楊若兮，張鑫，趙丹,3

（1黑龍江大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心/黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點實驗室/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；2長春金賽藥業(yè)有限責任公司，長春 130012；3河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點實驗室，河北秦皇島 066102）

0 引言

甘露聚糖是一種結(jié)構(gòu)復雜的生物聚合物，由于粘度高等特點，難以被人體直接消化利用。β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78,β-mannanases，以下簡稱甘露聚糖酶）可以從甘露聚糖分子主鏈的內(nèi)部隨機水解β-1,4 糖苷鍵[1]，降解甘露聚糖。魔芋粉的主要成分是魔芋葡甘露聚糖(Konjac glucomannan,KGM)，由甘露糖和葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵鍵合而成，是一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維[2]。KGM作為一種潛在的益生元，具有降低體重和預防糖尿病等生理功效，在食品工業(yè)中得到廣泛應用[3]。魔芋葡甘低聚糖(Konjac oligo-glucomannan,KOGM)是降解KGM 形成的功能性低聚糖，作為一種重要的益生元，由于其原料易得、成本低廉等特點，具有良好的發(fā)展前景[4]。

微生物來源的酶具有產(chǎn)酶活性高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。常見產(chǎn)酶真菌有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)及木霉屬(Trichoderma)等[5-6]。與真菌相比，細菌發(fā)酵周期短，大多分泌胞外甘露聚糖酶，穩(wěn)定性更高[7-8]，使酶的分離純化更容易[9]。大腸桿菌(Escherichiacoli)的遺傳背景清晰，同時具有培養(yǎng)簡單、生長迅速等特點，是優(yōu)良的原核表達宿主[10]。至今已有不同來源的甘露聚糖酶基因被成功地從微生物中克隆并在異源表達菌株中獲得了重組酶[11-12]。張丹陽等[13]從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)G1 中克隆出β-甘露聚糖酶基因BsmanA，將該基因與表達載體pACYCDuet-1 連接并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，實現(xiàn)β-甘露聚糖酶基因的異源表達。目前研究較多的微生物有芽孢桿菌屬(Bacillus)等，但此類微生物安全性較低。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)作為公認的安全(generally recognized as safe,GRAS)菌株[14]，它直接分泌的胞外甘露聚糖酶具有安全保障[5,15-16]。目前已報道的直接產(chǎn)LAB 甘露聚糖酶菌株有干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)HDS-01、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)M17、植物乳桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)M24、綠色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)LB37 和植物乳桿菌(L.plantarum)ATCC?14917TM[17]。天然LAB 產(chǎn)甘露聚糖酶存在產(chǎn)量較低，難以滿足工業(yè)化應用需求。乳酸菌作為革蘭氏陽性細菌，轉(zhuǎn)化困難，遺傳改造難度大，因此現(xiàn)有研究集中在這些菌株甘露聚糖酶蛋白的純化、性質(zhì)和應用，尚未涉及蛋白編碼基因。

本研究以課題組前期分離自酸菜發(fā)酵液的一株產(chǎn)甘露聚糖酶的L.caseiHDS-01 為出發(fā)菌株[18]，該菌株已完成全基因組測序（登錄號：CP001084.2）。將L.caseiHDS-01 全基因測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知甘露聚糖酶氨基酸序列進行本地BLAST比對，獲得序列相似性較高的基因，基因組中編號為2884（以下稱為基因M1），預測功能為甘露糖苷酶。甘露糖苷酶屬于糖苷水解酶家族，推測有甘露聚糖酶活性。本研究首次將LAB甘露聚糖酶基因異源表達，以重組菌株的產(chǎn)酶效果和重組酶對KGM的降解效果驗證甘露聚糖酶基因的功能。研究結(jié)果為乳酸菌甘露聚糖酶基因的遺傳修飾和甘露聚糖酶蛋白的定向改造提供依據(jù)，也拓展了人們對乳酸菌聚糖代謝能力的認識。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒L.caseiHDS-01，分離自酸菜發(fā)酵液，作為出發(fā)菌株；E.coliDH5α，購于上海唯地生物技術(shù)，用于克隆轉(zhuǎn)化；E.coliBL21(DE3)，購于上海唯地生物技術(shù)，作為重組蛋白表達的宿主。質(zhì)粒pET-28a，長度為5369 bp，有卡那霉素抗性基因(Kanr)，T7啟動子，T7 終止子，6×His 標簽，受IPTG 調(diào)控表達，由本實驗室保存，在試驗中作為重組蛋白表達載體；pET28a-M1，長度8051 bp，有卡那霉素抗性(Kanr)，帶有M1基因片段(2640 bp)，由本實驗室自行構(gòu)建，用于表達重組蛋白M1。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）MRS培養(yǎng)基：牛肉膏1 g，蛋白胨1 g，葡萄糖2 g，酵母提取物0.5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，檸檬酸銨0.2 g，無水亞硫酸鈉0.01 g，硫酸鎂0.02 g，無水乙酸鈉0.5 g，硫酸錳0.005 g，吐溫-80 0.1 mL，蒸餾水0.1 L；pH 5.5，于121℃條件下滅菌15 min。

（2）LB培養(yǎng)基：蛋白胨0.1 g，酵母提取物0.5 g，氯化鈉0.1 g，蒸餾水0.1 L；pH 7.0，于121℃條件下滅菌15 min。

（3）魔芋粉產(chǎn)酶培養(yǎng)基(KGM)：魔芋粉0.6 g，牛肉膏0.1 g，蛋白胨0.1 g，葡萄糖0.1 g，酵母浸粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，檸檬酸銨0.2 g，無水亞硫酸鈉0.01 g，硫酸鎂0.02 g，無水乙酸鈉0.5 g，硫酸錳0.005 g，吐溫-80 0.1 mL，蒸餾水0.1 L；pH 5.5，121℃滅菌15 min。

1.2 基因M1異源表達菌株的構(gòu)建

1.2.1 基因M1片段的獲取和重組質(zhì)粒pET28a-M1的構(gòu)建根據(jù)L.caseiHDS-01基因組測序結(jié)果中的基因M1序列及表達載體pET-28a設計引物如下：M1-up，序列(5’→3’)為gtgccgcgcggcagccatatg ATGCAGAAA GTTCATGTTA TTGCC；M1-down，序列(5’→3’)為accagtcatgctagccatat gTCATAACGACTCCTTTTTCGATGC。

PCR 反應體系：Mix (green) 45 μL、基因組DNA 1 μL、M1-up 2 μL、M1-down 2 μL，經(jīng)98℃預變性2 min，后經(jīng)98℃變性10 s、60℃退火15 s、72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃終延伸5 min?；厥漳康钠?。利用限制性內(nèi)切酶NdeI 對表達質(zhì)粒pET-28a 進行單酶切，以獲得與DNA片段含有15～20 bp互補末端的線性化載體。

酶切體系：限制性內(nèi)切酶NdeI 1 μL、質(zhì)粒pET-28a 1 μL、Cutsmart buffer 5 μL，37℃反應30 min。瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化線性化載體，將線性化載體做數(shù)個梯度稀釋，原液和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL上樣進行電泳，與標準的DNA 定量Marker 比較條帶亮度以確定其近似濃度。

線性化載體和純化后M1片段按比例混合后在重組酶Exnase II 催化下實現(xiàn)兩線性化DNA 的體外環(huán)化。采用熱激法將重組反應體系轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。以添加終濃度為100μg/mLKan的LB 固體培養(yǎng)基篩選陽性重組克隆。以篩選菌落提取的質(zhì)粒為模板，利用T7-up 和T7-down 為引物進行PCR 驗證及酶切驗證目的基因片段是否正確整合到表達載體上。引物設計如下：

T7-up，序列(5’→3’)為CGATCCCGCGAAATTA ATACGACTC；

T7- down，序列(5’→3’) 為 TCAGCTTCCT TTCGGGCTTTGTTAG。

將含有陽性質(zhì)粒的菌株命名為E.coliDH5αpET28a-M1。

PCR 反應體系：T3 Super PCR Mix 22 μL、Plasmid 1 μL、T7-up1 μL、T7-down 1 μL。

酶切體系：限制性內(nèi)切酶SacI 1 μL、Plasmid DNA 1 μL、Cutsmart buffer 5 μL，37℃反應30 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-M1轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) 用熱激法將重組反應體系轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，以含有Kan濃度為100μg/mL的LB平板中挑取重組子，T7-up和T7-down為引物進行PCR驗證。

將陽性克隆至接種至LB液體培養(yǎng)基（含Kan終濃度為100 μg/mL）中，37℃、150 r/min，搖床培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒提質(zhì)粒進行PCR 驗證及酶切驗證目的基因片段是否正確整合到表達載體上。將驗證后的陽性克隆命名為E.coliBL21(DE3)-pET28a-M1。

PCR 反應體系和酶切體系同E.coliDH5αpET28a-M1。

1.2.3 IPTG誘導重組蛋白M1的表達從陽性菌落平板中挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，加入Kan至終濃度為100 μg/mL，37℃、150 r/min，搖床培養(yǎng)過夜。按1%接種量接入到含有250 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入Kan至終濃度為100μg/mL，37℃、150 r/min，培養(yǎng)2～3 h至OD600為0.6～0.8之間。以0號管為對照組，在其余管中加入150 μL 的IPTG（終濃度50 mmol/L），誘導表達。從每組試管中取0.5 mL 菌液加入到1.5 mL 離心管中，6000 r/min，5 min 去上清，留沉淀。在每支離心管中加入60 μL的1×PBS和15 μL的5×Loading Buffer懸浮沉淀。100℃煮樣10 min。取出后離心6000 r/min，5 min，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

1.3 重組蛋白M1的純化

20 mmol/L PB(pH7.2)，300 mmol/L NaCl 含1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT 的緩沖液洗滌后，使用20 mmol/L PB(Ph 7.2)，300 mmol/L NaCl，8 M Urea，20 mmol/L Imidazole緩沖液溶解包涵體同時平衡Ni-IDA柱，上樣后用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標蛋白。

1.4 重組菌株蛋白M1酶活力的測定

以未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的空菌株為對照，檢測重組菌株的發(fā)酵液上清、菌體破壁后上清、包涵體溶解后上清以及蛋白復性后的上清的甘露聚糖酶活力。

按照公式(1)計算甘露聚糖酶活力[19]。

1.5 重組菌株蛋白M1蛋白含量的測定

采用Bradford法進行蛋白質(zhì)含量的測定[20]。

1.6 高效液相色譜測定酶解糖類物質(zhì)聚合度及含量

將Ni 柱親和層析純化后的重組蛋白M1 置于0.6%魔芋粉的PBS 磷酸緩沖液中，50℃條件下分別反應1、2、3、4、5、6 h。

1.7 數(shù)據(jù)分析及處理

本研究數(shù)據(jù)由3個獨立樣本的平均值及其標準差顯示。繪圖軟件為Origin 2018和SigmaPlot 10.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-M1的構(gòu)建

PCR 擴增結(jié)果如圖1(A)所示，在2600 bp 左右處有單一明亮片段，與預期大小相符。

圖1 L.casei HDS-01M1基因PCR結(jié)果(A)和陽性克隆子質(zhì)粒PCR驗證結(jié)果(B)

使用限制性內(nèi)切酶NdeI 對表達質(zhì)粒pET-28a 進行單酶切，獲得線性化載體，在5400 bp左右處有單一明亮條帶，與預期大小符合。將線性化的pET-28a 載體和M1片段按比例混合后，在重組酶Exnase II 催化下，線性化載體與DNA片段完成體外環(huán)化。重組質(zhì)粒M1的PCR驗證結(jié)果如下：泳道1～4均出現(xiàn)了陽性目的條帶，大小約為2900 bp。結(jié)果表明，M1片段成功整合到了表達載體pET-28a上。

使用質(zhì)粒小提試劑盒提取上述陽性菌株中的重組質(zhì)粒，酶切驗證及PCR 驗證的結(jié)果如下：篩選得到的M1陽性菌株質(zhì)粒的條帶大小約為7900 bp，包含了目的基因M1片段序列，與預期大小相符。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-M1轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)

將重組質(zhì)粒pET28a-M1轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，單菌落PCR 結(jié)果如圖1(B)所示。圖1(B)中泳道1 為空質(zhì)粒pET-28a PCR 的驗證結(jié)果，約為300 bp，泳道2 為重組質(zhì)粒pET28a-M1PCR 驗證結(jié)果，約為2900 bp，與預期大小相符。

2.3 IPTG誘導M1表達與SDS-PAGE電泳分析

圖2(A)為使用IPTG 誘導重組質(zhì)粒表達后的蛋白表達結(jié)果。泳道1 和3 分別為對照菌株E.coliBL21(DE3)發(fā)酵液和發(fā)酵液上清破壁緩沖液的蛋白表達情況。泳道2 和4 分別為對照菌株E.coliBL21(DE3)-pET28a-M1發(fā)酵液和發(fā)酵液上清破壁緩沖液的蛋白表達。泳道2在100 kDa左右出現(xiàn)了清晰的條帶，但與泳道4卻沒有，這說明可能是因為在菌體破碎過程中，重組蛋白M1形成了不溶性的包涵體蛋白。

如圖2(B)所示，重組蛋白M1經(jīng)8 M Urea溶解后，泳道2與對照菌株E.coliBL21(DE3)（泳道1）相比，在100 kDa 左右處出現(xiàn)了清晰的條帶，蛋白分子量與理論值相一致，與圖2(A)結(jié)果共同說明重組蛋白M1 以包涵體的形式表達。

2.4 重組蛋白純化及體外功能驗證

2.4.1 純化M1 重組蛋白E.coliBL21(DE3)-pET28a-M1菌株經(jīng)IPTG誘導、PBS緩沖液重懸菌液、超聲條件下裂解細胞、按包涵體的純化方式純化重組蛋白M1后，收集各個階段組分進行SDS-PAGE 分析檢測（圖3A）。泳道6 為未誘導條件下細胞破碎后的沉淀。泳道7為誘導條件下細胞破碎后的沉淀。泳道7與陰性對照（泳道1）相比在100 kDa附近有特異性條帶，說明M1在細胞破碎后形成包涵體。泳道8為復性后經(jīng)Ni-IDA Resin 樹脂親和層析純化后的蛋白，條帶單一，說明重組蛋白M1純化成功。

圖3 SDS-PAGE分析M1蛋白純化結(jié)果(A)和不同濃度咪唑純化M1重組蛋白(B)

用含有不同咪唑濃度的洗脫液洗脫目的蛋白M1，結(jié)果如圖3(B)所示。不同濃度的洗脫液都可以將目的蛋白M1 洗脫下來，但效果有所差異，其中100 mmol/L 濃度咪唑的洗脫液純化的蛋白條帶顏色最深，效果最好。

2.4.2 重組蛋白M1 酶活力測定如圖4 所示，E.coliBL21(DE3)的發(fā)酵在發(fā)酵液上清中檢測出的酶活較高。E.coliBL21(DE3)-pET28a-M1在離心收集菌體、PBS 緩沖液重懸菌液、超聲裂解細胞、離心收集上清時，酶活達到最大，為31.17±0.55 U/mL。

圖4 基因工程菌株甘露聚糖酶活力測定

2.4.3 重組蛋白M1 蛋白濃度檢測圖5 為相同條件下的重組菌株蛋白濃度變化情況。E.coliBL21(DE3)的蛋白濃度經(jīng)不同處理后，蛋白濃度逐漸降低，表示在整個處理階段，蛋白損失較高。而E.coliBL21(DE3)-pET28a-M1包涵體溶解后上清的蛋白質(zhì)濃度和發(fā)酵液上清的蛋白質(zhì)濃度相當，說明重組蛋白M1 大部分以包涵體形式存在。在復性過程中，重組蛋白M1 的蛋白濃度也出現(xiàn)損失，同時酶活性降低。

圖5 基因工程菌株蛋白濃度測定

2.4.4 糖類物質(zhì)的變化情況重組蛋白M1降解魔芋甘露聚糖的產(chǎn)物有甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖，結(jié)果如圖6 所示。在反應前3 h 中，甘露三糖和甘露四糖的含量明顯高于甘露糖和甘露二糖，證明此時重組蛋白M1降解多聚糖生成三糖和四糖。3 h后，甘露三糖和甘露四糖濃度逐漸降低，甘露糖和甘露二糖濃度逐漸升高。

圖6 重組蛋白M1水解魔芋粉甘露低聚糖濃度變化

多重比較結(jié)果顯示，在反應前3 h，甘露三糖或四糖的濃度顯著高，3 h 后，甘露糖的濃度顯著高。隨著反應的進行，甘露糖和甘露二糖濃度呈逐漸上升，甘露三糖和甘露四糖濃度趨勢呈現(xiàn)先上升后下降，分別在4 h 和2 h 累計濃度達到最高，為27.85±0.03 g/L 和28.17±0.19 g/L。這是由于2 h后甘露三糖在重組酶的降解作用下，被降解為了單糖和二糖，而甘露四糖被降解為了單糖、二糖和三糖。與甘露四糖相比，三糖的變化速度較穩(wěn)定，可能是由于甘露三糖的生成速率和消耗速率差異較小。

3 討論與結(jié)論

利用原核表達載體誘導表達可能導致蛋白合成速度過快，造成錯誤折疊和異常聚積，形成無生物活性、不可溶的包涵體。在本研究中，重組蛋白M1 在表達過程中以包涵體蛋白形式存在，經(jīng)8 M Urea 溶解、親和層析純化和透析復性最終得到了大小為98.72 kDa重組蛋白。馬鑫等[21]將Bacillussp.中的甘露聚糖酶基因與表達載體pET-28a 連接，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，使用IPTG 作為誘導物，37℃培養(yǎng)3 h 表達重組甘露聚糖酶。但SDS-PAGE 分析表明，表達出的重組甘露聚糖酶主要以包涵體形式存在于細胞質(zhì)中。朱涇等[22]利用PCR技術(shù)從硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)P2中擴增得到甘露聚糖酶基因，克隆至E.coli表達載體pET-30a 中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-3007，并轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta。利用IPTG 誘導重組菌株pET-30a-3007，與本研究一致，SDS-PAGE檢測得到的目的蛋白大部分以包涵體形式存在，分子量大小為70 kDa，與預測一致。

基因M1的預測功能為甘露糖苷酶，作為甘露聚糖酶的一種，甘露糖苷酶可以從非還原末端切割甘露聚糖主鏈[23]。ZHANG 等[24]將分離自小麥中的甘露糖苷酶基因(TaMan3A)異源表達在畢赤酵母(Pichia pastoris)中，重組基因可將半乳甘露聚糖和魔芋葡甘露聚糖的甘露聚糖聚合物水解為甘露二糖，甘露三糖和甘露糖，表明甘露糖苷酶具有直接將甘露聚糖降解為低聚糖的能力。使用重組酶水解甘露聚糖不僅能驗證假定甘露聚糖酶的功能，也是制備甘露低聚糖較為常見的一種方法。者園園等[25]從魔芋基地篩選產(chǎn)甘露聚糖酶菌株并克隆甘露聚糖酶基因，通過電轉(zhuǎn)化法至P.pastorisGS115 中實現(xiàn)異源表達重組酶水解魔芋粉的產(chǎn)物組分主要為甘露二糖和甘露三糖。甄紅敏等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與大部分GH26 家族β-甘露聚糖酶不同，PcMan26A 的最小水解底物為甘露五糖，能將甘露五糖水解為甘露糖和甘露四糖，不產(chǎn)生甘露二糖和甘露三糖。郭金玲等[27]利用薄層層析定性分析B.subtilis中甘露聚糖酶的降解魔芋粉的酶解產(chǎn)物主要為三糖及三糖以上的低聚糖。綜上共同說明，來源不同甘露聚糖酶降解相同底物生成的產(chǎn)物和低聚糖含量存在差異。

本研究首次通過異源表達獲得了乳酸菌來源的甘露聚糖酶的重組蛋白，SDS-PAGE 顯示蛋白大小為98 kDa，復性后酶活和蛋白濃度分別為19.24±0.55 U/mL和0.51±0.01 mg/mL。以魔芋粉為底物驗證了重組蛋白降解聚糖的功能，證實了乳酸菌基因組中甘露糖苷酶基因的編碼蛋白具有甘露聚糖酶活性。研究成果有助于推進乳酸菌甘露聚糖酶的食品級工業(yè)化進程。