王慧娟，陳碧嬋，龍 倩，歐玲林，鐘 歡，劉邁蘭，葉 勇，湯 偉

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208）

“小兒之病，惟熱居多。”[1]發(fā)熱是兒科臨床最常見癥狀之一[2]。持續(xù)的高熱易引起神經(jīng)功能損害[3]，從而誘發(fā)抽搐、癲癇等并發(fā)癥[4]。目前臨床常用小兒退熱藥以解熱鎮(zhèn)痛非甾體藥為主。解熱鎮(zhèn)痛非甾體藥能快速降低體溫，但其潛在的胃腸道不良反應，使嬰幼兒應用具有一定局限性[5]。小兒推拿作為中醫(yī)兒科的主要外治法之一，其退熱技術已廣泛應用于臨床，大量臨床研究證實了推拿干預小兒發(fā)熱安全、有效[6-7]。天河水，性大涼，可治一切熱證[8]，是小兒推拿治療發(fā)熱的經(jīng)驗效穴。當代小兒推拿流派圍繞“天河水”，在繼承古人的基礎上，創(chuàng)新了一系列小兒退熱手法，如“清天河水”“取天河水”“大推天河水”“引水上天河”等。其中“大推天河水”作為湖南劉氏小兒推拿流派特色退熱技法之一[9]，操作獨特，講究手到氣到，涼透起效?！按笸铺旌铀迸R床主要用于治療小兒高熱、實熱之證[10]。

推拿臨證重視“手隨心轉(zhuǎn)，法從手出”，才能發(fā)揮“以推代藥”的作用，實現(xiàn)“手到病除”的目的；其中“心”“法”涉及的關鍵要素是推拿手法的刺激量如操作時間、頻率等，而手法刺激量通常與臨床療效密切相關。以“天河水”退熱推拿為例，臨床手法操作的時長，主要以醫(yī)者個人臨床經(jīng)驗為參考依據(jù)，尚缺乏統(tǒng)一操作標準。目前文獻報道關于“天河水”退熱手法的操作時間標準不一[11]，操作時間的長短是否直接影響“天河水”的退熱效應，尚無直接證據(jù)證明[12]。本團隊預實驗研究發(fā)現(xiàn)，大推天河水5 min即可有效降低發(fā)熱幼兔體溫，但疊加手法操作時長是否影響手法退熱效果，尚未明確?；诖?，本團隊以流派核心退熱技術“大推天河水”為干預手法，通過建立發(fā)熱幼兔模型，以觀察“大推天河水”的不同操作時長對發(fā)熱幼兔體溫的影響，并探討其可能的解熱機制，以期為臨床治療小兒發(fā)熱提供推拿手法的量效參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物與分組 40只50日齡左右的健康普通級雄性新西蘭兔，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0009，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于濕度（55±5）%，溫度（25±2）℃，12 h明/12 h暗循環(huán)條件下，自由飲食飲水。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（LLBH-201908120003）。所有動物適應性飼養(yǎng)7 d，待飲食、飲水正常即開始進行肛溫適應性測定，每隔30 min測定1次，共測量3次，確保每次測量時體溫計插入深度一致，每次測量時長不低于5 min。取3次體溫的平均值作為基礎體溫。選取40只體溫波動在38.5～39.5 ℃之間，且最高體溫與最低體溫差不超過0.5 ℃的合格幼兔，隨機分為5組，即正常組、模型組、大推天河水5 min組、大推天河水10 min組及布洛芬組，每組8只。

1.2 主要試劑與儀器 大腸桿菌內(nèi)毒素（美國Sigma，批號：019M4009Y）；布洛芬混懸液（上海強生制藥有限公司，批號：200823）；兔5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：201211R）；兔去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：201211R）；天沐獸用體溫計（九江鑫康醫(yī)用儀表有限公司制造，型號：ZL888）；電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，型號：AE1204）；微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：TG16W）；移液器（德國艾本德股份公司，型號：3120000054）；450 nm波長全自動酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司，型號：RT-6100）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（一恒蘇凈科學儀器有限公司，型號：DHP-9012）；洗板機（拓普分析儀器有限責任公司，型號：ZMX-988B）。

2 方法

2.1 造模前準備 所有動物先適應性喂養(yǎng)7 d，待飲食、飲水等正常后開始進行造模前適應性固定與操作。（1）適應性固定：在造模前3 d，每日將實驗幼兔在特制兔架上仰臥位適應性固定1 h；（2）適應性操作：在造模前1 d對幼兔左前肢剃毛，蘸取與室溫相同的清水，在幼兔左前肢掌面正中相當于天河水的位置行“大推天河水”手法，頻率為50～100次/min，每次操作1 min，操作2次。（3）稱體質(zhì)量：在造模當天，抓取幼兔進行體質(zhì)量測定，根據(jù)體質(zhì)量計算造模藥物及布洛芬給藥劑量。

2.2 模型制備 參照文獻[13]，以無熱源0.9%氯化鈉溶液為稀釋液，將精制大腸桿菌內(nèi)毒素稀釋成質(zhì)量濃度為200 ng/mL的溶液，模型組、大推天河水5 min組、大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔均經(jīng)兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素溶液（1 mL/kg），注射1 h后模型兔體溫上升高度（△T）與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），造模成功[14]。

2.3 天河水定位 參照《實驗針灸學》[15]：從腕橫紋至肘橫紋。

2.4 推拿方法 在造模后1.5 h開始進行推拿干預，按照《小兒推拿》[16]中大推天河水的手法操作要點，醫(yī)者用示指、中指指面蘸涼水自內(nèi)勞宮穴經(jīng)總筋穴沿天河水向上直推至洪池穴，邊推邊吹氣，頻率為50～100次/min，實驗中推拿操作由同一名實驗人員進行。

2.5 各組干預方法 正常組不予以任何干預，相同條件下測量肛溫；模型組在造模成功后不予以任何干預，相同條件下測量肛溫；大推天河水5 min組于造模后1.5 h進行推拿干預，頻率為50～100次/min，共操作5 min；大推天河水10 min組分別于造模后1.5、2.5 h進行推拿干預，頻率為50～100次/min，每次操作5 min，共操作10 min；布洛芬組在造模后1.5 h予布洛芬混懸液（0.01 g/mL）灌胃，1 mL/kg。所有實驗幼兔從造模后開始監(jiān)測體溫，每隔0.5 h測量1次幼兔肛溫，共觀察6 h。

2.6 觀察指標

2.6.1 體溫上升高度 造模后每0.5 h測量1次幼兔肛溫，觀察幼兔發(fā)熱的時相并計算體溫上升高度△T（△T=體溫上升最高值-基礎體溫），比較各組體溫上升高度變化。

2.6.2 退熱時間 觀察各組幼兔降至正常體溫范圍（38.5～39.5 ℃）的時間，比較各組體溫恢復正常的時間。

2.6.3 下丘腦中5-HT、NE含量 動態(tài)體溫測量完畢后，各組幼兔利用空氣栓塞法致死，快速斷頭后以灰結節(jié)和視交叉之間的中心點為中心確定下丘腦組織，取下丘腦組織，快速投放于液氮中，待下丘腦組織冰凍定型后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃環(huán)境下保存待測，所有動物取材完畢后，待標本融化，加入一定量的緩沖液，將標本充分勻漿。以3 000 r/min離心15 min（離心半徑為13.5 cm）。收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書中步驟測定下丘腦中5-HT和NE的含量。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以“均數(shù)±標準差“（）表示，對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，體溫上升高度值數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布、方差齊性時，采用廣義估計方程分析；退熱時間及下丘腦5-HT、NE數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，方差齊時，采用最小顯著差異（LSD）法進行組間兩兩比較，方差不齊則采用ANOVA Tamhane's T2法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組幼兔體溫上升高度比較 廣義估計方程分析結果顯示。（1）組間比較：Waldχ2=211.997，P=0.000，表明不同組別之間體溫上升高度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（2）時間比較：Waldχ2=425.484，P=0.000，表明不同時間點之間體溫上升高度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（3）交互效應：組別因素與時間因素存在交互效應（Waldχ2=257.300，P=0.000），表明不同組別隨時間變化體溫上升高度不一致。大推天河水5 min組幼兔造模后2.0～3.0 h的體溫上升高度明顯低于模型組（P＜0.01）；大推天河水10 min組幼兔造模后1.5～3.5 h的體溫上升高度低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；布洛芬組幼兔造模后2.0～3.5 h、5.0～5.5 h的體溫上升高度低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；大推天河水10 min組幼兔在造模后2.5～4.0 h的體溫上升高度低于大推天河水5 min組（P＜0.01或P＜0.05）；布洛芬組幼兔在造模后3.0～4.0 h、5.5～6.0 h的體溫上升高度低于大推天河水5 min組（P＜0.01或P＜0.05）；布洛芬組幼兔造模后5.5～6.0 h的體溫上升高度低于大推天河水10 min組（P＜0.01或P＜0.05）。（見表1～2）

表1 各組幼兔體溫上升高度（△T）比較 （，℃）

表1 各組幼兔體溫上升高度（△T）比較 （，℃）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01，cP＜0.05；與大推天河水5 min比較，dP＜0.01，eP＜0.05；與大推天河水10min組比較，fP＜0.01，gP＜0.05。

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表2 廣義估計方程模型效應檢驗結果

模型組幼兔體溫上升高度在造模后1 h顯著高于正常組（P＜0.01），說明造模成功。造模后，模型組幼兔體溫明顯升高，出現(xiàn)典型的雙向熱，發(fā)熱第一個高峰出現(xiàn)在1.5 h左右，第二個高峰出現(xiàn)在3.0 h左右。（見表1、圖1）

圖1 體溫上升高度變化圖

3.2 各組幼兔退熱時間比較 大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔退熱時間短于模型組（P＜0.01)；大推天河水5 min組幼兔退熱時間與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)；大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔退熱時間短于大推天河水5 min組（P＜0.01)；大推天河水10 min組幼兔退熱時間與布洛芬組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。故各組退熱療效，按時間降序排列如下：大推天河水10 min＜布洛芬組＜大推天河水5 min組＜模型組。（見表3）

表3 各組發(fā)熱幼兔退熱時間比較 （，min）

表3 各組發(fā)熱幼兔退熱時間比較 （，min）

注：與模型組比較，aP＜0.01；與大推天河水5 min組比較，bP＜0.01。

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3.3 各組幼兔下丘腦5-HT、NE含量比較 模型組幼兔下丘腦中5-HT含量低于正常組（P＜0.01)；大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔下丘腦中5-HT含量均高于模型組（P＜0.01）；大推天河水5 min組幼兔下丘腦5-HT含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔下丘腦中5-HT含量均高于大推天河水5 min組（P＜0.01）；大推天河水10 min組幼兔下丘腦中5-HT含量與布洛芬組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組幼兔下丘腦中5-HT 含量比較 （，ng/mL）

表4 各組幼兔下丘腦中5-HT 含量比較 （，ng/mL）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與大推天河水5 min比較，cP＜0.01。

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模型組幼兔下丘腦中NE含量高于正常組（P＜0.01)；大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔下丘腦中NE含量均低于模型組（P＜0.01）；大推天河水5 min組幼兔下丘腦中NE含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；大推天河水10 min組及布洛芬組幼兔下丘腦中NE含量均低于大推天河水5 min組（P＜0.01）；布洛芬組幼兔下丘腦中NE含量低于大推天河水10 min組（P＜0.01）。（見表5）

表5 各組幼兔下丘腦中NE 含量比較 （，ng/mL）

表5 各組幼兔下丘腦中NE 含量比較 （，ng/mL）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與大推天河水5 min比較，cP＜0.01；與大推天河水10 min比較，dP＜0.01。

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4 討論

發(fā)熱是指機體在各種致熱原的作用下，下丘腦體溫調(diào)定點上移而引起核心溫度升高[17]。發(fā)熱主要由致熱原引起。內(nèi)毒素作為一種外生致熱原，經(jīng)靜脈注射進入機體后可激活產(chǎn)內(nèi)生致熱原細胞，產(chǎn)生大量內(nèi)生致熱原。內(nèi)生致熱原通過影響機體中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和代謝，導致下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞功能紊亂，最終引起發(fā)熱[18]。內(nèi)毒素致熱模型可以較好地模擬發(fā)熱，有利于探討推拿治療小兒發(fā)熱的解熱機制[19]。故本實驗選取出生50 d的幼兔，以耳緣靜脈注射內(nèi)毒素制備幼兔發(fā)熱模型。本實驗各組幼兔在內(nèi)毒素注射后1 h內(nèi)體溫均顯著升高，均成功復制發(fā)熱幼兔模型。

小兒推拿作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)外治法，臨床療效顯著，但臨床治療仍缺乏規(guī)范的手法操作標準，且手法的治療量主要依靠施術者自身經(jīng)驗決定推拿手法類別、力度、頻率及時間[20]。操作時長作為手法刺激量的基本要素，不僅是推拿起效的關鍵，也是建立推拿標準化操作基本元素，故對手法刺激量進行規(guī)范化、量化研究，有利于操作者控制手法質(zhì)量，提高臨床療效，促進推拿標準化進程[21]。近年來，關于推拿手法的量化研究日益增多，但多數(shù)推拿手法研究以生物力學研究為主[22]，而忽略了手法操作時長與臨床療效的關系。在早期推拿治療時間的探討中，有學者認為手法要在體內(nèi)產(chǎn)生多種生理、生化或物理效應，在每一個穴位的操作時間需要維持2～5 min[19]。但彭筱[23]研究發(fā)現(xiàn)，單獨操作清天河水、退六腑穴5 min左右并無顯著退熱效果，故目前手法操作時長并無統(tǒng)一的指導標準。天河水穴是小兒推拿中常用的退熱穴位[24]，臨床及實驗研究均已證實該穴的退熱功效[25]?；谔旌铀藷崾址ǖ呐R床療效，本研究針對劉氏小兒推拿流派特色退熱技法之一“大推天河水”，開展手法量效研究，探討可產(chǎn)生最佳退熱效應的推拿時長。本實驗從體溫上升高度和退熱時間兩方面進行比較，結果顯示，大推天河水5 min、大推天河水10 min、布洛芬對發(fā)熱幼兔均具有一定的降溫作用，但大推天河水10 min退熱效果顯著優(yōu)于大推天河水5 min；且大推天河水10 min組幼兔退熱時間短于布洛芬組、大推天河水5 min組及模型組。表明大推天河水5 min即可發(fā)揮退熱效應；從手法量效分析，大推天河水10 min組的退熱效果更為顯著，起效時間明顯優(yōu)于大推天河水5min組。

哺乳動物的下丘腦內(nèi)含有豐富的單胺類物質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作為溫度敏感神經(jīng)元活動的神經(jīng)化學基礎，參與機體體溫調(diào)節(jié)[26]。常見的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要有5-HT和NE。5-HT作為中樞內(nèi)源性解熱分子，可抑制發(fā)熱，而NE含量增加可促使發(fā)熱[27]，故5-HT和NE的動態(tài)平衡是維持體溫恒定的關鍵[28]。研究發(fā)現(xiàn)三葉青提取物可有效調(diào)節(jié)體溫調(diào)節(jié)中樞介質(zhì)5-HT、NE的含量，從而緩解大鼠的發(fā)熱癥狀[29]。內(nèi)毒素等致熱源通過影響中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，可引起發(fā)熱。本實驗結果顯示，大推天河水10 min可顯著增加下丘腦5-HT含量，降低NE含量，維持下丘腦5-HT與NE的動態(tài)平衡。這與現(xiàn)已證實的體溫調(diào)節(jié)的單胺學說一致。但大推天河水5min對下丘腦5-HT、NE的調(diào)控作用并不明顯，故基于大推天河水不同操作時長對下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)差異，我們推測大推天河水10 min退熱療效更為顯著的原因與其調(diào)控下丘腦5-HT、NE動態(tài)平衡相關。有研究[30]發(fā)現(xiàn)，兔腦室內(nèi)注入5-HT可引起體溫下降，但在貓、狗、猴等動物腦室注射5-HT反而出現(xiàn)使體溫上升，這種因動物種屬差異引起的神經(jīng)遞質(zhì)差異至今仍存在。洪倩等[31]研究發(fā)現(xiàn)，金振口服液具有解熱作用，能降低酵母致大鼠發(fā)熱模型下丘腦中5-HT含量，升高下丘腦中NE含量。本實驗結果表明，大推天河水10 min組幼兔下丘腦中5-HT含量高于模型組（P＜0.01），NE含量均低于模型組（P＜0.01）。由此可知，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的表達差異可能與動物種屬密切相關，但不論是哪一種遞質(zhì)升高或降低，都將引起不同程度的體溫變化。

綜上所述，大推天河水5 min、大推天河水10 min與布洛芬對內(nèi)毒素性發(fā)熱幼兔均有退熱作用，但大推天河水10 min的退熱效果及退熱時間優(yōu)于大推天河水5 min及布洛芬。由此可知，大推天河水操作時長的疊加與療效密切相關，操作時長與退熱效應相關，即增加推拿干預時間，退熱效應明顯提高；大推天河水10 min組的退熱療效可能與調(diào)控下丘腦5-HT與NE的動態(tài)平衡相關。

本研究的不足在于，研究組設立較少、觀察時長較短，只涉及疊加量效對比而未對等量手法操作及手法操作頻率進行量效比較，故后續(xù)研究將探討大推天河水等量手法操作及手法操作頻率與其療效的關系，以期為臨床運用劉氏小兒推拿“大推天河水”手法治療小兒發(fā)熱提供可參考的量效依據(jù)。