周繼曾，楊洋，鹿璇，李雙鵬，鄒慶劍，張焜,*

（1.廣東工業(yè)大學 生物醫(yī)藥學院，廣東廣州 510530；2.五邑大學 生物科技與大健康學院，廣東江門 529020）

轉錄激活因子樣效應物（Transcription Activator-Like Effector，TALE）是一種能識別特定DNA 序列的蛋白，最早由科學家在植物病原菌黃單胞菌（Xanthomonas）中發(fā)現(xiàn)，其天然功能是直接調(diào)節(jié)宿主基因表達。在通過細菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)侵染進入宿主細胞后，TALE 進入細胞核，與宿主基因啟動子中的效應器特異性序列結合并激活轉錄[1]。TALE 主要由N 端、C 端和中間的DNA 結合域（DNA Binding Domain，DBD）三部分組成。DNA 結合域由含34 個氨基酸（Amino Acid，AA）重復序列串聯(lián)組成，每段重復序列模塊的第12 和13 位氨基酸為重復可變二殘基（Repeat Variable Di-residues，RVD），其中4 種常見的RVD 是NI、NG、HD 和NN，分別識別核苷酸A、T、C 和G[2]。與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比，TALE具有其獨特優(yōu)勢。例如，TALE 可以靈活地融合各種蛋白，如與核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ融合靶向目標序列進行DNA 雙鏈切割[3]、與轉錄調(diào)控域融合進行基因激活[4]，以及與核酸酶或脫氨酶融合實現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)難以完成的線粒體基因組編輯，作為線粒體疾病治療的潛在工具[5-8]。此外，TALE 核酸酶（TALENs）的識別范圍為10 ～31 個堿基對（bp），具有脫靶風險低的優(yōu)勢[9-10]，比CRISPR/Cas9 系統(tǒng)更適用于臨床應用。然而，目前常用的TALE 組裝方法，如金門（Golden Gate）克隆技術[11]、solid-phase 克隆技術[12]和 Gibson克隆技術[13]等都存在組裝時間長、高成本、難操作的問題，限制了TALE 工具在基因打靶中的應用。

筆者開發(fā)了一種由Cas9/sgRNA 和TALE 組成的雙導航系統(tǒng)的新型單堿基編輯器——TaC9-BE[14-15]，它不僅能在不產(chǎn)生DNA 雙鏈切割的情況下在靶位點實現(xiàn)精準高效的堿基C-T 或A-G 替換，而且沒有可預測DNA 脫靶效應，為基因治療和轉基因生物的產(chǎn)生提供了一種安全的工具。然而，TALE 構建的復雜性成為TaC9-BE 應用的主要障礙。本研究通過新開發(fā)的TALE 三聯(lián)體結合金門克隆技術建立一種新的TALE 構建技術——Trimer-Golden Gate（Tri-GG），該方法可高效、快速、簡易地組裝TALE，為TaC9-BE系統(tǒng)提供了便捷的TALE 服務。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細胞

質(zhì)粒EFS-ABE8EdelR153-TALE-EGFP（LacZ）和EFS-YE1-TALE-EGFP（LacZ）、nCas9-mCherry、UGI-nCas9-UGI-mCherry、gRNA 骨架載體、TALE三聯(lián)體庫等，均由五邑大學鄒慶劍課題組實驗室構建，并存于-20 ℃冰箱；大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)細胞DH5α 菌株和實驗所需所有引物，均購于廣州艾基生物技術有限公司；HEK293T 細胞，購自美國ATCC 生物生物標準品資源中心。

1.1.2 試劑

DNA marker，日本Takara Bio 公司；Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶（Esp3I 和BbsI）、高糖培養(yǎng)基，美國Thermo Fisher Scientific 公司；T4 DNA 連接酶，美國New England Biolabs 公司；PCR 酶和質(zhì)粒提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；轉染試劑lipo 8000，上海碧云天生物技術有限公司；TE 緩沖液（Tris-EDTA）、0.5% NP-40、10 μg/mL 蛋白酶K，德國Merck 公司；10%胎牛血清，美國Cytiva 公司；1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉（Gene Star），青島金斯達生物技術有限公司；1%氯化鈉，天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3 儀器

LHG-3_G-F8 生物安全柜，新加坡Esco 公司；HERA cell 150i1 型細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific 公司；OK-8D 三孔水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；IX73 熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；DYY-6C DNA 凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；2FD 超凈工作臺，瑞智精密股份有限公司；T100 PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；LRH-70 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司。5425R 常溫離心機，德國Eppendorf 公司；3000 超微量分光光度計，美國Nanodrop 公司；1600 凝膠成像儀，上海天能生命科學有限公司；MoFlo? XDP 流式分選儀，美國Beckman Coulter 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TALE 的構建

TALE 三聯(lián)體由非重復的306 bp DNA 序列組成，其表達產(chǎn)物為3 個RVD 重復單元，可結合任意3 個連續(xù)DNA 核苷酸序列，如圖1（a）所示。以TALE三聯(lián)體為模板，設計具有特定末端序列的引物，通過PCR 擴增出三聯(lián)體片段中末端具有Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶（Esp3I）的識別序列。不同引物對擴增出的片段，經(jīng)酶切后產(chǎn)生突出末端可以按順序首尾互補配對，如圖1（b）和表1 所示。三聯(lián)體擴增體系：反應總體系為20 μL，其中2×Phanta Max Master mix為10 μL，擴增三聯(lián)體兩條引物（10 μmol/L）分別加0.5 μL，三聯(lián)體模板取10 ng，補充dd H2O 至20 μL。三聯(lián)體PCR 擴增程序：98 ℃預變性1 min， 98℃變性10 s、60℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，循環(huán)30 次。擴增片段膠回收純化后，與TALE 骨架載體混合，反應體系為1 μL 連接緩沖液，Esp3I 和T4 連接酶各0.5 μL，混合PCR 產(chǎn)物100 ng，TALE 骨架載體60 ng，加ddH2O 補充至總體系10 μL。反應程序為37 ℃酶切5 min 和16 ℃連接5 min，循環(huán)10 次，最終實現(xiàn)在一個反應體系中實現(xiàn)多片段的有序連接，完成TALE模塊組裝，如圖1（c）所示。

表1 三聯(lián)體擴增引物序列

圖1 簡并密碼三聯(lián)體金門法組裝TALE 的流程

1.2.2 菌液PCR 鑒定及測序鑒定

將金門克隆反應液轉移至DH5α 感受態(tài)細胞中進行轉化，冰浴30 min 后放入42 ℃水浴熱激1 min后，繼續(xù)冰浴3 min。最后加入含有X-Gal（200 μg/mL）和IPTG（1 mmol/L）的LB 平板上，放置37 ℃培養(yǎng)箱中12 h。第二天，觀察平板菌落，挑取白色單菌落，加入含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌8 h。取10 μL 菌液高溫裂解后，用作PCR 鑒定的擴增模板。PCR 鑒定引物序列如下，CEXU-F：A A C G T G G C G G C G T G A C C G C A；C E X U-R：GGTGGTCGTTGGTCAACGCGG。 菌液PCR 體系：2×Rapid Taq Master Mix 5 μL，兩引物（10 μmol/L）各0.5 μL，裂解后的菌液0.5 μL，補充ddH2O 至總體系10 μL。PCR 擴增程序：98 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s，循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物凝膠電泳，初步鑒定正確的菌液樣品，然后測序進一步驗證載體序列是否正確。引物為CEXU-F和CEXU-FR。測序正確的TALE 載體用于后續(xù)細胞水平的功能性測試。

1.2.3 gRNA 載體的構建

根據(jù)5 個靶位點序列合成sgRNA 寡核苷酸鏈，將100 μmol/L 的正鏈和反鏈各取1 μL 混合，加ddH2O至20 μL，進行退火。退火程序：95 ℃孵育10 min后以0.1 ℃/s 的速度降低樣品溫度，直到16 ℃。退火后，與線性化gRNA 骨架載體（BbsI 酶切）混合，配制連接反應體系：連接緩沖液1 μL，T4 連接酶0.5 μL，退火產(chǎn)物5 μL，gRNA 骨架載體100 ng，加ddH2O 補充至10 μL，16 ℃孵育1 h。反應完成后，加入DH5α感受態(tài)細胞進行轉化，轉化過程同1.2.2步驟。最后提取質(zhì)粒進行測序鑒定，測序正確的樣品用于后續(xù)的細胞實驗。sgRNA 的引物名稱和序列見表2。

表2 sgRNA 引物序列

1.2.4 細胞轉染和流式分選

用lipo8000 轉染試劑將gRNA、TALE-EGFP和nCas9-mCherry 表達質(zhì)粒按1 ∶1 ∶2 的比例共轉染到293T 細胞中，同時將gRNA 和ABE8EdelR153-mCherry 或YE1-BE4max-mCherry 作為對照共轉染到293T 細胞中。轉染48 h 后，細胞通過流式分選儀進行分選收集帶紅色熒光和綠色熒光的細胞。

1.2.5 PCR 擴增和測序

將分選的細胞樣品離心收集后，加入10 μL 的NP40/蛋白酶K 裂解液，裂解程序為56 ℃裂解1 h，95 ℃處理10 min 使酶失活。裂解產(chǎn)物作為PCR 鑒定的模板。PCR 反應體系：2×PhantaMax Master mix 10 μL，靶位點上下游引物（10 μmol/L）2 μL，細胞裂解物2 μL，ddH2O 補充至20 μL。PCR 擴增程序同1.2.1 步驟。收集PCR 產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳及膠回收純化目標條帶。最后將目標產(chǎn)物送金維智公司進行一代測序。目的條帶的擴增引物序列見表3。測序結果通過EditR（https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/）分析，并用GraphPad Prism8 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

表3 靶位點及其擴增引物序列

2 結果與分析

2.1 TALE 的構建

常用的TALE 靶序列長度為13 ～18 bp，筆者構建的TALE靶向AAVS1 site位點序列為GGGTACTTTTATC（13 bp），以GGG TAC TTT TAT CNN 對應的三聯(lián)體為模板，分別用引物對1F+1R、2F+2R、3F+3R、4F+4R、5F+R+1 擴增出5 個三聯(lián)體片段，其中1 ～4 的片段大小為306 bp，5 的片段大小為102 bp。TALE 靶向ABE site2、ABE site1、HEK site 和RNF site 的靶序列分別為14 bp、16 bp、17 bp 和18 bp。同理，分別按順序每3 個核苷酸對應的三聯(lián)體為模板，每個模板按順序用相應的引物對進行擴增，擴增產(chǎn)物PCR 凝膠電泳圖見圖2（a）。

圖2 擴增TALE 三聯(lián)體片段及連接轉化

PCR 產(chǎn)物回收后，與TALE 骨架載體通過金門克隆技術快速組裝。轉化后在通過藍白斑篩選平板中長出的單菌落均為白斑[圖2（b）]，說明載體連接效率高，沒有原載體轉化克隆。對白色菌落進行PCR鑒定。由于TALE 模塊的序列的重復性，具有正確模板的PCR 產(chǎn)物在凝膠電泳上形成了一系列DNA 階梯帶（約300 bp 間隔）。

5 個TALE 載體構建的電泳條帶正確率平均超過50%（AAVS1 site TALE 7/10、ABE site1 TALE 4/10、ABE site2 TALE 5/10、HEK site TALE 5/10、RNF site TALE 6/10），如圖3（a）所示。經(jīng)進一步測序比對，證實PCR 條帶為大小正確的載體。經(jīng)測序比對，發(fā)現(xiàn)其中有約40%與預計序列完全相同[圖3（b）]，為成功構建的TALE 載體。

圖3 菌液PCR 鑒定及測序統(tǒng)計

2.2 通過細胞基因編輯驗證Tri-GG TALE 的功能

TaC9-BE 編輯系統(tǒng)為雙向導基因編輯器，兩個向導分別為sgRNA 和TALE。5 個TALE 載體已經(jīng)成功構建的前提下，根據(jù)其識別序列的上游6 ～10 bp 處設計sgRNA靶向位點。gRNA和TALE識別序列見表4。經(jīng)測序，5 個位點的gRNA 載體成功構建。

表4 基因位點的gRNA 和TALE 識別序列

在成功構建TALE 和sgRNA 載體的基礎上，將TALE 與脫氨酶TADA8EdelR153融合，與nCas9/gRNA組成TaC9-ABEdelR153編輯系統(tǒng)，如圖4（a）所示；同理，TALE 與YE1 融合，與UGI-nCas9-UGI/gRNA 組成TaC9-CBEYE1編輯系統(tǒng)，如圖4（b）所示。TaC9-ABEdelR153和TaC9-CBEYE1載體系統(tǒng)分別轉染試劑到HEK293T 細胞。收集細胞對目標位點進行測序證實，TaC9-ABEdelR153能在五個位點都具有高效A 到G 的單堿基轉換，同樣，TaC9-CBEYE1能在5 個位點也具有高效C 到T 的單堿基轉換效率，如圖4（c）所示。經(jīng)統(tǒng)計，在所有5 個位點的編輯TaC9-BE 編輯系統(tǒng)與常規(guī)胞苷或腺苷單堿基編輯系統(tǒng)具有相同的編輯能力，如圖4（d）和圖4（e）所示，說明用Tri-GG 克隆技術構建的TALE，具有高效靶向DNA 結合能力，有效應用于基因編輯。

圖4 TaC9-BE 系統(tǒng)的示意圖和在5 個基因位點上的編輯效率

3 討論

TALE 一直作為一項強大的DNA 靶向工具被廣泛使用，但由于構建方法較為復雜、成本高、耗時長等限制，其近年來被CRISPR/Cas9 系統(tǒng)所替代。由于TALE 自身獨特的優(yōu)勢，最近被用于消除可預測的脫靶效應的TaC9-BE 系統(tǒng)和線粒體單堿基編輯中。通過傳統(tǒng)的Golden Gate 克隆技術組裝TALE 需要分兩步進行組裝，復雜且耗時長。本研究通過TALE 三聯(lián)體庫結合Golden Gate 組成的新的克隆技術Tri-GG，具有易操作、低成本且僅需一步反應即可組裝TALE的優(yōu)勢，且能保證TALE 靶向DNA 的功能性。

在用Tri-GG 法構建TALE 識別序列為13 bp、16 bp 時，擴增的最后一個三聯(lián)體是單個TALE 模塊，由于條帶較小導致回收濃度較低。因此，建議在設計TALE 識別序列長度時，盡量選擇3 的整數(shù)倍。在菌液PCR 鑒定正確而一代測序結果出現(xiàn)點突變時，可嘗試更換高保真的PCR 酶或連接酶來提高正確率。對于構建識別序列長度超過18 bp 的TALE 時，建議擴大連接反應的循環(huán)數(shù)。

4 結論

本研究通過TALE 三聯(lián)體結合金門克隆技術建立一種新的TALE 構建技術——Tri-GG，成功構建了5 個位點的TALE 載體。將TALE 與脫氨酶融合后，與nCas9/gRNA 組成Tac9-BE 系統(tǒng)，在293T 細胞中實現(xiàn)了高效的單堿基編輯。本技術為TALE 的構建和應用提供了一個新的簡單快速的方法。