王凡樂，林韋康，陶春霖

（王叔和（鄭州）生物制藥工程有限公司，河南鄭州 450000）

蜂蜜具有多種功能活性和豐富的營養(yǎng)價值，廣泛應(yīng)用于食品加工及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中。《神農(nóng)本草經(jīng)》中稱“蜂蜜味甘、平，安五臟諸不足，益氣補中，止痛”，明確指出了蜂蜜的功效[1]。近代研究表明，蜂蜜具有抗菌、抗炎、抗氧化[2]、促進(jìn)傷口愈合等功能，這些都?xì)w因于其含有的特殊活性物質(zhì)[3]，蜂蜜中主要包含糖和水，其次還含有少量蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)以及一些多酚、萜烯、生物堿等。近年關(guān)于蜂蜜在臨床上抗炎活性的相關(guān)報道屢見不鮮，而其中功效最為突出的是赤桉蜂蜜。赤桉蜂蜜產(chǎn)自澳大利亞原始森林，其活性指數(shù)（Total Activity，TA）高達(dá)30，有豐富的藥用價值和強大的抑菌能力，對幽門螺桿菌的殺滅特性已在國內(nèi)外很多地方運用，并被醫(yī)生推薦給胃潰瘍和胃癌患者。

炎癥是導(dǎo)致傷口疼痛和水腫的主要原因。蜂蜜有抗炎活性[4]，可以減輕臨床試驗、細(xì)胞實驗及動物模型中的炎癥反應(yīng)。蜂蜜中的酚類可提高人體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和NO 的水平，抑制誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、α 腫瘤壞死因子（TNF-α）和IL-1β 的表達(dá)[5]。ALMASAUDI 等[6]研究表明，蜂蜜可使胃潰瘍大鼠模型胃黏膜中SOD 的水平顯著升高，血漿中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平下降[7]。本研究擬選用JH 與其他蜂蜜作抗炎對比研究，為JH 的抗炎作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與細(xì)胞系

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7，武漢普諾賽生命科技有限公司；TA10 赤桉蜂蜜、TA30 赤桉蜂蜜，洋妝源（北京）網(wǎng)絡(luò)科技有限公司。

1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基（批號PM150210）、胎牛血清（批號164210）、PBS 緩沖液（批號PB180327），武漢普諾賽生物科技有限公司；CCK-8 試劑（批號BMU106-CN），亞科因生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號D8371），脂多糖（LPS，批號L8880），北京索萊寶科技有限公司；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，無錫耐思生命科技股份有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α 檢測試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.3 實驗儀器

XPR 電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；BIO-RAD680 型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD 公司；MCO-170 CO2培養(yǎng)箱，冰山松洋生物科技（大連）有限公司；L580R 臺式冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；W-CJ-2FD-Ⅱ生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞復(fù)蘇后，混懸于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 CCK-8 法檢測蜂蜜對RAW264.7 細(xì)胞的毒性

取對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，1×104個/孔接種至96 孔板，培養(yǎng)箱過夜孵育。

實驗設(shè)置空白對照組、LPS 組、Honey 組（TA10赤桉蜂蜜）與JH 組（TA30 赤桉蜂蜜），每組平行3 孔。Honey 組與JH 組分別設(shè)置7 個濃度梯度（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL和320 μg/mL），稱取兩種蜂蜜各10 mg，加入完全培養(yǎng)基配制成1 mg/mL，再稀釋成所需濃度；空白對照組加入200 μL 完全培養(yǎng)基；LPS 組加入等量含1 mg/L LPS 的完全培養(yǎng)基。給藥培養(yǎng)24 h 后，棄掉上清液，每孔加100 μL 的10% CCK-8，37 ℃避光孵育4 h，于450 nm 處測量OD值。根據(jù)公式（1）計算細(xì)胞存活率。

1.4.3 細(xì)胞給藥及脂LPS 誘導(dǎo)

將細(xì)胞以5×104個/孔接種至24 孔板，分為空白對照組、LPS 組、Honey 組及JH 組。參考2.2 實驗結(jié)果，選取細(xì)胞活力拐點附近濃度，確定給藥時間為24 h，每組3 個復(fù)孔。

待細(xì)胞鋪板率達(dá)到60%，吸棄上清，每孔加2 mL PBS 清洗3 次，1 mL/孔分組給藥。繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，棄去上清，PBS 清洗2 次，除空白組外各組加入1 mg/L的LPS；空白對照組不進(jìn)行任何處理。培養(yǎng)24 h 后收集上清，4 ℃離心20 min（2 500 r/min），收集各組細(xì)胞上清至無菌離心管中，于-20 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 ELISA 測定IL-6、IL-1β 和TNF-α 濃度

取1.4.3 項下收集的上清，使用試劑盒測定上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量。按照說明書操作，于450 nm 波長處測其OD值，計算各組濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)至少重復(fù)3 次，結(jié)果以Means±SEM 表示。數(shù)據(jù)采用Graphpad 軟件分析，統(tǒng)計結(jié)果P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 JH 對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

由圖1 可知，Honey 組在40 μg/mL 時RAW264.7細(xì)胞存活率最高；JH 組隨著濃度增大，細(xì)胞存活率呈先增大后減小的趨勢，但均高于同濃度下Honey 組細(xì)胞存活率。給藥24 h 后，JH 濃度為20 μg/mL 和40 μg/mL 時，細(xì)胞存活率均大于80%。一般來說，細(xì)胞存活率大于80%可認(rèn)為藥物對細(xì)胞沒有毒性，即對LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞抗炎損傷有一定的保護(hù)作用。綜合考慮，選用藥物濃度40 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 JH 對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞分泌炎癥因子的影響

由圖2 可知，與空白對照組相比，LPS 組中的TNF-α、IL-6 和IL-1β 分泌水平顯著增加（P＜0.01），說明炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與LPS 組比較，JH 組的TNF-α、IL-6 和IL-1β 分泌水平均顯著降低（P＜0.01），Honey 組TNF-α、IL-6 和IL-1β分泌水平均明顯降低（P＜0.01）。表明JH 對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 炎癥損傷有一定的保護(hù)作用。

圖2 JH 對LPS 刺激RAW264.7 分泌炎癥因子的影響

3 討論與結(jié)論

RAW264.7 是一種單核巨噬細(xì)胞，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到炎癥刺激時能迅速被活化，識別并清除體內(nèi)異物，并同時分泌多種生物活性物質(zhì)。LPS 能導(dǎo)致發(fā)熱、炎癥及休克，又稱作內(nèi)毒素[8]。LPS 誘導(dǎo)刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和炎性因子參與機(jī)體的急性免疫應(yīng)答，從而引起炎癥損傷[9]。TNF-α 是一種促炎性蛋白，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到促炎因子的刺激后合成和釋放[10]。IL-6 是T 細(xì)胞經(jīng)活化后分泌的一種免疫調(diào)節(jié)因子，與TNF-α 共同參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是反映機(jī)體炎癥程度的重要指標(biāo)[11]。IL-1β 是由巨噬細(xì)胞分泌，可加重炎癥反應(yīng)的因子。這些炎癥因子的大量分泌可引起機(jī)體全身性的炎癥反應(yīng)。本研究采用LPS 誘導(dǎo)建立RAW264.7 細(xì)胞炎癥損傷模型，評價JH 對LPS 誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞損傷后的保護(hù)作用。結(jié)果表明，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，RAW264.7 釋放的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 明顯增多，說明炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建成功；與LPS 組相比，經(jīng)40 μg/mL JH 處理后細(xì)胞活力均有顯著升高，炎性因子含量均有所下降，且保護(hù)效果明顯優(yōu)于同濃度下Honey 組。由此推測JH 對LPS 誘導(dǎo)的皮膚炎癥有良好的抗炎效果。

綜上所述，JH 可有效抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 的分泌，從而達(dá)到抗炎的作用。與Honey 組相比，JH 能更有效地降低LPS 誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞中炎癥因子的含量，緩解炎癥刺激，提高細(xì)胞存活率。本研究為蜂蜜保護(hù)皮膚、抗炎刺激的化妝品領(lǐng)域提供了一定的理論依據(jù)，為抗炎成分提供了替代可能性。