余松林，劉緣，甘琳，歐陽(yáng)，胡治遠(yuǎn)

（湖南城市學(xué)院 黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南益陽(yáng) 413000）

宮頸癌是一種發(fā)病率極高的女性腫瘤疾病。每年全球約有55.51 萬(wàn)人患宮頸癌，其中超過(guò)50%的人因治療無(wú)效而死亡[1]。在我國(guó)，每年因?qū)m頸癌而死亡的人數(shù)多達(dá)5 萬(wàn)人，約占全球?qū)m頸癌死亡人數(shù)的1/6[2]。因環(huán)境等因素的影響，宮頸癌發(fā)病率持續(xù)走高，患病人群日趨年輕化[3]。因此，對(duì)宮頸癌疾病的預(yù)防、治療仍然是一項(xiàng)非常艱巨的任務(wù)。

茯茶素是茯磚茶中新發(fā)現(xiàn)的一類多酚衍生物，已有文獻(xiàn)表明其具有廣泛的生物活性，包括抑菌、抗氧化、減肥以及抗癌活性[4]。羅珍美等[5]以茯磚茶為原料，利用丙酮、石油醚、三氯甲烷、正丁醇等有機(jī)試劑萃取，隨后分別通過(guò)硅膠、聚酰胺、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠、反相硅膠以及小孔樹(shù)脂（MCI）等多種層析方法對(duì)茯磚茶正丁醇萃取部分進(jìn)行分離純化，制備得到茯茶素B，其分子式為C13H15O6，分子量266.09，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 茯茶素B 的結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

人宮頸癌細(xì)胞Hela 由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院陳小平教授饋贈(zèng)。

1.2 試劑與儀器

LDZX-75KBS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LED1152 倒置顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；E191IR 二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)SIM 公司；DT5-2B 低速離心機(jī)，北京新時(shí)代北利醫(yī)療器械有限公司；Multiskan GO 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；LightCycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR，瑞士Roche公司。

DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Cell Counting Kit-8、血球計(jì)數(shù)板、臺(tái)盼藍(lán)染液、TBST 緩沖液、胰酶、無(wú)菌PBS、脫脂牛奶、生理鹽水，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；順鉑，德州德藥制藥有限公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解緩沖液，上海源葉生物科技有限公司；BCA 試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA Fast 200 總RNA 極速抽提試劑盒，上海飛捷生物技術(shù)有限公司；HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、SYBR Green PCR Master Mix（2×），南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SDS-PAGE，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PLK1 Rabbit mAb（A21082）、HRP Goat Anti-rabbit IgG（AS014）、ECL 檢測(cè)試劑盒，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

茯磚茶由黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制得，以茯磚茶為原料提取茯茶素B 按照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[5]。DF-10 培養(yǎng)基：在DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的FBS、終濃度為100 U/mL 的青霉素以及終濃度為0.1 mg/mL 的鏈霉素。

1.3.2 Hela 細(xì)胞毒性檢測(cè)

抑制腫瘤細(xì)胞異常增殖是評(píng)價(jià)抗癌藥物療效的重要指標(biāo)[6]，因而可以通過(guò)探究茯茶素B 溶液對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響來(lái)判斷其是否有可能夠成為治療宮頸癌的藥物。Hela 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DF-10 完全培養(yǎng)基。待Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞并調(diào)整濃度為1.0×105cells/mL，按每孔0.1 mL 接種到96 孔培養(yǎng)板中，設(shè)置無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照。采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)茯茶素B對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。茯茶素B 終濃度分別為0 μg/mL（只加生理鹽水，作為陰性對(duì)照）、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL和300 μg/mL。每組3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育2 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻后培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 吸光度，按公式（1）計(jì)算細(xì)胞活力。

式中，Ai為50 ～300 μg/mL 茯茶素B處理組吸光度值，A0為空白對(duì)照組吸光度值，Ab為陰性對(duì)照組吸光度值。

1.3.3 Hela 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

取35 mm 培養(yǎng)皿，每皿接種2 mL 濃度為1×105cells/mL 的HeLa 細(xì)胞。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞完全貼壁。分別加入終濃度為40 μg/mL順鉑（陽(yáng)性對(duì)照），終濃度為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL 的茯茶素B（實(shí)驗(yàn)組），以及生理鹽水（陰性對(duì)照）。各組設(shè)置9 個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，各組分別取3 皿細(xì)胞消化并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。具體操作：吸棄上清，無(wú)菌PBS洗一遍，加入200 μL 胰酶，37 ℃消化8 min。加入300 μL DF-10 終止消化，吹打?yàn)閱渭?xì)胞后全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL 無(wú)菌EP 管，取20 μL 細(xì)胞懸液加入等體積0.45%的臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行染色，最后吸取10 μL 染色的細(xì)胞懸液至干凈血球計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 PLK1 mRNA 水平檢測(cè)

細(xì)胞總RNA 提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取200 ng RNA 按照HiScript III All-in-one RT SuperMix說(shuō)明書(shū)合成cDNA。用12 ng cDNA 為qPCR 反應(yīng)模板，引物序列如表（1）所示。反應(yīng)體系25 μL，包括2×SYBR MasterMix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 模板（12 ng/μL）1 μL，DEPC 水8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s 及60 ℃，40 s 反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物體系

1.3.5 PLK1 蛋白表達(dá)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela 細(xì)胞，用不同濃度茯茶素B（0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）處理48 h。RIPA 裂解緩沖液與蛋白酶抑制劑按照100 ∶1 的體積比混合，在冰上裂解30 min，以12 000 r/min 離心10 min，獲得細(xì)胞總蛋白。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，再用新鮮的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。將膜與一抗（PLK1 Rabbit mAb，A21082）在1 ∶2 000 稀釋比例下4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜5 次，每次8 min，室溫下進(jìn)行二抗（HRP Goat Antirabbit IgG，AS014）孵育，稀釋度為1∶10 000，孵育2 h。采用ECL 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行顯影，內(nèi)參為β-actin。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析均采用GraphPad Prism 8.0.2 進(jìn)行處理，所有結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），PLK1 表達(dá)水平與腫瘤抑制率相關(guān)性采用Spearman 法分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯茶素B 對(duì)Hela 細(xì)胞活性的影響

如圖2 所示，宮頸癌細(xì)胞的活性隨著茯茶素B 濃度的增加而逐漸減小，即抑癌作用隨著茯茶素B 濃度的增強(qiáng)而不斷增加，呈現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系。對(duì)宮頸癌細(xì)胞活性抑制作用最強(qiáng)的茯茶素B 濃度為300 μg/mL，若繼續(xù)提高藥物濃度，對(duì)癌細(xì)胞的作用效果可能更強(qiáng)，但藥物負(fù)荷過(guò)高可能對(duì)機(jī)體肝腎功能產(chǎn)生損害[7]。因此，茯茶素B 對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)的最佳濃度需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)加以優(yōu)化。

圖2 茯茶素B 濃度對(duì)Hela 細(xì)胞活性的影響

2.2 茯茶素B 對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響

由圖3 可知，未加藥物的空白對(duì)照組Hela 細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增多，可以排除細(xì)胞自身原因造成的假抑制現(xiàn)象。而經(jīng)茯茶素B 作用過(guò)后的宮頸癌細(xì)胞個(gè)數(shù)與加藥時(shí)間呈負(fù)相關(guān)：隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela 細(xì)胞個(gè)數(shù)不斷減少，即細(xì)胞受到藥物的抑制作用越強(qiáng)烈。

圖3 茯茶素B 加藥時(shí)間對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響

為了探討茯茶素B 抑制宮頸癌細(xì)胞增殖可能的機(jī)制，對(duì)不同濃度茯茶素B 處理的Hela 細(xì)胞提取總RNA和總蛋白。根據(jù)前期的文獻(xiàn)，Polo樣激酶1（PLK1）是調(diào)控細(xì)胞周期的一個(gè)關(guān)鍵激酶，也是很多抗癌藥物的作用靶點(diǎn)之一，因此對(duì)茯茶素B 處理前后癌細(xì)胞中PLK1 的mRNA（圖4）和蛋白相對(duì)表達(dá)水平（圖5）進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：茯茶素B 能夠抑制Hela 細(xì)胞中PLK1 的mRNA 和蛋白表達(dá)，并且這種下調(diào)作用均呈現(xiàn)出濃度依賴性。

圖4 茯茶素B 對(duì)Hela 細(xì)胞PLK1 mRNA 表達(dá)水平的影響

圖5 茯茶素B 對(duì)Hela 細(xì)胞PLK1 蛋白表達(dá)水平的影響

為了直接分析茯茶素抑制效力與PLK1 蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示茯茶素B 對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制率與癌細(xì)胞中PLK1 表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān)，如圖6 所示。因此，茯茶素B 很可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白PLK1 的表達(dá)從而限制癌細(xì)胞的擴(kuò)增，但詳細(xì)的分子機(jī)制以及調(diào)控通路還有待未來(lái)深入研究。

圖6 茯茶素B 對(duì)Hela 細(xì)胞抑制率與PLK1 蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

茯茶素B 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用具有明顯的量-效關(guān)系和時(shí)-效關(guān)系，且茯茶素B 能夠以劑量依賴的方式下調(diào)Hela 細(xì)胞中PLK1 的蛋白表達(dá)水平，這可能是其抑制腫瘤增殖的一種作用途徑，但具體的機(jī)制還有待闡明。

3.2 展望

當(dāng)前放療、手術(shù)以及化療仍然是癌癥中最為常見(jiàn)的幾種治療手段[8]。但是在治療過(guò)程中，化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的針對(duì)性作用較弱，對(duì)正常細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生一定的傷害?；熕幬镌谑褂眠^(guò)程中，還會(huì)產(chǎn)生許多的副作用，對(duì)人體的傷害比較大。紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等一系列天然抗腫瘤藥物在臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，極大地刺激了廣大學(xué)者對(duì)這一領(lǐng)域的研究興趣[9]。這也使得對(duì)天然抗腫瘤藥物的尋找與研究變得更加深入。本文從黑茶的健康功效出發(fā)，針對(duì)茯磚茶中分離的天然化合物功能開(kāi)展研究，初步證實(shí)茯茶素B 對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有抑制作用。利用茯茶素B 作為治療宮頸癌等惡性腫瘤的輔助用藥，不僅易于獲得，而且使用安全、毒副作用小，將茯茶素B 開(kāi)發(fā)成抗腫瘤的藥物具有較好的前景[10]。