劉婷婷,陳少宗,趙香順,石運來,于燕南,楊添淞

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究院,山東 濟(jì)南 250355;3.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;5.黑龍江省中醫(yī)藥信息學(xué)重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是臨床常見慢性消化系統(tǒng)疾病,發(fā)病病因可能與腸動力異常、內(nèi)臟感知異常及精神心理刺激等有關(guān)。IBS發(fā)病率呈逐年上升趨勢且病程纏綿難愈,影響患者日常生活質(zhì)量[1],目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)根據(jù)主要癥狀進(jìn)行藥物干預(yù)治療,但治療效果不佳[2-3];越來越多研究以及Meta分析結(jié)果證實,針灸治療IBS具有優(yōu)勢,即可調(diào)節(jié)因胃腸道運動功能紊亂引起的便秘、腹瀉等癥狀,又可以緩解或降低因內(nèi)臟敏感引發(fā)的腹部不適等癥狀,相較于常規(guī)藥物治療效果更加顯著且復(fù)發(fā)率較低[4-6],根據(jù)課題組前期經(jīng)驗,本研究運用急慢性應(yīng)激聯(lián)合方法制備IBS動物模型,觀察電針“天樞”“上巨虛”對IBS模型大鼠結(jié)腸功能(感覺、運動)的影響,探討電針治療IBS可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 選用體質(zhì)量(200±20)g的雄性清潔級Wistar大鼠,由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號:SCXK(魯)2019-0003]。所有大鼠于清潔級實驗室中飼養(yǎng),保持室內(nèi)安靜,室內(nèi)溫度為(22±2)℃,室內(nèi)相對濕度為35%～40%,12/12 h晝夜節(jié)律循環(huán),黑夜時間水和食物均可自由攝取。在研究進(jìn)行前,大鼠在標(biāo)準(zhǔn)實驗環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,不予任何刺激。

1.1.2 主要實驗器材 針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);一次性無菌注射器(山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司);冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司);高速離心機(jī)(山東奧恒生物科技有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京開源國創(chuàng)科技有限公司);全自動酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(VILBER LOURMAT,Fusion solos S);旋渦混合器(北京開源國創(chuàng)科技有限公司);恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.1.3 主要實驗試劑 甘油(上海北諾生物科技有限公司,#1280ML100);生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H37022337);BCA蛋白濃度測定試劑盒、轉(zhuǎn)膜緩沖液、抗體稀釋液和超敏ECL顯影液(山東思科捷生物技術(shù)有限公司,#EC0001、#ED0001、#ED0014及#ED0015);蛋白預(yù)制膠(南京艾思易生物科技有限公司,#F00001GelS);預(yù)染蛋白Marker(美國Thermofisher公司,#26616);兔抗GAPDH單克隆(美國Proteintech公司,#10494-1-AP);兔抗NK-1R單克隆抗體(美國SAB公司,#41243);HRP-山羊抗兔IgG(H+L)抗體(美國Proteintech公司,#SA00001-2);大鼠SP ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司,#JYM0328)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 實驗按照隨機(jī)原則,將大鼠分為空白組和造模組,造模組大鼠采用慢性應(yīng)激和急性應(yīng)激聯(lián)合法制備IBS模型。參照文獻(xiàn)方法[7-8],將大鼠暴露不同的壓力源:①慢性避水應(yīng)激1 h;②斷食24 h;③斷水24 h;④晝夜顛倒12 h;⑤冰水游泳5 min;⑥鼠籠45°傾斜;⑦夾尾5 min。慢性避水應(yīng)激方法于每日上午進(jìn)行,下午隨機(jī)使用其他任何應(yīng)激方法,連續(xù)干預(yù)造模10 d。

1.2.2 模型評價 造模10 d結(jié)束后,對造模組大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張(Colorectal distention,CRD)時進(jìn)行腹壁撤回反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)半定量的評分[9-10],為了減少大鼠糞便形成,實驗開始前對所有大鼠禁食不禁水18 h。用自制的球囊(長9 cm、寬3 cm)于石蠟潤滑之后經(jīng)導(dǎo)管緩慢插入直腸,深度大約6～7 cm。把大鼠放到一個透明并內(nèi)部空間相對狹窄的觀察箱,導(dǎo)管另一端用三通管分別連接血壓計和30 mL醫(yī)用注射器,待大鼠在透明箱內(nèi)適應(yīng)并平靜之后,通過注射器緩慢向氣囊注入空氣,血壓計顯示40 mmHg,間隔5 min后給下一次刺激;每次刺激強(qiáng)度重復(fù)3次,取平均值作為最后的評分。在整個操作過程中保證自制球囊無破損、不漏氣,操作人員固定,確保大鼠AWR評分的相對客觀性和統(tǒng)一性。

每天記錄大鼠在1 h的慢性避水應(yīng)激后大便顆粒數(shù),與空白組比較,AWR半定量評分≥3分以及造模組大鼠大便顆粒數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義,即判定大鼠造模成功。

1.2.3 分組與干預(yù) 繼AWR評分后,將造模組確定制備成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和電針組(天樞組、上巨虛組),每組各10只,分組后對大鼠進(jìn)行電針治療。穴位定位參考華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》[11]以及郭義等主編的《實驗針灸學(xué)實驗指導(dǎo)》[12]中大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜,參照人體經(jīng)穴定位取“天樞”和“上巨虛”。將電針組大鼠進(jìn)行抓取、捆綁,選用0.25 mm×13 mm毫針對大鼠雙側(cè)天樞和上巨虛進(jìn)行針刺,進(jìn)針深度分別為3 mm和5 mm,接上電針治療儀,電針參數(shù)設(shè)置為頻率2 Hz、強(qiáng)度1 mA的連續(xù)波,1次/d,20 min/次,針刺14 d?？瞻捉M大鼠正常喂養(yǎng),不做任何處理,模型組大鼠僅每天與電針組大鼠使用相同方法進(jìn)行抓取、捆綁,但不給予電針干預(yù)。

1.2.4 觀察指標(biāo) ①結(jié)直腸痛敏測定:實驗開始前,為了減少糞便的形成,對各組大鼠禁食不禁水24 h。大鼠腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉,大鼠麻醉后將其取仰臥位,處理大鼠腹部皮毛,沿大鼠腹正中線與髂前上棘連線處進(jìn)行常規(guī)消毒,剪開皮膚并剝離開皮下脂肪,暴露腹直肌。借用1.5 mL針頭使兩根電極絲植入到距腹正中線1.5 cm處。再將石蠟潤滑后的自制氣囊經(jīng)大鼠肛門插入6～7 cm處,用醫(yī)用膠帶把大鼠尾巴根部和導(dǎo)管纏在一起以防滑脫。給氣囊緩慢注氣后,通過置于腹直肌的兩根電極引出肌電信號。運用Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng),觀察并記錄各組大鼠腹直肌放電活動。②血清測定:待大鼠腹外斜肌放電測定后,迅速剪開大鼠胸腔完全暴露心臟及主動脈。先借用無菌針管抽取3 mL大鼠右心耳血液,室溫靜置30 min后進(jìn)行離心,取上清快速移至-80 ℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清SP含量,具體步驟參考試劑盒操作說明。③結(jié)腸NK-1R受體表達(dá)測定:待大鼠取血在室溫靜置過程中,迅速進(jìn)行常規(guī)生理鹽水灌注,每只大鼠灌注200～300 mL生理鹽水,直至大鼠四肢發(fā)白。在冰上快速取出結(jié)腸,沖洗干凈腸容物,快速置入EP管并移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測各組樣本的蛋白表達(dá),每組大鼠隨機(jī)分別抽取4個樣本,提取總蛋白,充分剪碎組織后,低溫高通量組織研磨器研磨,冰浴30 min,然后4 ℃離心。BCA法測定蛋白濃度,取30 μg蛋白上樣量,按上樣蛋白體積與5×上樣緩沖液4∶1的比例混合,金屬浴100 ℃,煮10 min蛋白變性。將各組蛋白上樣,電泳60 min,轉(zhuǎn)膜70 min,5%奶粉封閉2 h,TBST清洗3次×10 min,孵育一抗,室溫30 min,4 ℃過夜;TBST清洗3次×10 min,孵育二抗,室溫1.5 h,TBST清洗3次×10 min。運用凝膠成像系統(tǒng)自動曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 電針對各組大鼠結(jié)直腸痛敏的影響

與空白組比較,模型組大鼠的結(jié)腸疼痛閾值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);電針干預(yù)治療結(jié)束后與模型組比較,電針天樞組以及上巨虛組大鼠結(jié)腸疼痛閾值均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠疼痛閾值的測定

2.2 電針對各組大鼠血清P物質(zhì)的影響

與空白組大鼠比較,IBS模型組大鼠血清SP含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),電針干預(yù)治療后,電針天樞組以及上巨虛組血清SP均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清SP和NK-1R蛋白表達(dá)量的測定

2.3 電針對各組大鼠結(jié)腸蛋白表達(dá)的影響

對大鼠近端結(jié)腸NK-1R蛋白檢測顯示,與空白組比較,模型組大鼠的蛋白表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);干預(yù)治療后與模型組比較,電針天樞組以及上巨虛組蛋白表達(dá)均降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠結(jié)腸中NK-1R受體蛋白免疫印跡圖

3 討論

腸易激綜合征是臨床常見慢性胃腸道功能紊亂疾病,臨床表現(xiàn)主要是腸道運動功能異常和內(nèi)臟高敏感性兩方面癥狀改變[13-14],目前臨床和基礎(chǔ)研究普遍把內(nèi)臟高敏感和腸道運動功能紊亂看做病理生理學(xué)基礎(chǔ)[15]。結(jié)腸高敏感性主要以腹脹、腹痛等為主要癥狀表現(xiàn);結(jié)腸運動功能紊亂由結(jié)腸平滑肌收縮異常導(dǎo)致排便習(xí)慣和大便性狀改變等為主要癥狀表現(xiàn)。本研究采用慢性應(yīng)激和急性應(yīng)激聯(lián)合法制備IBS模型,從軀體和精神兩方面對大鼠進(jìn)行雙重刺激,增強(qiáng)IBS大鼠模型的持續(xù)性和穩(wěn)定性,更貼近IBS患者的臨床癥狀。

P物質(zhì)廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[16],通過與SP高親和力受體(SPR)結(jié)合對靶細(xì)胞發(fā)揮生物效應(yīng)從而調(diào)節(jié)胃腸功能[17]。在胃腸道中,SP受體包括神經(jīng)激肽1型受體(NK-1R)、神經(jīng)激肽2型受體(NK-2R)和神經(jīng)激肽3型受體(NK-3R)。SP通過NK-1R、NK-3R受體對胃腸平滑肌細(xì)胞靶細(xì)胞發(fā)揮生物效應(yīng),調(diào)節(jié)胃腸道感受功能、平滑肌的肌肉運動,促進(jìn)平滑肌收縮,加速胃腸蠕動[18-19]。Lu等[20]研究表明,慢性避水應(yīng)激方法制備IBS大鼠模型血清SP含量升高;姚永剛等[21]研究結(jié)果顯示,與正常組相比IBS大鼠模型結(jié)腸SP-NK1R受體mRNA的表達(dá)明顯增加,免疫組化結(jié)果顯示NK-1R受體在結(jié)腸黏膜層以及肌層的分布區(qū)呈顯著濃染。本實驗結(jié)果顯示,與正常組大鼠相比,模型組大鼠結(jié)腸痛敏閾值降低(P<0.01),血清SP含量升高(P<0.05),結(jié)腸SP-NK1R受體蛋白表達(dá)升高(P<0.05),研究結(jié)果表明血清SP含量和結(jié)腸中SP-NK1R受體蛋白表達(dá)異常會影響IBS模型大鼠結(jié)腸功能,并且電針天樞、上巨虛可降低IBS模型大鼠結(jié)腸痛敏閾值以及調(diào)節(jié)結(jié)腸運動功能異常。

目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對IBS的治療尚無特效療法,越來越多實驗證實針灸在IBS內(nèi)臟痛的干預(yù)治療有顯著的療效,主要通過刺激經(jīng)絡(luò)以及各種神經(jīng)組織,激發(fā)機(jī)體鎮(zhèn)痛系統(tǒng)從而達(dá)到鎮(zhèn)痛效果[22-24]。中醫(yī)學(xué)根據(jù)臨床表現(xiàn)癥狀將IBS歸屬于“泄瀉”“便秘”“腹痛”等范疇,《靈樞·邪氣藏府病形》記載:“飧泄,大腸痛,巨虛上廉主之”;《針灸大全》記載:“腹中寒痛,泄瀉不止,里急后重,天樞二穴”。從神經(jīng)解剖學(xué)角度分析,胃腸道平滑肌活動是接受交感神經(jīng)(T9～12)和副交感神經(jīng)(S2～4)的雙重支配[25-27],天樞穴的軀體傳入信號主要投射到T9～11[28],上巨虛神經(jīng)支配主要來源于L4～S1神經(jīng)節(jié)段[25],天樞穴和上巨虛穴的神經(jīng)支配與胃腸道的神經(jīng)支配在脊髓水平高度重疊,刺激天樞和上巨虛穴可將信號直接投射于大腸的神經(jīng)節(jié)段分布區(qū)。秦慶廣等[29]研究顯示,上巨虛為集元穴,針刺集元穴信息通過神經(jīng)通路到達(dá)脊髓中樞,激活用來支配空腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的副交感神經(jīng)系統(tǒng),進(jìn)而刺激空腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸運動[30-32],針刺天樞通過增強(qiáng)交感神經(jīng)興奮水平,以此激活腎上腺素能β1/2受體,進(jìn)而對結(jié)腸運動產(chǎn)生效應(yīng)[33-34]。因此,傳統(tǒng)中醫(yī)理論和神經(jīng)生物學(xué)理論都能表明針灸天樞和上巨虛治療IBS的科學(xué)性和可靠性。

綜上所述,電針天樞和上巨虛可通過降低血清SP含量以及遠(yuǎn)端結(jié)腸SP受體NK-1R蛋白表達(dá),緩解IBS大鼠模型內(nèi)臟敏感性,調(diào)節(jié)IBS大鼠結(jié)腸感覺和運動功能異常。