李 霞，牛曉雪，路 遠，包艷存，李保華，牟 萌，楊 林

（濰坊市農業(yè)科學院，山東 濰坊 261071）

自然界中高等植物性別的產生是植物在漫長的進化過程中，隨著植物的形態(tài)、結構和機能適應自然環(huán)境變化和發(fā)展，特別是繁殖方式的演變而產生的[1]。調查發(fā)現(xiàn)，12 000種被子植物中，72%的物種為兩性花植物，僅4%的被子植物是嚴格的雌雄異株，雌雄單性同株的植物占比7%[2]。植物的性別是在個體發(fā)育到一定時期才由營養(yǎng)器官的某些細胞分化出生殖器官，雌雄異株植物的性別決定主要分為3大類：主要性染色體（活性Y染色體）決定系統(tǒng)、基因平衡（X染色體/常染色體組比例）決定系統(tǒng)、性別決定基因決定系統(tǒng)[3-4]。植物性別分化的形態(tài)特征主要表現(xiàn)在花器構造的差異上，并無明顯的第二特征。雖然有些研究者觀察到不同性別植株在葉量、葉形、冠形、枝條節(jié)間長度等方面有差異，但這往往是個別植物的例子，并非大多數(shù)植物的共同特征。從植物進化與發(fā)展的過程來看，所有的開花植物都起源于同一雌雄兩性花植物祖先。單性花發(fā)育的共同特點是原兩性花原基的一種有性生殖器官選擇敗育而造成的[5]。

蘆筍（AsparagusofficinalisL.）學名石刁柏，是百合科天門冬屬多年生草本植物，以嫩莖供食，是國際市場公認的營養(yǎng)保健蔬菜[6-7]。蘆筍屬于雌雄異株植物，一般蘆筍雌株只開雌花，雄株只開雄花，其性別決定主要體現(xiàn)在雌、雄花器官的形態(tài)上。和其他雌雄異株植物一樣，不論是在雌株還是雄株中，最初形成的都是兩性花，同時具備雄蕊和雌蕊，在發(fā)育過程中，雌或雄性器官發(fā)生退化，兩性花逐漸發(fā)育形成單性花[8]。自然條件下蘆筍雄性兩性株出現(xiàn)的比例僅0%～2%，且自交結實率極低。蘆筍性別有3種基因型和4種表現(xiàn)型，4種表現(xiàn)型分別為雌株（mm）、普通雄株（Mm）、超雄株（MM）、雄性兩性株（Mm），其中超雄株是有活力的[9-10]，在相同的生長條件下，雄株不僅具有更強的抗病性和生命力，而且品質好，產量比雌株高25%以上，生產上可利用蘆筍超雄株與雌株雜交開展全雄育種，即F1代植株全部表現(xiàn)為雄株。目前，獲得蘆筍超雄株的方法主要有2種：一是雄性兩性株自交，在自交后代中篩選超雄株；二是花粉培養(yǎng)誘導蘆筍雄核形成雙單倍體單株。本研究從蘆筍性別分化的遺傳基礎、雄性兩性花的誘導、蘆筍雄性兩性株的鑒定與應用及展望等方面進行綜述分析，以期為將來蘆筍的全雄育種工作提供理論基礎。

1 蘆筍性別分化的遺傳基礎

蘆筍有20條染色體2n=2x=20，染色體分為5條大染色體、1條中型染色體和4條小染色體，除了小染色體3號為亞中著絲粒染色體外，其他的染色體都是中部著絲粒染色體，核型類型屬2A型，較不對稱，為較原始的類型[11]。蘆筍單倍體基因組大小約為1 323 Mb，控制蘆筍性別的基因M、m位于L5染色體上，M對m為顯性，它控制著蘆筍的性別分化，性別機制屬于XY異配子型[12-13]，雄性為Mm，雌性為mm，雄性兩性株（Mm）會產生兩性完全花，引起自花或異花授粉，產生雄雌比例3∶1的后代，符合孟德爾遺傳規(guī)律，其后代MM基因型個體表現(xiàn)為雄性，稱之為超雄株[6]。在L5染色體上，除了性別決定基因外，還存在著一些性別修飾基因，蘆筍兩性株染色體上存在一種特殊的修飾基因，它能阻礙雌蕊選擇性退化，使得不僅雄蕊健全，同時還有健全程度不同的雌蕊、子房和柱頭；而普通雄株中沒有這種修飾基因，雌蕊退化程度高[14-15]。周勁松等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從Y染色體上非重組性別決定區(qū)域鑒定出雌性抑制基因（SOFF）和雄性特異基因（aspTDF1），它們獨立連鎖決定蘆筍性別，促進天門冬屬早期階段性染色體演化，從分子水平上驗證了雌雄異株植物性別決定和性染色體進化。蘆筍性別分化是由基因和環(huán)境共同決定的發(fā)育過程，隨著研究的深入和結果的積累，外觀表型、內源激素、基因等調控蘆筍性別分化的機制、機理將會逐漸清晰，進而通過人工干預調控蘆筍的性別分化，服務于蘆筍育種。

2 蘆筍雄性兩性花的誘導研究

有學者在蘆筍兩性株及兩性花的遺傳發(fā)育機理方面研究認為，蘆筍性別分化是選擇性誘導或敗育的結果[17]。蘆筍的性別分化過程，確定兩性花向單性花發(fā)育的轉變時期是花柱開始發(fā)育的時刻，雌花的雄蕊退化則是在此之后開始的。性別決定基因在心皮和雌蕊原基出現(xiàn)的早期沒有被激活，在其發(fā)育后期才發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，氮化合物含量、含氮化合物的生物合成代謝與抗氧化酶基因的可變剪接以及抗氧化酶與蘆筍兩性花、雄花的性別分化密切相關，可通過改變相關基因的表達量、發(fā)育階段基因的可變剪接以及抗氧化酶活性人為調控兩性花的形成，從而進一步揭示蘆筍兩性花與雄花發(fā)育的調控機理[18-20]。胡淑明等[21]發(fā)現(xiàn)在蘆筍雄株和雌株的花器官發(fā)育早期，兩者都有雄蕊和心皮。當雄花花蕾直徑小于2.0 mm時，可誘導兩性花的形成。研究發(fā)現(xiàn)，通過調控外源激素、多胺和不同生長調節(jié)劑的含量，可誘導形成兩性花，從而促進雄花中雌蕊的發(fā)育，兩性花自交結實，獲得自交種子，從而獲得超雄株[22-23]。陳光宇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，兩性花的發(fā)育和結實情況受氣候、外部環(huán)境、季節(jié)的影響。眾多研究結果表明，通過調節(jié)花的內源物質含量、花蕾的大小、外源激素、不同生長調節(jié)劑與氣候環(huán)境等因素，能誘導兩性花的形成，兩性花再經多代連續(xù)自交獲得遺傳背景純合的雄株與雌株，這不僅解決了蘆筍種質資源匱乏的問題，同時也為新品種的培育奠定了基礎。

Charlesworth[24]研究發(fā)現(xiàn)，常染色體上的很多與花發(fā)育相關的基因突變，都有可能引起雄性和雌性不育，位于同一染色體上的兩個顯性互補且緊密連鎖的基因突變，可得到2個重要的不育突變體，這2個不育突變體可促使植物由雌雄同體通過雌性兩性異體和雄性兩性異體進化到雌雄異株。在性染色體的早期進化中，性別決定基因可以通過染色體重組進行重新組合，對蘆筍而言2個突變基因之間產生重組抑制，但這個時期的重組抑制較弱，使得YY基因型個體是有活力的。Longo等[25]研究表明，在花發(fā)育的早期，3個過氧化物酶同時在雄花和雌花中被檢測到，隨著雌花中花藥發(fā)育的停滯，它們迅速在雌花中降解，卻依然存在于雄花中。此外，雌、雄花之間蛋白質還存在較大差異，子房在發(fā)育過程中存在翻譯水平的調控，可能決定子房在雌、雄花中是否可繼續(xù)發(fā)育。

3 蘆筍雄性兩性株的鑒定

蘆筍同其他雌雄異花植物一樣，雄花和雌花都是由最初的兩性花逐漸發(fā)育而來的，在發(fā)育早期，性別決定并未發(fā)生，此時的花都具有未成熟的兩性特征，Caporali等[26]研究表明，當花蕾長度在0.7 mm以下，性別決定實現(xiàn)了兩性花向單性花的轉變。

3.1 兩性株的外部形態(tài)鑒定

蘆筍是雌雄異株植物，形態(tài)學上花器官是辨別蘆筍雌雄性的唯一標記。從外部形態(tài)上可以通過蘆筍的花、果實、種子等器官來判定[14,27]。

3.2 兩性株的細胞學鑒定

Ming等[28]指出蘆筍性染色體處于進化的早期階段，含有較原始的X染色體和Y染色體。當性染色體上存在的雄性和雌性控制位點重組受到抑制時，就會形成發(fā)育正常的超雄株和兩性株。李霞等[29]以兩性株根尖染色體和花粉母細胞為研究對象進行了細胞學分析，得到了根尖有絲分裂染色體核型公式、染色體的長度比、核型及減數(shù)分裂中期Ⅰ同源染色體詳細的配對情況。張元國等[30]對蘆筍雄性兩性株進行了調查，得到了132株兩性株；同時對其鏡檢技術進行了初步研究。

3.3 兩性株的分子鑒定

蘆筍兩性株與普通雄株表現(xiàn)出了不同的雌蕊結構，兩性株的雌蕊要比普通雄株的長，可能在兩性株體內另外存在一些性別修飾基因，導致在某種水平上控制著兩性花雌蕊的發(fā)育，同時控制兩性花發(fā)育相關基因的表達，且容易受到環(huán)境因素的影響[31]。在研究兩性花與雄花的碳氮比及氮化合物相關基因可變剪接的差異分析中發(fā)現(xiàn)，氮化合物代謝相關基因的可變剪接及較高的表達量和較低的碳氮比有利于兩性花雌蕊的發(fā)育，從而使得兩性花自交或異交結實[18-19]。兩性株的常染色體上存放著一個性別調節(jié)因子，它控制著兩性花的發(fā)育，促進兩性花的形成。在蘆筍兩性花與雄花的發(fā)育過程中主要以生物合成與物質代謝過程為主，而含氮化合物的生物合成代謝與抗氧化酶基因的可變剪接則在蘆筍兩性花雌蕊發(fā)育中起重要作用，脂質代謝相關基因的可變剪接可能與雄花中雌蕊退化相關。

4 蘆筍超雄株的鑒定及應用

4.1 蘆筍雄性兩性株中超雄株的鑒定研究

目前，全雄育種已成為蘆筍育種的重要突破口之一，而獲得超雄株是全雄育種的前提，同時超雄株的篩選也是實現(xiàn)蘆筍全雄育種的關鍵。超雄株的形態(tài)及生理等各方面特征均與正常雄株相同，即使開花后也僅能判斷雄株和雌株，而無法區(qū)分雄株和超雄株，目前實際生產中也僅是利用兩性株自交或異交，后代通過測交可以篩選出可育的超雄株，但花費時間較長。因此，通過利用與性別決定基因緊密連鎖的DNA分子標記進行輔助育種，可提高育種效率，但目前的蘆筍分子標記大多是性別分子標記，其應用僅局限于雌、雄性別的鑒別[32]。早在1991年，Bracale等[31]研究發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶基因是與蘆筍性別決定基因有關的分子標記，但該標記與蘆筍性別決定基因連鎖距離達20 cM，在實際生產中不能應用。Jiang等[33]通過構建蘆筍分子連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)14個RAPD標記及4個RFLP 標記定位在蘆筍性別決定基因所在的染色體L5上，該項工作為進一步研究蘆筍性別連鎖標記奠定了基礎。國內學者對蘆筍性別的研究起步相對較晚，盧龍斗等[34]以UC309為試材，構建了24 bp的特異性引物，在雌性蘆筍擴增出1條相應于RAPD標記的雌性特異帶，繼而轉化為SCAR分子標記，可以有效地鑒定蘆筍的雌雄。通過與性別連鎖的標記來區(qū)分蘆筍雌雄株，能在早期快速鑒別出測交后代雌雄性別，結合田間測交后代性別表現(xiàn)規(guī)律，鑒別、篩選超雄株，為全雄育種提供純系父本。近年來，蘆筍性別連鎖分子標記的研究已經取得了較大進展，雖然已經找到一些與蘆筍性別決定基因相連鎖的分子標記，但是應用到不同群體中難以達到理想的效果，表現(xiàn)出的也只是條帶亮度的差異，這種差異很不穩(wěn)定，甚至有時難以區(qū)分，無法直接應用[35-36]。特別是針對雄株和超雄株難以直接區(qū)分，李霞等[37]設計開發(fā)了性別鑒定的STS雙分子標記YSM 和XSM，鑒定出了蘆筍的3種性別雌株（mm）、普通雄株（Mm）及超雄株（MM），在自交后代群體中還發(fā)現(xiàn)了13株結實的兩性株，有利于進一步開展兩性株遺傳機制的研究。李樂斌等[38]使用標記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 鑒別蘆筍3種不同性別基因型，這為育種者進行蘆筍全雄分子標記輔助育種提供了強有力的技術支撐。

4.2 蘆筍雄性兩性株中超雄株的育種應用

蘆筍雌雄異株，基因型高度雜合，遺傳育種研究難度大，自然條件下，蘆筍的雌雄株比例為1∶1，特別是雄性兩性花出現(xiàn)的比例很低、田間篩選困難，使雄性兩性花的利用受到很大限制。利用兩性花自交可以獲得超雄株，使之與優(yōu)良雌株雜交產生的F1代全部為雄株。兩性花自交數(shù)代后能使蘆筍遺傳上的雜合型轉變?yōu)榧兒闲汀２煌兿甸g的雜交，有可能產生強優(yōu)勢的雜交品種。已經有學者在蘆筍種植群體中發(fā)現(xiàn)兩性株，通過兩性株的連續(xù)自交獲得超雄株[32,39-41]。

張元國等[42]以優(yōu)良雌株NX10-1為母本，以優(yōu)良超雄株SY20-3為父本，培育出全雄品種WF-8。尹俊玉等[43]以美國血統(tǒng)的母本BJ501-35E無性系與超雄父本BJ542-19c無性系組配雜交組合，2010年培育出蘆筍全雄品種京綠4號。張岳平等[44]以Atlas中的優(yōu)良雌株AT3為母本，以全雄品種Backlim中兩性株自交S1群體中的優(yōu)良超雄株B25（04）-15為父本育成全雄F1代雜種井岡111。楊海峰等[45]以993A優(yōu)良雌株母本，以雄性兩性株自交S1代超雄株為父本，選育蘆筍全雄品種X0812。

5 展望

為了加快蘆筍全雄品種的選育，建議以后主要開展以下工作：（1）加大蘆筍種質資源的搜集、利用。作物種質資源是人類社會生存和可持續(xù)發(fā)展必不可少的財富，是重要的戰(zhàn)略資源，當前，我國蘆筍種質資源相對匱乏，蘆筍種質資源的收集、鑒定及利用，對挖掘優(yōu)異基因、蘆筍育種研究及優(yōu)良新品種的選育具有重要意義。只有擁有了大量的種質群體，才有可能在群體中選擇出雄性兩性株，再利用兩性株選育出超雄株，進而培育出蘆筍全雄品種。（2）利用染色體分帶技術、熒光原位雜交技術等對蘆筍兩性株染色體配對開展精細研究。當前，對蘆筍細胞學的研究相對較少[46-47]，且都是利用普通鏡檢技術，開展了蘆筍染色體有絲分裂的核型分析及減數(shù)分裂配對分析，僅僅靠這些染色體外部形態(tài)結構很難對各條染色體進行精密的分析。隨著染色體分帶技術和原位雜交技術等的發(fā)展，對蘆筍染色體處理分析，根據各條染色體的不同帶型，比較其數(shù)量和位置的差別，就能夠較精確地對染色體識別分析，同時利用原位雜交信號精確地將基因序列定位在染色體上，明確特定基因序列與染色體上端粒、著絲粒間的相互關系[48]。（3）利用高通量分子測序技術開展蘆筍雄性兩性株遺傳機理的研究。與傳統(tǒng)分子標記相比，高通量分子標記測序技術為作物遺傳育種提供了捷徑，縮短了育種周期，促進了育種材料優(yōu)良基因的挖掘和有效聚合，對作物遺傳育種具有深遠的影響。高通量分子標記測序技術在蘆筍兩性株遺傳研究方面將會起到重要的作用。（4）研究表觀遺傳修飾對蘆筍性別決定和性別分化的調控如何穩(wěn)定遺傳給子代。近年來，多種植物的生命活動和表觀遺傳修飾的聯(lián)系逐漸被發(fā)掘，從而揭示了環(huán)境因子和植物相互作用的復雜機制。不同類型表觀遺傳修飾的產生和維持需要依靠特定的酶來完成；同時，各修飾間存在密切的聯(lián)系，調控機制復雜且受到環(huán)境影響，這也使得表觀遺傳修飾能夠對植物基因的表達進行較為精細的調控，使植物體對環(huán)境脅迫做出一定的反應，并可將這種反應在一定程度上遺傳給后代[49]。在對蘆筍兩性株的研究中發(fā)現(xiàn)，兩性株的出現(xiàn)與其生長過程中的溫度、濕度、光照等外部環(huán)境有關聯(lián)，將來可以通過表觀遺傳修飾對蘆筍性別決定和分化進行精細調控，從而使兩性、超雄性穩(wěn)定地遺傳給后代，為選育性狀穩(wěn)定一致的全雄品種奠定基礎。