陳孝歡，孫瑞強

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131）

目前，生物制藥領(lǐng)域的主流藥物類型仍然是重組抗體類蛋白藥物，該類藥物的糖基化修飾對藥效有重要影響，由于N-型糖基化修飾中的五聚甘露糖（Man 5）能與人體細胞中的甘露糖受體結(jié)合，可以顯著加速抗體類蛋白藥物在人體中的清除速率。人體內(nèi)源性抗體的高聚甘露糖含量極少（＜0.1%）[1]，而通過中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達的重組抗體的高聚甘露糖比例更高，通常在1%～20%[2]。細胞培養(yǎng)過程中許多工藝參數(shù)均會影響目的蛋白的Man 5 修飾比例，例如培養(yǎng)基、添加物、溫度、滲透壓和pH等[3]。其中關(guān)于pH 對Man 5 修飾水平影響的研究中，極端pH 條件（pH ＜6.5 或pH ＞7.5）均會影響高爾基體功能，從而使Man 5 修飾水平大大提高[4]。而在常規(guī)pH 培養(yǎng)范圍內(nèi)，有學(xué)者觀察到高pH 有利于降低Man 5 比例[5]；也有學(xué)者提出，不同細胞系下，pH 對Man 5 的影響作用存在差異[6]。由于哺乳動物細胞培養(yǎng)常使用CO2氣體降低培養(yǎng)體系中的pH，所以低pH 條件下通常還伴隨高pCO2的情況，在未詳細探究pCO2對Man 5 影響的情況下，將Man 5 水平變化的原因歸結(jié)為pH 稍顯片面，有可能忽略真實原因。

本文使用鹽酸和CO2對pH 和pCO2分別進行控制，并通過完全析因?qū)嶒炘O(shè)計方法（簡稱全因子設(shè)計，cfDoE），研究了胞外pH（pHe）和pCO2與Man 5修飾水平的關(guān)系[pH 的研究水平分別為6.85±0.05 和7.35±0.05，pCO2的研究水平分別為（30±10） mmHg和（130±10） mmHg]，通過胞內(nèi)pH（pHi）檢測、細胞周期檢測和關(guān)鍵糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平檢測初步探究了在工藝條件影響下，Man 5 水平發(fā)生變化的潛在內(nèi)因。

1 材料與方法

1.1 細胞株

本文所用細胞株為重組了Fc 端融合蛋白基因的單克隆，由上海藥明生物技術(shù)有限公司細胞株構(gòu)建部使用CHO-K1 宿主轉(zhuǎn)染構(gòu)建而成，可正常生長和表達目的蛋白。

1.2 試劑與儀器

培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為化學(xué)限定培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基CD CHO，美國Introgen 公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基ActiPro以及補料培養(yǎng)基Cell Boost 7a 和Cell Boost 7b，美國Cytiva 公司；pH 指示劑pHrodo Green AM Intracellular，美國Thermo Fisher 公司；碘化丙啶/核糖核酸酶染色緩沖液PI/RNase Staining Buffer，美國BD 公司；pCO2電極，美國Metteler Toledo 公司；3 L 玻璃生物反應(yīng)器，荷蘭Applikon 公司；生物反應(yīng)器控制器，美國Thermo Fisher 公司；Vi-CELL XR 細胞計數(shù)儀，美國Beckman公司；Cedex Bio HT 生化分析儀，瑞士Roche 公司；BGA 348EX 血氣分析儀，美國Siemens 公司；Accuri C6 流式分析儀，美國BD 公司；ISF1-X CO2搖床，瑞士Kuhner 公司。

1.3 種子細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存細胞后，放置在37 ℃水浴2 min 復(fù)蘇，接種至裝有CD CHO 培養(yǎng)基的搖瓶中，置于36.5 ℃、6% CO2的搖床中120 r/min 懸浮培養(yǎng)。之后每3 天傳一次代，傳代初始密度為0.20×106cells/mL。

1.4 批次補料培養(yǎng)

將種子細胞以0.4×106cells/mL 接種至3 L 玻璃生物反應(yīng)器中，初始培養(yǎng)體積為1 500 mL，攪拌轉(zhuǎn)速為250 r/min， 初始培養(yǎng)溫度為36.5 ℃，培養(yǎng)第5 d 降溫至31 ℃；初始培養(yǎng)pH 為7.0±0.2，第6 d 更改pH設(shè)置，開啟pCO2控制，詳細控制方案如表1 所示。溶氧設(shè)置目標值為40%，在培養(yǎng)第3 d、5 d、7 d、10 d分別進行補料，CB7a 補料體積為45 mL，CB7b 補料體積為4.5 mL。

表1 pHe 和pCO2 控制方案

1.5 細胞培養(yǎng)日常參數(shù)檢測

每日取樣3 mL 進行日常參數(shù)檢測，檢測內(nèi)容包括細胞計數(shù)檢測活細胞密度和細胞活率，血氣分析儀檢測離線pH 和pCO2，生化分析儀檢測葡萄糖濃度和乳酸濃度。

1.6 抗體表達量和糖基化分析

抗體表達量由生化分析儀檢測完成；糖型分析由上海藥明生物技術(shù)有限公司分析科學(xué)部支持，使用高效液相方法完成。

1.7 pHi 檢測

對批次補料培養(yǎng)第8 d、10 d、12 d 和收獲日（14 d）的細胞進行pHi檢測（檢測時間代號分別為D8、D10、D12、D14），依據(jù)pHrodo Green AM Intracellualr pH 試劑的protocol 染色孵育后，使用流式細胞儀進行熒光強度分析，激發(fā)波長為488 nm，接收波長為533 nm。熒光強度越高代表pHi值越低。

1.8 細胞周期檢測

對批次補料培養(yǎng)收獲日的細胞進行細胞周期檢測，使用PI/RNase Staining Buffer 避光染色孵育15 min后，使用流式細胞儀進行染色分析，以低流速進樣20 000 events, 在PE-A/count 中標取不同周期階段的細胞組群，單倍體峰為G0/G1 期，中間過渡區(qū)為S 期，二倍體峰為G2/M 期，并統(tǒng)計各期細胞的比例。

1.9 GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ酶轉(zhuǎn)錄水平檢測

將批次補料培養(yǎng)收獲日細胞液300×g 離心5 min，收集細胞，-80 ℃凍存。由上海藥明生物技術(shù)有限公司蛋白質(zhì)科學(xué)部支持，對GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnTⅡ三種糖苷酶進行RT-RNA 檢測。

1.10 cfDoE 方案與結(jié)果分析方法

使用Minitab軟件設(shè)計兩因子兩水平的全析因?qū)嶒灒琾He的高低水平分別為7.35±0.05 和6.85±0.05，pCO2的高低水平分別為（130±10） mmHg和（30±10） mmHg，中心點重復(fù)兩次，詳細實驗方案如表1。實驗完成后依次將Man 5 比例、G0/G1 期細胞比例、GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ三種糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平作為響應(yīng)變量進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05 為顯著性判斷標準，識別pHe、pCO2和pHe*pCO2交互作用對各響應(yīng)變量影響的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞生長結(jié)果

本實驗的pH 和pCO2控制曲線如圖1（A）和圖1（B），從6 d 開始設(shè)置cfDoE 控制條件后，pH 和pCO2基本維持在目標范圍。細胞生長結(jié)果如圖1（C）和圖1（D），各實驗條件的活細胞密度曲線基本可比，而細胞活率存在差異，其中低低水平組合（BR 1）的細胞活率下降最明顯，高高水平組合（BR 4）的細胞活率維持最高。本實驗的代謝結(jié)果如圖1（E），高高組合在7 ～9 d 乳酸濃度最高，隨后緩慢消耗?？傮w來看，高pCO2條件下有明顯后期堆積乳酸的趨勢，是一個不穩(wěn)定因素，而低pH 條件可以更好地穩(wěn)定乳酸代謝表現(xiàn)。

圖1 細胞培養(yǎng)結(jié)果

2.2 蛋白產(chǎn)量結(jié)果

本實驗蛋白產(chǎn)量結(jié)果如圖2，從培養(yǎng)4 d 開始，發(fā)酵液中有少量產(chǎn)物蛋白產(chǎn)生，8 ～12 d 為產(chǎn)量快速增長時期，由此提示，外界環(huán)境對產(chǎn)物蛋白產(chǎn)生影響的關(guān)鍵時期為培養(yǎng)6 d 后，進一步佐證了批次補料培養(yǎng)中將影響Man 5 的條件設(shè)置在降溫后的合理性。

圖2 蛋白產(chǎn)量結(jié)果

本實驗?zāi)康牡鞍桩a(chǎn)量的析因分析P值匯總?cè)绫?，從P值來看，各條件對蛋白產(chǎn)量無顯著性影響，因子效應(yīng)圖不再展示。此結(jié)果充分說明析因結(jié)果中的響應(yīng)效應(yīng)是由實驗設(shè)計因子引起，而非因子條件下蛋白產(chǎn)量降低所引起。

表2 蛋白產(chǎn)量析因分析P 值匯總

2.3 pHe 和pCO2 對Man 5 水平影響的析因分析

pHe和pCO2對Man 5 水平影響的主效應(yīng)和交互效應(yīng)如圖3 和圖4 所示，對應(yīng)的效應(yīng)P值如表3 所示。從析因分析結(jié)果來看，從培養(yǎng)8 d 開始，pCO2即對Man 5 有顯著性負效應(yīng)，該效應(yīng)一直維持至培養(yǎng)結(jié)束；pCO2對Man 5 產(chǎn)生顯著性影響的時間早，影響效果最顯著，是降低Man 5 修飾比例的關(guān)鍵因子。而pH 對Man 5 比例產(chǎn)生影響的時間較晚，從12 d 才開始表現(xiàn)正效應(yīng)，影響效果相對輕微。兩者的交互作用也是從12 d 開始產(chǎn)生，呈微弱反向交互作用；在低pCO2情況下，pH 越低Man 5 修飾比例越低；在高pCO2情況下，pH 越高Man 5 修飾比例越低。

圖3 cfDoE 實驗設(shè)計主效應(yīng)圖

圖4 cfDoE 實驗設(shè)計交互效應(yīng)圖

表3 cfDoE 實驗Man 5 比例P 值匯總

2.4 pHi 檢測結(jié)果

本實驗的pHi檢測結(jié)果如圖5 所示，由于實驗數(shù)據(jù)較多，為方便比較，以中位熒光值代表pHi強度，采用熱圖對數(shù)據(jù)進行分析，顏色越深代表中位熒光值越高，pHi越低；顏色越淺代表中位熒光值越低，pHi越高。

圖5 cfDoE 實驗pHi 檢測結(jié)果

從結(jié)果來看，條件添加后的pHi隨時間變化而變化，且與培養(yǎng)條件有一定相關(guān)性：在條件添加早期（培養(yǎng)8 d），pCO2越高，pHi酸化越明顯；但是隨著培養(yǎng)時間增加，pHi逐漸堿化，且初始酸化越明顯的條件，堿化越迅速，堿化強度也越大；而低pCO2組在條件添加早期酸化并不明顯，但是隨著培養(yǎng)時間增加，pHi逐步酸化。這一現(xiàn)象與高pCO2降低Man 5 比例效應(yīng)時間早、效果強，而HCl 控制的低pH 降低Man 5 比例的效應(yīng)時間晚、效果相對較弱有一定對應(yīng)關(guān)系。

以上現(xiàn)象說明高pCO2和低pH 兩個因素均能酸化胞內(nèi)pH，兩者的作用方式存在差異：（1）無論pH高低，由于CO2的可透膜性，高pCO2條件均可快速酸化生物膜內(nèi)環(huán)境，胞質(zhì)pH 在被酸化后，細胞啟動內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而呈現(xiàn)了后期的堿化現(xiàn)象；（2）而低pCO2下的低pH 條件可能是由于細胞長期處于低pH 環(huán)境中，緩慢滲透適應(yīng)，使得胞內(nèi)pH 逐步降低。由此猜測，以上兩種酸化方式導(dǎo)致胞內(nèi)不同細胞器所處的環(huán)境有所差異，從而表現(xiàn)出不同的代謝和糖基化現(xiàn)象。在高pCO2條件下，大量的CO2不僅可以跨過細胞膜，還可以穿透細胞器膜[7]，從而影響各細胞器的功能，線粒體因為過度酸化而功能受損，乳酸代謝因此異常，而高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能由于酸化環(huán)境得到保護和維持，有利于蛋白的翻譯后修飾，Man 5比例因此而降低；而在低pCO2低pHe條件下，通過細胞膜上離子通道對H+的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)僅能影響胞質(zhì)pH，其他細胞器不易受到影響，所以該條件下的細胞代謝穩(wěn)定，Man 5 修飾水平降低不明顯。

由此可見，pHi越早酸化，且酸化程度高時，糖蛋白從被表達開始就能被充分糖基化修飾，Man 5 修飾水平則可以維持在較低水平。

2.5 細胞周期檢測結(jié)果

培養(yǎng)結(jié)束時G0/G1 期細胞比例的因子效應(yīng)圖如圖6 所示，pHe的影響P值為0.086，pCO2的影響P值為0.046，此時G0/G1 期細胞比例與pCO2水平有明顯正相關(guān)性，即pCO2水平越高，G0/G1 期細胞比例越高。當細胞處于不同的周期時，其生命活動形式有所差異，G0/G1 期的細胞為下一次分裂繁殖做準備，會大量合成蛋白質(zhì)，產(chǎn)物蛋白也在這一時期被表達修飾，當G0/G1 期細胞占比更大時，說明承擔蛋白質(zhì)表達修飾的載體工具較多，蛋白翻譯后修飾越充分，這也許也是高pCO2條件下Man 5 比例低的原因之一。

圖6 cfDoE 實驗G0/G1 期細胞比例效應(yīng)圖

2.6 關(guān)鍵糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果

培養(yǎng)結(jié)束時GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ三種酶轉(zhuǎn)錄水平的因子效應(yīng)圖如圖7 所示。pHe對以上三者的影響P值分別為0.745、0.557 和0.827，pCO2對以上三者的影響P值分別為0.402、0.323 和0.202，說明pHe和pCO2對三種糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平無顯著性影響，由此可見各條件未對細胞的糖苷酶表達量水平產(chǎn)生實際影響，Man 5 水平的改變更有可能是高爾基體中糖苷酶所處pH 環(huán)境改變后，酶活性改變引起的。這也側(cè)面印證了pHi是影響糖基化修飾水平的關(guān)鍵因素。

圖7 cfDoE 實驗糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平主效應(yīng)圖

2.7 討論

兩因素兩水平的析因?qū)嶒灲Y(jié)果確定了降低Man 5修飾比例的主要因素是高pCO2，pHe以及pHe和pCO2的交互作用為次要因素。主因子和交互因子對蛋白產(chǎn)量均無統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性影響，可以排除蛋白產(chǎn)量對Man 5 比例的影響，進一步確認了因子效應(yīng)的有效性。在乳酸代謝方面，僅低pCO2低pHe條件有穩(wěn)定的代謝表現(xiàn)，所有高pCO2條件均有乳酸代謝異常的風險，而中心點水平的pCO2（80 mmHg）乳酸代謝正常，這為高pCO2應(yīng)用在降Man 5 時的參數(shù)范圍提供參考。在降低Man 5 比例的機理研究方面，pHi和G0/G1期細胞比例均與效應(yīng)因子呈一定相關(guān)性，其中高pCO2降低Man 5 的主要原因可能有兩方面：（1）可能是由于大量CO2快速透膜酸化胞質(zhì)pH 環(huán)境，穩(wěn)定了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的低pH 狀態(tài)，為糖基化修飾提供了安全穩(wěn)定的場所；（2）可能是由于高pCO2環(huán)境下，G0/G1 期細胞比例上升，糖基化修飾場所增加，糖蛋白的糖基修飾更充分。此外，研究條件下三個糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平在效應(yīng)因子作用下無顯著性變化。

綜合來看，高pCO2是降低Man 5 的關(guān)鍵因素，也是引起細胞培養(yǎng)乳酸代謝異常的風險因素，低pHe一定程度上也能降低Man 5 比例，雖然效果不及高pCO2，但是能很好地控制乳酸代謝，穩(wěn)定細胞培養(yǎng)表現(xiàn)。

3 結(jié)論

對于培養(yǎng)pH 影響Man 5 修飾水平方面，前人的研究僅停留在pH 一個方面，忽略了pH 變化所引起的pCO2改變對Man 5 的影響，從而有相互沖突的研究結(jié)論，對降低Man 5 修飾水平的工藝策略制定存在一定誤導(dǎo)性。本研究對培養(yǎng)pH 和培養(yǎng)pCO2進行分別控制，通過全因子設(shè)計的研究方法，全面評估了pH（6.85 ～7.35）和pCO2（30 ～130 mmHg）對Man 5 的影響，確認了影響Man 5 修飾水平的主要因素是pCO2；同時，pHi、G0/G1 期細胞比例和GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ酶轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果進一步揭示了pCO2引起Man 5 水平變化的真相。本研究為降低Man 5 修飾水平提供了新的思路，也加深了細胞培養(yǎng)工藝參數(shù)對抗體Man 5 修飾水平影響的認識。