聶妍琦,傅旖靈,劉孜琦,陸 夢,郁 潔,雷曉明

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208)

中風(fēng)又名腦卒中,是世界第二大死因和腦血管疾病主要致殘原因,由于人口老齡化,其發(fā)病率正在逐年上升[1]。其中缺血性腦卒中占全球中風(fēng)患者的71%,且致殘率極高[2]。目前,西醫(yī)對缺血性腦卒中的早期治療以溶栓恢復(fù)血流為主,受治療時間窗嚴格限制且缺乏特效藥[3]。而再灌注恢復(fù)血流后,會出現(xiàn)腦組織損傷程度迅速增加的情況,稱為腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。腦缺血再灌注發(fā)生后,誘發(fā)細胞損害的機制主要有線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和血腦屏障損害等,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的細胞凋亡反應(yīng),在CIRI中占據(jù)重要地位[4]。

研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶1α(IRE1α)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細胞凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵啟動因子,它的激活與細胞凋亡造成的腦損傷密切相關(guān)[5-6]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是IRE1α信號通路的下游靶點,處于該凋亡通路的中心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α/TRAF2/ASK1通路能有效抑制細胞的凋亡[7-9]。半胱氨酸蛋白水解酶12(Caspase-12)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α通路中扮演著凋亡啟動子和效應(yīng)子的角色。已有研究發(fā)現(xiàn),通過抑制Caspase-12的表達能有效減少腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡,減輕再灌注后損傷[9-10]。由此可見,IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12信號通路異常是腦缺血再灌注凋亡損傷的重要原因之一。

本課題組以往實驗證實[11],電針可以通過抑制腦缺血再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Caspase-12蛋白表達來抑制細胞凋亡,但是具體作用機制不明。本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,擬從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12凋亡信號通路角度,初步探討電針治療腦缺血再灌注的作用機制,為將來臨床治療缺血性腦卒中提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

動物實驗經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準[編號:SCXK(湘)2021-0001]。選取10～12周齡健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g[由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(湘)2021-0006]。實驗環(huán)境:溫度24～26 ℃,濕度50%～70%,人工12 h晝/夜循環(huán)照明,分籠飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按隨機數(shù)字表法隨機分為4組,即假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、針刺組(C組)和依達拉奉組(D組),每組15只。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 便攜電子針灸治療儀SDZ-Ⅱ型(蘇州華佗);一次性無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,蘇州華佗);熒光顯微鏡(DMIL LED,美國徠卡);石蠟切片機(RM2235,美國徠卡);高速冷凍離心機(iCEN-24R,杭州奧盛);生物組織包埋機-冷凍機(TB-718L,湖北泰維);恒溫烘箱(DHG-9023A,上海一恒)。

1.2.2 試劑 依達拉奉注射液(安徽國瑞);青霉素鈉(哈爾濱哈藥);MCAO線栓(2634-50A4,北京西濃);戊巴比妥鈉(P3761,上海Sigma-Aldrich);4%多聚甲醛(BL539A,北京白鯊易);PVDF轉(zhuǎn)移膜(IPVH00010,美國Millipore);RIPA(強)組織細胞快速裂解液(R0010,北京solarbio);BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020,北京solarbio);K溶液(P1120,北京Solarbio);伊紅(E8090,北京Solarbio);蘇木素(G1004,武漢Servicebio)。

1.3 MCAO模型制備

參照傳統(tǒng)的LONGA[12-13]法改良方法,術(shù)前24 h禁食不禁水,稱體質(zhì)量后予以2%濃度的戊巴比妥鈉,按0.3 mL/100 g進行腹腔注射麻醉。仰臥位固定大鼠于清潔鼠板上,頸部皮膚備皮消毒,偏右做縱行切口,鈍性分離肌肉組織,暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈,于頸總動脈近心、遠心端和頸內(nèi)外動脈處掛無菌一次性棉線備用,使用無菌的顯微動脈夾在近端夾閉頸內(nèi)動脈,頸總近心端及頸外動脈結(jié)扎,在頸總動脈上,距分叉口3 mm處剪一細小切口,將MCAO栓線經(jīng)切口緩慢依次插入頸總、頸內(nèi)動脈,以栓線上黑色標記點(距端頭18.0 mm處)剛好到達頸內(nèi)與頸外動脈分叉處,且進線遇輕微阻力時停止進線,固定線栓,局部青霉素(0.2萬U/只)消毒創(chuàng)口,縫合傷口并留線栓多余部分于皮外,碘伏消毒。大約1 h后將線栓拔出行再灌注,術(shù)后注意保暖,及時觀察大鼠情況。于大鼠蘇醒即刻進行神經(jīng)功能缺損評分,以1～3分為造模成功的標準。

1.4 干預(yù)方法

電針組參照《實驗針灸學(xué)》[14]與《大鼠穴位圖譜的研制》[15]定位取穴,選取大鼠“百會”和左側(cè)“內(nèi)關(guān)”,以醫(yī)用0.25 mm×13 mm毫針30°斜刺刺入穴位,華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀正負極接大鼠“百會”和左側(cè)“內(nèi)關(guān)”。刺激參數(shù):疏密波(疏波20 Hz,密波100 Hz,電流1 mA);刺激時間30 min。在大鼠麻醉蘇醒即刻進行第1次電針,隨后每12 h電針1次,共5次。

假手術(shù)組、模型組和依達拉奉組大鼠在同時間段捆綁固定。依達拉奉組取依達拉奉注射液20 mL∶30 mg(安徽國瑞),以生理鹽水稀釋配制成1 mg/mL的濃度。在大鼠麻醉蘇醒即刻腹腔注射依達拉奉0.6 mg/kg。此后每12 h注射1次,共5次。假手術(shù)組、模型組和針刺組在同時間段注射等量生理鹽水。

1.5 指標以及檢測方法

1.5.1 LONGA 5級標準評分法評價大鼠神經(jīng)功能情況 采用LONGA 5級標準評分法[12],動物蘇醒后即刻視為0 h,評分1次,之后在24 h、48 h進行評分。具體評分標準為:0分-無神經(jīng)功能缺損狀況;1分-不能完全伸展左前肢;2分-向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分-行走時向左側(cè)傾倒;4分-不能自發(fā)行走且意識喪失。

1.5.2 HE染色法觀察大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)病理形態(tài)學(xué)變化 末次干預(yù)完成后,每組隨機選取3只大鼠,稱重后按0.3 mL/100 g予以2%的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉,斷頭后小心切取并分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)(大腦縱裂到大腦外側(cè)溝皮層上1/3),取0.3 cm×0.3 cm大小的方塊,放入4%多聚甲醛中固定48 h,隨后進行梯度脫水、石蠟包埋,并用切片機制成4 μm厚切片。水浴展片及烤片,每只大鼠隨機選取3張切片,進行HE染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察采集樣本相關(guān)部位,觀察缺血側(cè)大腦皮質(zhì)的組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5.3 TUNEL染色觀察大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)細胞凋亡情況 每組隨機選取1張上述4 μm厚的石蠟切片,水浴展片,65 ℃恒溫烘箱中烤片1 h,二甲苯浸泡脫蠟3次,每次15 min,將脫蠟后的切片放置于梯度濃度的酒精進行水化,蛋白酶K工作液于37 ℃中孵育15 min;加入TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上,在濕盒、暗室中加蓋37 ℃孵育60 min,PBS沖洗3次,加入50 μL POD工作液,按以上方式重復(fù)孵育30 min并沖洗,加入50 μL DAB底物,室溫孵育約10 min并沖洗3次,隨后蘇木素復(fù)染封片處理。光學(xué)顯微鏡下觀察,以棕黃色顆粒為凋亡陽性表達,每張切片電鏡下隨機選擇5個非重復(fù)視野,統(tǒng)計棕染凋亡細胞數(shù)和細胞的總數(shù),計算凋亡率為(棕染凋亡細胞數(shù)÷細胞總數(shù))×100%。

1.5.4 Western blotting法檢測大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12蛋白表達 選取各組剩余的12只大鼠,按上述取材方法取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)約100 mg,置于-80℃冰箱凍存。取凍存腦組織,剪碎,加入 PIPA 用勻漿器于冰上充分勻漿至完全裂解,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清液備用;然后將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中,BCA法測定蛋白濃度;根據(jù)蛋白定量結(jié)果取20 μg/孔上樣,緩沖液沸水浴15 min;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜;脫脂牛奶封閉過夜;隨后加入1∶1 000稀釋的IRE1α、TRAF2、ASK1、Caspase-12及GAPDH一抗室溫孵育1 h;取出一抗PBST漂洗3×15 min;以相同稀釋倍數(shù)HRP標記的二抗,室溫孵育1 h,PBST漂洗3×15 min;ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測、顯影和定影。凝膠成像儀掃描分析,以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度比值代表相關(guān)蛋白的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

0 h,與假手術(shù)組比較,模型組、依達拉奉組和針刺組神經(jīng)功能評分均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示造模成功;24 h,與模型組比較,針刺組大鼠神經(jīng)功能評分降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);48 h,與模型組比較,針刺組和依達拉奉組大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);針刺組與依達拉奉組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

2.2 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)病理形態(tài)學(xué)比較

假手術(shù)組電鏡下細胞排列整齊、分布均勻,胞漿豐富、胞核淡染,核仁清晰,未見病理性損傷;模型組細胞層次紊亂,神經(jīng)元嗜酸性變,胞核固縮、深染,核仁不清,尼氏體消失,小膠質(zhì)細胞增多,病理損傷嚴重;針刺組較模型組病變情況顯著改善,細胞排列較為規(guī)整,可見較多結(jié)構(gòu)完整、核仁清晰的神經(jīng)元;依達拉奉組較模型組病變情況減輕,有少量神經(jīng)元嗜酸性變,但細胞排列規(guī)整,可見結(jié)構(gòu)完整、核仁清晰的神經(jīng)元。見圖1。

2.3 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)細胞凋亡率比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠細胞棕染細胞核數(shù)量明顯增加,TUNEL染色細胞凋亡率顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,依達拉奉組腦組織細胞棕染細胞核數(shù)量出現(xiàn)了一定程度的減少,TUNEL染色細胞凋亡率降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),針刺組細胞棕染細胞核數(shù)量明顯減少,TUNEL染色細胞凋亡率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)細胞凋亡率比較

2.4 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12表達比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12蛋白表達量均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,針刺組和依達拉奉組大鼠腦組織IRE1α、TRAF2、ASK1、Caspase-12蛋白表達量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與依達拉奉組比較,針刺組大鼠各項指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖3。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.針刺組;D.依達拉奉組。

表3 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12相對蛋白表達

3 討論

缺血性腦卒中在中醫(yī)范疇屬中風(fēng)之內(nèi)風(fēng),病機多為氣血逆亂、腦脈痹阻,治療時應(yīng)以活血化瘀為主。針灸是中醫(yī)的重要治療方法,在腦卒中治療中得到了非常廣泛的運用。世界衛(wèi)生組織也建議把針灸當(dāng)作中風(fēng)的替代性治療手段[16]。本研究取督脈諸陽之會“百會”穴,能開竅醒神、振奮人體陽氣;心包經(jīng)絡(luò)穴“內(nèi)關(guān)”穴,能寧心定志,又是八脈交會穴之一,通于陰維脈,調(diào)理三焦氣機,運行全身氣血。兩穴配伍使用,取百會醒神之功、內(nèi)關(guān)疏通氣血之用,共達開竅醒腦、活血祛風(fēng)之功效。

針灸治療中風(fēng)療效確切,效果明顯,有減少細胞凋亡、減輕神經(jīng)功能缺損狀況、減輕腦水腫和抑制炎癥反應(yīng)等多方面作用[17-19]。依達拉奉是常用的神經(jīng)保護劑,有抗氧化、抑制細胞凋亡的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,針刺組與依達拉奉組大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。電鏡下針刺組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)細胞病理狀況比模型組減輕,棕染細胞核數(shù)量明顯減少,說明電針能促進CIRI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù),抑制神經(jīng)元細胞的凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷。

缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷機制復(fù)雜,其中腦部梗死區(qū)域細胞的凋亡是其主要損傷途徑之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是人體的一種重要的自我保護機制,受多重信號反應(yīng)通路的調(diào)節(jié),涉及細胞自噬、凋亡等多種細胞死亡方式[21]。IRE1α是一個位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白,具有激酶和內(nèi)切核酸酶的雙重活性[22-24]。ERS發(fā)生時[25],IRE1與GRP78解離后通過寡聚化和自身磷酸化激活,活化的IRE1和TRAF2結(jié)合激活A(yù)SK1,形成IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物,該復(fù)合物能使Caspase-12前體蛋白自切割,從而形成活化的Caspase-12,引起細胞凋亡。IRE1通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激重要的凋亡通路之一。研究發(fā)現(xiàn)[26],CIRI誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,IRE1、ASK1蛋白迅速激活并大量表達,引起神經(jīng)元細胞凋亡,而IRE1抑制劑可減輕此種病理損傷。TRAF2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路中同樣起著非常重要的作用。腦缺血再灌注發(fā)生時,使用TRAF2抑制劑,能有效抑制神經(jīng)元細胞凋亡,減少腦梗死體積[27-28]。研究發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血再灌注后,IRE1α、TRAF2及ASK1蛋白表達和細胞凋亡率明顯增加,電針干預(yù)后,IRE1α、TRAF2及ASK1蛋白表達均明顯減少,且細胞凋亡率也明顯降低,說明電針能通過抑制IRE1α、TRAF2及ASK1等蛋白的表達抑制細胞的凋亡。

Caspase-12是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡啟動子。近年來研究顯示[[29-30],Caspase-12的激活與多種重要臟器缺血再灌注疾病損傷有關(guān)。Mehmet H[31]發(fā)現(xiàn),對于Caspase-12基因敲除的小鼠,能夠明顯地抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激引起的凋亡,說明通過阻斷Caspase-12能夠抑制ERS介導(dǎo)的凋亡?，F(xiàn)代研究表明[32],在腦卒中急性期,用電針每12 h刺激1次百會穴,能有效抑制CIRI大鼠凋亡因子CHOP、Caspase-12 mRNA表達,說明電針百會可能通過對腦缺血大鼠Caspase-12蛋白表達的干預(yù),發(fā)揮腦組織保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠Caspase-12表達顯著升高,而針刺組此蛋白表達呈現(xiàn)明顯降低的情況,表明針刺可以通過干預(yù)Caspase-12蛋白的表達,抑制Caspase-12途徑介導(dǎo)的凋亡反應(yīng),與既往的研究[33]一致。

綜上所述,電針能抑制CIRI大鼠腦組織細胞凋亡,促進神經(jīng)功能恢復(fù),作用機制可能與下調(diào)IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12通路蛋白有關(guān)。