王俊鵬，何正大

（中國(guó)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇南京 211112）

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是一種十分嚴(yán)重的心血管疾病，威脅著人們的生命和健康。目前最有效的治療方法是通過(guò)血運(yùn)重建從而快速恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，使血液再灌注[1]。但是在血流恢復(fù)后部分患者的病情會(huì)出現(xiàn)加重的情況，這引起了臨床醫(yī)生和研究者們的注意。

1960 年，研究者在通過(guò)結(jié)扎實(shí)驗(yàn)狗的冠狀動(dòng)脈導(dǎo)致心肌缺血的研究中發(fā)現(xiàn)了再灌注本身就可以加重心肌損傷，增加梗死面積，他們把這種心肌組織在短暫缺血之后恢復(fù)血流而導(dǎo)致組織進(jìn)一步損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI）[2-3]。MIRI 包括多種不同的病理生理過(guò)程，如線粒體膜損傷、一氧化氮代謝紊亂、免疫激活、細(xì)胞凋亡及自噬等。以往的研究表明，MIRI 過(guò)程中將會(huì)破壞機(jī)體氧化和抗氧化過(guò)程，致使脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，最終對(duì)微血管和組織細(xì)胞造成不可逆的損傷[4]。

近年來(lái)，人們對(duì)于MIRI 機(jī)制的認(rèn)識(shí)已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但現(xiàn)有的臨床治療效果依然有限。中藥復(fù)方具有多角度、多靶點(diǎn)的診療效果，其在預(yù)防心肌缺血再灌注損傷方面產(chǎn)生的作用受到研究者的廣泛關(guān)注，以期改善MIRI 患者所面臨的損傷風(fēng)險(xiǎn)。益氣復(fù)脈粉針劑（YQFM）是參麥方的一種現(xiàn)代臨床應(yīng)用形式，源于古方“生脈散”，由紅參、麥冬、五味子3種中藥組成，具有益氣生津、斂陰止汗的功效。其中，紅參作為君藥，能大補(bǔ)元?dú)?、鼓舞清?yáng)；麥冬作為臣藥，能養(yǎng)陰生津、清心除煩；五味子用為佐使，能斂肺寧心、止汗生津；諸藥配伍以共奏益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津之功[5]。YQFM在臨床上常用于治療冠心病、心力衰竭心肌病等。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合系統(tǒng)生物學(xué)、分子藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等多學(xué)科的一門新技術(shù)，通過(guò)研究藥物在整體網(wǎng)絡(luò)中與某個(gè)特定節(jié)點(diǎn)之間存在的相互生物作用關(guān)系，進(jìn)而從系統(tǒng)與整體角度探索并解釋藥物與機(jī)體相互作用的機(jī)制[6]。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）方法當(dāng)前被廣泛用于提高藥物設(shè)計(jì)的效率。AutoDock軟件通過(guò)模擬小分子產(chǎn)物于蛋白質(zhì)受體中不同位置相同能量下的構(gòu)象變化，預(yù)測(cè)分子的作用位點(diǎn)[7]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法，初步研究YQFM 預(yù)防MIRI 的相關(guān)核心生物成分、關(guān)鍵信號(hào)通路與分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 使用軟件及相關(guān)線上數(shù)據(jù)庫(kù)

本研究使用的軟件和相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)見(jiàn)表1。

表1 使用的軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)

1.2 益氣復(fù)脈粉針劑活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）和中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP）對(duì)紅參、五味子和麥冬關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，可得到對(duì)應(yīng)的藥物化學(xué)成分。類藥性（Druglikeness，DL）是通過(guò)比對(duì)已知藥物與目標(biāo)化合物的相似性，從而初步對(duì)其成藥可能性進(jìn)行打分的標(biāo)準(zhǔn)[8]。對(duì)于TCMSP 中的成分?jǐn)?shù)據(jù)，設(shè)定DL ≥0.18，篩選得到的成分為潛在的活性成分[9]；對(duì)于TCMIP 中的成分?jǐn)?shù)據(jù)，則根據(jù)Druglikeness Grading 一項(xiàng)篩選標(biāo)記為Moderate 或Good，且將之化學(xué)成分導(dǎo)入SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)中，將DL 一 欄5 項(xiàng)（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中有3 項(xiàng)及以上為Yes 的成分作為潛在的活性成分[10]。此外，結(jié)合文獻(xiàn)，根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域研究，將不符合上述標(biāo)準(zhǔn)但經(jīng)實(shí)驗(yàn)認(rèn)定可能是有效成分的化合物也納入考量范圍[11-13]。使用Pubchem 獲得前述備選化學(xué)成分的2D 結(jié)構(gòu)與InChiKey，導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“智人”（Homo Sapiens），以probability ＞0 為篩選條件預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，整理匯總相關(guān)數(shù)據(jù)，得到Y(jié)QFM 中的活性成分作用靶點(diǎn)。

1.3 MIRI 靶點(diǎn)收集篩選

使用DrugBank、OMIM、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“myocardial ischemia reperfusion injury”為關(guān)鍵詞進(jìn)行查詢，獲取心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的相關(guān)基因靶點(diǎn)，對(duì)所得結(jié)果去重后建立MIRI 的潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，將之同YQFM 的活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)并取交集，得到Y(jié)QFM-MIRI 共同靶點(diǎn)。

1.4 益氣復(fù)脈核心成分與候選靶點(diǎn)的篩選與獲取

將所得的YQFM-MIRI 共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8 軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)Degree，Betweenness Centrality，Closeness Centrality 大于中位數(shù)這一標(biāo)準(zhǔn)獲取候選靶點(diǎn)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的形成以及核心靶點(diǎn)的篩選與分析

將所得到的候選靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。使用CytoScape 3.8 對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.6 GO 功能及KEGG 通路富集分析

使用MetaScape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析與KEGG 通路富集分析，將P＜0.05 作為具有生物學(xué)意義的臨界值，繪制生物學(xué)過(guò)程GO 分析條形圖與KEGG 通路條形圖。

1.7 分子對(duì)接

使用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)與AlphaFold 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得所需的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件，使用PubChem 獲取所需的化學(xué)成分分子的3D 結(jié)構(gòu)文件，不具有3D 結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分分子，則使用Chem3D 19.0 構(gòu)建最小化化學(xué)能的分子結(jié)構(gòu)。使用AutoDock Tools 1.5.7 處理由先前篩選所得到的小分子配體與靶蛋白，并使用Vina 將核心成分與靶蛋白進(jìn)行分子盲對(duì)接（Blinding Dock）操作，對(duì)對(duì)接產(chǎn)生的聚合體進(jìn)行評(píng)定，記錄對(duì)接完成后分子在蛋白質(zhì)空間構(gòu)象中的相對(duì)位置，并輸出對(duì)接打分（結(jié)合能），使用GraphPad Prism 8 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析，使用Pymol 2.6 軟件和ProteinPlus 對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 益氣復(fù)脈粉針劑中的治療靶點(diǎn)與核心成分

使用TCMSP 與TCMIP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到的藥物活性化學(xué)成分共計(jì)104 個(gè)，其中紅參成分35 個(gè)、五味子成分50 個(gè)、麥冬成分19 個(gè)?；赟wissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)與TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)紅參活性成分對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)有53 個(gè)，五味子活性成分對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)有55 個(gè)，麥冬活性成分對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)有123 個(gè)，合并并去除重復(fù)靶點(diǎn)后可得出YQFM共含有潛在作用靶點(diǎn)189 個(gè)。通過(guò)檢索OMIM、GeneCards、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)并去除重復(fù)項(xiàng)后總結(jié)出MIRI 相關(guān)靶點(diǎn)1 215 個(gè)。將二者進(jìn)行匹配，可得知YQFM 可調(diào)控MIRI 相關(guān)的33 個(gè)潛在靶點(diǎn)（圖1）。以這33 個(gè)潛在靶點(diǎn)搜索并統(tǒng)計(jì)YQFM 的活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)有49 個(gè)活性成分為預(yù)防MIRI 的有效成分。構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析（圖2），根據(jù)前文所述的條件進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2、人參皂苷Rf、β-谷甾醇、戈米辛S、戈米辛T 和麥冬二氫高異黃酮B 可能是YQFM 預(yù)防MIRI 的核心成分（表2）。

圖1 成分-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

表2 YQFM 核心成分

2.2 YQFM 預(yù)防MIRI 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述內(nèi)容中取交集得到的33 個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行處理，物種選擇“Homo Sapiens”（智人），構(gòu)建蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3）。使用Cytoscape 3.8 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行處理，經(jīng)分析可知網(wǎng)絡(luò)共有33 個(gè)節(jié)點(diǎn)，160 條邊，網(wǎng)絡(luò)平均度數(shù)為9.7，其中顏色的深淺與節(jié)點(diǎn)大小代表著節(jié)點(diǎn)的度數(shù)，使用Centiscape 2.2 插件對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析，計(jì)算出其中得分較高的靶點(diǎn)，處理結(jié)果見(jiàn)圖3，節(jié)點(diǎn)的度數(shù)越大，則表明該節(jié)點(diǎn)的生物學(xué)功能越重要，越可能是影響MIRI 發(fā)生的基因靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，內(nèi)皮一氧化氮合成酶（NOS3）、腎上腺素能受體B2（ADRB2）、腫瘤壞死因子（TNF）、過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ編碼基因（PPARG）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、胱天蛋白酶3（CASP3）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）與其他蛋白的關(guān)聯(lián)程度相對(duì)較大，這些靶點(diǎn)極可能是YQFM 預(yù)防MIRI 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.3 潛在靶點(diǎn)GO 富集與KEGG 富集分析結(jié)果

使用MetaScape 數(shù)據(jù)庫(kù)以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO分析（圖4A）與KEGG分析（圖4B），X軸為-log10(P)，Y 軸為富集條目或途徑；圖中顏色越深P值越大。GO 預(yù)測(cè)YQFM 中核心成分主要參與的生物過(guò)程關(guān)鍵指標(biāo)，如節(jié)律過(guò)程、血液循環(huán)、平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)等關(guān)鍵指標(biāo)。KEGG 富集分析結(jié)果表明，脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、癌癥蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）、癌癥通路（Pathways in cancer）和化學(xué)致癌-受體激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）與YQFM 預(yù)防MIRI的作用機(jī)制密切相關(guān)。

圖4 富集結(jié)果

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

使用AutoDock Vina 1.1.2 對(duì)YQFM 中的6 種核心成分與上述的8 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行親和力研究和分子結(jié)合模式模擬，使用GraphPad Prism 8 軟件統(tǒng)計(jì)并處理輸出熱圖。如圖5 所示，結(jié)合能均≤-5 kcal/moL，表明分子與目標(biāo)蛋白之間存在較好的結(jié)合能力。選取其中具有代表性的分子對(duì)接結(jié)果，使用ProteinPlus繪制二維對(duì)接圖進(jìn)行展示，見(jiàn)圖6。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，YQFM 發(fā)揮藥效的有效成分為33 個(gè)，其中以β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rf 為首的共6 種成分可能是YQFM 在預(yù)防MIRI 過(guò)程中發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)。近些年，有研究表明β-谷甾醇通過(guò)提高超氧化物歧化酶表達(dá)間接降低活性氧水平，從而降低心肌炎癥反應(yīng)[14]；人參皂苷Rh2 是一種藥理作用廣泛的化學(xué)物質(zhì)，邵懇等[15]經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)增加大鼠MIRI 后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量從而對(duì)大鼠受損心肌發(fā)揮保護(hù)作用；人參皂苷Rf 能抑制COX-2 蛋白表達(dá)，后者一般在缺氧條件下被誘導(dǎo)激活，產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)，這說(shuō)明人參皂苷Rf 能夠?qū)θ毖醯男募〖?xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)，具有抗炎活性[16]。

通過(guò)GO 功能分析發(fā)現(xiàn)YQFM 可能通過(guò)參與節(jié)律過(guò)程、血液循環(huán)、平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程發(fā)揮其預(yù)防MIRI 的作用。KEGG 富集分析結(jié)果則顯示，YQFM 與MIRI 的關(guān)鍵候選基因SRC、PPARG、NOS3、TNF、CASP3 均富集于脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路。實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持TNF 在MIRI 中以活躍形式存在，且通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α 的表達(dá)可起到縮小心肌梗死面積，減輕MIRI的效果[17]；NOS3 是參與血管生成調(diào)控的關(guān)鍵基因，NOS3 水平的升高可以緩解MIRI 的發(fā)作程度[18]；近年的研究關(guān)注到PPARG 的磷酸化激活可以顯著緩解心律失常與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，而抑制PPARG 的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)MIRI 誘發(fā)嚴(yán)重心律失常[19]；PTGS2 是前列腺素-過(guò)氧化物內(nèi)酯合酶的一種亞型，其在炎癥反應(yīng)中起到了特定的作用，當(dāng)前研究表明，抑制PTGS2 可減少心肌梗死的炎癥反應(yīng)并且改善心肌重塑效果[20]。

綜上所述，本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法初步對(duì)益氣復(fù)脈粉針劑的預(yù)防心肌缺血再灌注分子機(jī)制做出了解釋，并發(fā)現(xiàn)益氣復(fù)脈粉針劑可能是通過(guò)人參皂苷Rf、人參皂苷Rh2、β-谷甾醇等核心成分通過(guò)作用于TNF、SRC、NOS3、PTGS2、CASP3 等靶點(diǎn)來(lái)調(diào)控脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等，從而發(fā)揮了對(duì)心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防與治療作用。本研究為益氣復(fù)脈粉針劑的藥理作用機(jī)制相關(guān)研究提供了一種思路和方法，為今后深入探討益氣復(fù)脈粉針劑對(duì)MIRI 的作用機(jī)制提供了參考。