親脂性咔唑母核連接來(lái)達(dá)到線粒體靶向作用.熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光探針和商用Mito-Tracker Green（線粒體探針）、Lyso-Tracker Green（溶酶體探針）一起孵育（圖5）.探針6g～6j 均與Mito-Tracker Green 的熒光信號(hào)顯著重疊，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）均＞0.8，其中探針6j線粒體定位最佳，推測(cè)是咔唑N-9位引入的芳香環(huán)進(jìn)一步增加了探針的脂溶性，使其更容易在線粒體蓄積.然而，探針與其他細(xì)胞器沒(méi)有定位作用，如溶酶體，其Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）較低.以上結(jié)果表明，該類探針在線粒體中選擇性積累，有可能成為準(zhǔn)確診斷腫瘤的潛在策略.另外，線粒體膜電位是監(jiān)測(cè)細(xì)胞健康狀態(tài)的重要生理參數(shù).由于該類探針在線粒體中選擇性積累，因此將其用于精確監(jiān)測(cè)線粒體膜電位變化（Δψm）.使用降低線粒體膜電位的化學(xué)氧化磷酸化抑制劑-間氯苯基腙（CCCP）處理后進(jìn)行線粒體損傷示蹤，結(jié)果顯示，CCCP處理后探針的熒光明顯降低，與商用Mito-Tracker Green 結(jié)果保持一致且熒光變化更為顯著（圖6），表明該類探針還可用于監(jiān)測(cè)線粒體膜電位變化（Δψm）.

Fig.5 Colocalization assay of probe and commercial reagents

Fig.6 Performance of probe 6j in mitochondrial membrane potential

2.6 熒光探針體內(nèi)成像

由于探針6j優(yōu)異的光物理特性及對(duì)線粒體的高靶向能力，因此將其應(yīng)用到小鼠體內(nèi)熒光成像.所有小鼠均靜脈注射探針6j，荷瘤小鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng).如圖7所示，荷瘤小鼠在注射8 h后表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光，并保持在高強(qiáng)度水平至少12 h.此外，還收集了小鼠其它主要器官（心臟、肝臟、肺、脾臟、腎臟和腫瘤）.除腫瘤部位外，其它器官無(wú)明顯的熒光信號(hào).上述結(jié)果表明，熒光探針在體內(nèi)主要分布在腫瘤部位，探針6j可作為腫瘤診斷探針，該探針通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體的變化來(lái)診斷腫瘤疾病.

Fig.7 Real-time in vivo fluorescence imaging of mice and isolated major organs

3 結(jié)論

以咔唑?yàn)槟负?，與不同的親脂性陽(yáng)離子通過(guò)條件溫和、處理方便的方法合成了一系列線粒體靶向的近紅外熒光探針6g～6j.性能測(cè)試結(jié)果表明，該類探針具有近紅外發(fā)射、大Stokes位移和高熒光量子產(chǎn)率.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該類探針不僅可以進(jìn)入活細(xì)胞，而且對(duì)細(xì)胞線粒體靶向性良好，熒光成像能力顯著.小鼠體外成像結(jié)果顯示，探針6j在體內(nèi)能夠分布在腫瘤組織并能進(jìn)行熒光成像，為臨床上腫瘤的精準(zhǔn)診斷提供新的策略.