吳瑋軒，楊欣，趙鐘興

（廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

前列腺癌作為一種常見的惡性腫瘤嚴(yán)重危害人體的健康，其早期的診斷技術(shù)以篩查重要的腫瘤標(biāo)志物為主[1-3]。目前最常用的前列腺腫瘤標(biāo)志物為前列腺特異性抗原（PSA）和肌氨酸（Sar），PSA 并非前列腺癌的特異性抗原，以PSA 作為標(biāo)志物對(duì)前列腺癌的檢測常常出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況[4-7]。近年來對(duì)Sar 的研究發(fā)現(xiàn)，Sar 在血液和尿液中的濃度與前列腺癌關(guān)系密切，是更理想的前列腺腫瘤標(biāo)志物，如何快速、靈敏、低成本檢測Sar 的濃度對(duì)前列腺癌的早期診斷至關(guān)重要[8]。

金屬-有機(jī)框架材料（Metal-Organic Frameworks，MOFs）是由金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體，通過配位鍵自組裝形成的，具有獨(dú)特孔道結(jié)構(gòu)的多孔結(jié)晶材料[9]。由于其獨(dú)特的孔結(jié)構(gòu)、良好的穩(wěn)定性以及特殊的催化位點(diǎn)，MOFs 材料在納米酶傳感器方面獲得廣泛關(guān)注[10-12]。設(shè)計(jì)新型MOFs 納米酶傳感器并探究其實(shí)際應(yīng)用仍是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。ZHAO 等[13]利用鐵基金屬有機(jī)框架（NH2-MIL88B(Fe)，NM88B）作為過氧化氫酶納米酶，將H2O2催化生成·OH，進(jìn)而將3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為藍(lán)色的TMBox。當(dāng)通過NM88B 對(duì)多巴胺分子（DA）進(jìn)行檢測時(shí)，DA 消耗·OH 從而抑制氧化反應(yīng)，導(dǎo)致藍(lán)色的TMBox 消失，并且DA 還可以通過電子轉(zhuǎn)移的方式將NM88B 的藍(lán)色熒光猝滅。因此，可以利用NM88B比色和熒光雙模式檢測DA，在實(shí)際樣品檢測中也具有較好的檢測效果，表明該MOFs 納米酶具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。YANG 等[14]將鈷基金屬有機(jī)框架（ZIF-67）作為人工納米酶平臺(tái)電沉積到阿霉素硼納米片（BNSs-DOX）上，制備得到UOx@MOF/BNSs-DOX 納米電化學(xué)傳感器，用于尿酸（UA）的酶促和電化學(xué)檢測，納米酶的高效負(fù)載使UA 檢測下限可達(dá)0.025 μmol/L。因此，構(gòu)筑具有良好催化活性的納米酶，并將其應(yīng)用于生物傳感器是一個(gè)有實(shí)際價(jià)值的研究方向。

本論文基于Sar 的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提出復(fù)合仿生酶級(jí)聯(lián)的策略，設(shè)計(jì)出NH2-MIL88B(Fe)/ 核黃素（NM88B/Rf）電化學(xué)傳感器以促進(jìn)催化H2O2的產(chǎn)生，并將級(jí)聯(lián)信號(hào)放大（從H2O2到·OH），來實(shí)現(xiàn)對(duì)Sar的高靈敏檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

核黃素（Rf）、肌氨酸、六水合氯化鐵、2-氨基對(duì)苯二甲酸、氫氧化鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙酮，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇，分析純，四川西隴科學(xué)股份有限公司；甲基藍(lán)（MB），98.5%，廣東光華科技有限公司。

ME204E 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DZF-6051 型真空干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；1702742S型超聲波清洗機(jī)，南京先歐儀器制造有限公司；01301T08913 型超薄磁力攪拌器，上海泰坦科技股份有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；SU8020 型高分辨場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；SMATLAB3KW 型X-射線衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社；TU-1901 型紫外-可見分光光度計(jì)，深圳市億鑫儀器設(shè)備有限公司；PARSTAT 4000+型電化學(xué)工作站，美國阿美特克集團(tuán)公司。

1.2 NM88B 的制備

分別稱量270 mg（1 mmol）FeCl3·6H2O 和181 mg（1 mmol）2-氨基對(duì)苯二甲酸于反應(yīng)釜中，加入5 mL 的DMF，400 r/min 攪拌30 min；再加入0.4 mL氫氧化鈉溶液（2 mol/L），400 r/min 攪拌30 min；使用真空干燥箱在100 ℃下干燥12 h 可得到深褐色固體粉末狀材料。

1.3 改性電極的制備

在改性電極之前，使用0.30 μm 氧化鋁粉末拋光玻碳電極（GCE，d=5 mm），再使用蒸餾水洗滌GCE，洗滌后的GCE 放置在室溫下干燥。在改性電極時(shí)，將1.5 mg 的樣品NM88B 分散在1 mL 超純水中，于室溫下40 kHz 水浴超聲處理5 min 后形成均勻懸浮液，再將20 μL 的懸浮液滴涂在GCE 上并在紅外線燈的照射下干燥，得到改性電極NM88B/GCE。

1.4 肌氨酸傳感器的制備

將改性電極NM88B/GCE 放入1 100 mL 的核黃素水溶液中（1 mmol/L），在電化學(xué)工作站的STEP 模式下設(shè)置-0.6 V 電壓，時(shí)間90 s 的條件下電沉積，再將電極取出，使用超純水清洗電極表面1 次。室溫干燥后即得NM88B/Rf/GCE。

1.5 NM88B 結(jié)構(gòu)表征

掃描電子顯微鏡（SEM）：將微量NM88B 固定于樣品臺(tái)上，在10 kV 電壓下放大50 倍圖像即可觀察NM88B 的形貌。

X 射線晶體衍射（XRD）：將2 mg NM88B 壓制于顯微鏡載片上，于室溫下進(jìn)行測量。

1.6 NM88B 電化學(xué)表征

實(shí)驗(yàn)采用三電極體系。循環(huán)伏安法（CV）的掃描電位范圍為-0.4 ～0.6 V，掃描速度為50 mV。電化學(xué)阻抗譜（EIS）掃描頻率為0.1 ～105 Hz；實(shí)驗(yàn)溫度為室溫。

1.7 NM88B 的類酶催化

分 別 將20 μL 的NM88B（1 mg/mL）、TMB（0.5 mmol/L）與不同濃度H2O2底物（0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.4 mmol/L 和2.8 mmol/L）進(jìn)行穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)；保持NM88B 添加量（20 μL，1 mg/mL）和H2O2濃度（30 mmol/L）不變，改變TMB底物濃度（0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.4 mmol/L 和2.8 mmol/L）進(jìn)行穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可根據(jù)Michaelis-Menten 方程計(jì)算，見式（1）：

式中，Km為米氏常數(shù)，mmol/L；Vmax為酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，μmol/（L·min）；S為底物濃度，mmol/L；V為反應(yīng)速率，μmol/（L·min）。

1.8 傳感器對(duì)Sar 的定量檢測

在PBS 緩沖液pH=7.5、NM88B 滴涂量為1.5 mg/mL、Rf 電沉積時(shí)間為90 s 的條件下進(jìn)行Sar 的定量檢測實(shí)驗(yàn)。加入500 μmol/L MB 參與級(jí)聯(lián)反應(yīng)的催化中間體時(shí)，在-0.28 V 時(shí)出現(xiàn)明顯增加的電信號(hào),因此采用信號(hào)增強(qiáng)的方式分析Sar 的濃度。

1.9 傳感器的選擇性和時(shí)間穩(wěn)定性

傳感器選擇性：將100 μmol/L 的絲氨酸（Ser）、葡萄糖（Glu）、賴氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）、氯化鉀（KCl）和氯化鈉（NaCl）分別加入含有MB 的溶液中進(jìn)行抗干擾檢測，其余實(shí)驗(yàn)條件及步驟與Sar 定量檢測相同。

傳感器時(shí)間穩(wěn)定性：同時(shí)制備3 個(gè)相同的NM88B/Rf/GCE 傳感器，分別在-4 ℃下儲(chǔ)存1 d 和7 d，在包含1.0 μmol/L Sar 的0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH=6.5）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NM88B 的結(jié)構(gòu)表征

從圖1（b）中可看到，通過溶劑熱法所制備的NM88B 材料顆粒大小和尺寸較均勻，平均尺寸約為500 nm，晶體結(jié)構(gòu)規(guī)整，表面光滑，呈現(xiàn)出紡錘形結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。圖1（a）為溶劑熱法合成NM88B 的XRD 譜圖，在2θ=9.2°、10.3°、13.1°、16.7°、18.5°、20.7°和29.5°出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)(002)、(101)、(102)、(103)、(200)、(202) 和(302)晶面。衍射峰與晶體學(xué)信息文件（CCDC No. 647646）中建立的NM88B 結(jié)構(gòu)模擬譜圖一致，說明NM88B 材料成功制備。

圖1 NM88B 的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.2 電化學(xué)表征

圖2 為在含有0.1 mmol/L KCl 的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液下的CV 和EIS 曲線。從圖2（a）可知，裸電極具有較大的峰值電位分離（?EP=321.8 mV），對(duì)[Fe(CN)6]3-/4-探針具有較小的電流響應(yīng)（Ipa=108.5 μA，Ipc=-121.3 μA）；而NM88B/GCE 的響應(yīng)電流明顯高于裸電極（Ipa=238.1 μA，Ipc=-256.7 μA），峰值電位明顯減?。?EP=133.2 mV），這主要是由于在電極上滴涂了大比表面積的NM88B，增大了電極的表面積，促進(jìn)了電極的電子轉(zhuǎn)移。相比于NM88B/GCE，NM88B/Rf/GCE 傳感器的電位峰分離幾乎不變（?EP=135.9 mV），而其響應(yīng)電流顯著減?。↖pca=158.6 μA，Ipc=-177.2 μA），這說明由電沉積將電子傳遞能力較弱的Rf 引入MOFs 骨架中，NM88B 孔道被部分阻塞導(dǎo)致氧化還原峰電流降低。

圖2 裸電極、NM88B/GCE 以及NM88B/Rf/GCE 的電化學(xué)表征

圖2（b）為1.0 ～100.0 kHz 的開路電位條件下測量所得EIS 譜，通過Zview 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到其阻抗參數(shù)。NM88B/GCE 和NM88B/Rf/GCE電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）分別為169.5 Ω 和174.1 Ω，與NM88B/Rf/GCE 的Rct 相比，NM88B/Rf/GCE 的轉(zhuǎn)移電阻較大，這是因?yàn)樵谠牧仙想姵练e了電子傳遞能力較弱的Rf，這也側(cè)面說明了Rf 的成功負(fù)載。此外，EIS 擬合所得數(shù)據(jù)和CV 測試圖結(jié)果一致，再次說明了NM88B 的成功制備和Rf 的成功負(fù)載。

2.3 NM88B 的類酶催化

通過測定反應(yīng)的表觀穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步分析了NM88B 的類過氧化物酶活性，通過改變H2O2或TMB 的濃度，得出Michaelis-Menten 方程，并通過該方程斜率和截距計(jì)算出最大反應(yīng)速度（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）。已知，Km和Vmax是量化酶催化能力的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，其中Km是酶對(duì)底物的親和力，Km值越小，酶對(duì)底物的親和力越高。從圖3 可知，H2O2為底物的Km值為1.02 mmol/L，以TMB 為底物的Km值為1.11 mmol/L。相較于類似實(shí)驗(yàn)報(bào)道的辣根過氧化物酶（HRP）的Km值（H2O2和TMB 的Km分別為2.61 mmol/L 和0.53 mmol/L）[16]，NM88B 以H2O2為底物的Km低于HRP，而以TMB 為底物的Km高于HRP，這說明NM88B 對(duì)H2O2的親和力大于HRP，對(duì)TMB 的親和力小于HRP。這是因?yàn)镠RP 的活性中心只有一個(gè)Fe 離子，而NM88B 有多個(gè)Fe 離子，且材料的介孔結(jié)構(gòu)有利于H2O2與Fe 離子的反應(yīng)，同時(shí)也表明NM88B 具有良好的類過氧化氫酶催化活性。

圖3 NM88B 模擬類過氧化氫酶穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4 NM88B/Rf/GCE 傳感器對(duì)Sar 的定量檢測

如圖4 所示，·OH 的氧化峰電流隨著Sar 的濃度增加而增加，并在1 nmol/L ～10 mmol/L 的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Ipa=3.18lgCSar+25.85（R2=0.999），檢出限（S/N=3）為0.43 nmol/L。從這些結(jié)果可以看出，NM88B/Rf/GCR 傳感器在MB 的存在下對(duì)Sar 的檢測具有高靈敏度和選擇性，其主要原因是NM88B 的結(jié)構(gòu)有助于Rf 催化Sar 生成的H2O2立刻被NM88B 催化氧化成·OH，使酶級(jí)聯(lián)效應(yīng)高效地發(fā)生。此外，和其他報(bào)道相比（表1），NM88B/Rf/GCR 傳感器對(duì)Sar 具有較低的檢出限和較寬的檢測范圍。

表1 與不同修飾電極對(duì)Sar 的電化學(xué)檢測比較

圖4 Sar 檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 NM88B/Rf/GCE 傳感器的選擇性和時(shí)間穩(wěn)定性

為了探究NM88B/Rf/GCE 對(duì)Sar 檢測的抗干擾能力，研究了幾種Sar 類似物存在下的DPV 曲線。如圖5所示，首先進(jìn)行空白樣品（Blank）的測試，再加入其他干擾物不能引起氧化峰電流的顯著增加，其與空白值的相對(duì)誤差在±8%之間，說明NM88B/Rf/GCE 傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的抗干擾性。

圖5 NM88B/Rf/GCE 傳感器的選擇性

為了探究傳感器的時(shí)間穩(wěn)定性，對(duì)依次保存0 d、1 d 和7 d 的電極進(jìn)行測試，三次實(shí)驗(yàn)的電流響應(yīng)值分別為27.68 μA、27.61 μA 和26.68μA，NM88B/Rf/GCE 傳感器對(duì)Sar 的響應(yīng)沒有明顯下降，Sar 的電流響應(yīng)值仍然保留在初始值的96.4%，表明NM88B/Rf/GCE 具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文通過溶劑熱法合成具有高比表面積、開放的活性金屬位點(diǎn)以及類過氧化物酶活性的NM88B材料，并將其與成本低、低毒性、穩(wěn)定性好的具有類肌氨酸氧化酶活性的Rf 通過氫鍵作用相結(jié)合，制備了能對(duì)前列腺癌標(biāo)記物Sar 高靈敏檢測的電化學(xué)傳感器，并在檢測體系中加入能夠被·OH 氧化的MB 來增強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)電流，結(jié)論如下：

通過溶劑熱法合成NH2-MIL88B(Fe)，其SEM 和XRD圖均與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明了合成方法的可行性。由穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NM88B 具有類過氧化物酶活性，并且能將Rf 催化氧化Sar 生成的H2O2分解成·OH對(duì)MB 進(jìn)行氧化，因此它可以作為電化學(xué)傳感器運(yùn)用于Sar 的檢測。最后通過電化學(xué)工作站的CV、DPV技術(shù)對(duì)NM88B/Rf/GCE 進(jìn)行電化學(xué)檢測，Sar 的檢測范圍為1 nmol/L～10 mmol/L，其檢出限為0.42 nmol/L。除此之外，在抗干擾性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其他干擾物對(duì)傳感器的檢測影響相對(duì)誤差均小于±8%，-4 ℃保存一周后其電流響應(yīng)值仍然保留在初始值的96.4%，說明了NM88B/Rf/GCE 傳感器穩(wěn)定性良好。