馬延華 孫德全 李綏艷 林 紅 潘麗艷 范金生 李東林 楊國偉

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所 黑龍江 哈爾濱 150086）

Stock6 是在玉米中發(fā)現(xiàn)的第一個單倍體誘導(dǎo)系，但是由于Stock6 具有很多缺點，如誘導(dǎo)率偏低、散粉性不好、自交結(jié)實性較差、遺傳標(biāo)記較弱等，因此在此基礎(chǔ)上選育了多個更加優(yōu)良的誘導(dǎo)系， 以適應(yīng)各個特定區(qū)域環(huán)境的需要[1-2]。 目前所用的單倍體誘導(dǎo)系幾乎都直接或間接來源于Stock6。我國的玉米單倍體育種盡管起步較晚，但是進展較快。 先后有多家科研單位參與研究， 一直致力于以Stock6 為基礎(chǔ)研究材料， 與其他誘導(dǎo)系或個別性狀強的非誘導(dǎo)系材料進行雜交，采用系譜選系法、回交法、分子標(biāo)記法及轉(zhuǎn)基因輔助手段選育散粉量大、 誘導(dǎo)率高的單倍體誘導(dǎo)系。 其中，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的農(nóng)大高誘1 號填補了我國在這個領(lǐng)域的空白[3]。

黑龍江省地處我國最北端，氣候條件獨特，緯度高，無霜期短，前期氣溫低且干旱、后期降溫快,對玉米種質(zhì)的生態(tài)適應(yīng)性具有特殊的要求。 直接引進的誘導(dǎo)系普遍存在抗逆性差、花粉量少、自身結(jié)實能力差等缺點，很難在實際的玉米育種中大規(guī)模應(yīng)用，從而阻礙了單倍體誘導(dǎo)育種技術(shù)在黑龍江的推廣應(yīng)用。因此，選育適宜寒地生態(tài)條件的優(yōu)良的單倍體誘導(dǎo)系對加快本省乃至我國玉米單倍體育種的工程化進程，推進育種方式的變革具有重要意義。 本研究利用從烏克蘭引進的玉米誘導(dǎo)系EMK-1 與農(nóng)大高誘 5 號構(gòu)建的分離群體為基礎(chǔ)材料，育成了熟期早、誘導(dǎo)率高、遺傳標(biāo)記明顯的新誘導(dǎo)系LY9-3。

1 誘導(dǎo)系LY9-3 的親本來源及選育經(jīng)過

1.1 基礎(chǔ)材料

2011 年從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)引進誘導(dǎo)系農(nóng)大高誘5 號，該誘導(dǎo)系具有籽粒Navajo 標(biāo)記性狀，平均誘導(dǎo)率達到10%[4]。 但在黑龍江省生態(tài)環(huán)境下存在著熟期偏晚、雌雄不調(diào)、自交結(jié)實差等缺陷。 2012 年通過國際合作項目引進的烏克蘭誘導(dǎo)系EMK-1 具有熟期早的特性，在黑龍江省平均誘導(dǎo)率達到9%，但有不抗倒伏、感大斑病等缺點[5]。 因此選擇EMK-1 和農(nóng)大高誘5 號配制群體作為選育新誘導(dǎo)系的基礎(chǔ)材料。

1.2 選育方法

采用系譜法對EMK-1×農(nóng)大高誘5 號群體的后代進行選擇，重點目標(biāo)是選育誘導(dǎo)率高、熟期早、籽粒Navajo 標(biāo)記清楚， 并且農(nóng)藝性狀較好的誘導(dǎo)系。從S1代開始進行單倍體誘導(dǎo)率的測定， 選擇德美亞3 號作為測驗種，收集入選單株的花粉和測驗種進行雜交，每個組合雜交5 穗以上。 對于收獲后的籽粒根據(jù)Navajo 顯性遺傳標(biāo)記所具有的胚乳紫色而胚無紫色判定為“擬單倍體籽?！?。 播種時將所有的擬單倍體單粒點播，根據(jù)田間生長情況進一步判斷其倍性。具體的判斷標(biāo)準(zhǔn)：單倍體表現(xiàn)為植株縮小且為綠色，雄穗多不育；非單倍體表現(xiàn)為植株高大，且為紫色或淡紫色，雄穗可育，自交后有籽粒顏色分離。 將最終剩下的單倍體植株計為準(zhǔn)單倍體株數(shù)。 誘導(dǎo)率的計算公式：

誘導(dǎo)率=準(zhǔn)單倍體株數(shù)/測交總籽粒數(shù)×100%。

1.3 誘導(dǎo)系LY9-3 的選育經(jīng)過

2016 年夏季在哈爾濱以誘導(dǎo)系EMK-1 作母本，農(nóng)大高誘5 號作父本組配雜交F1代基礎(chǔ)材料。2016 年冬季在海南自交EMK-1 和農(nóng)大高誘5 號的雜交F1代，獲得S1籽粒。

2017 年春季挑選300 粒Navajo 標(biāo)記清晰的S1籽粒進行單粒播種, 對于符合選育目標(biāo)的入選單株套袋自交，同時利用該單株的花粉測定誘導(dǎo)率。 S1代中第9 株是誘導(dǎo)率最高且熟期早的單株，具有5.09%的單倍體誘導(dǎo)率。

2017 年在海南，對S1的單株誘導(dǎo)率測定的基礎(chǔ)上選擇誘導(dǎo)率高、籽粒標(biāo)記性狀清楚、熟期早、抗性好的優(yōu)良穗行S2-9 種植20 粒，自交的同時進行誘導(dǎo)率測定。 對S2-9 穗行進行誘導(dǎo)率進一步測定發(fā)現(xiàn)，S2-9 單株單倍體誘導(dǎo)率介于5.63%～7.78%， 平均誘導(dǎo)率6.34%，其中第3 株的誘導(dǎo)率最高，達7.78%。 該S2單株不僅單倍體誘導(dǎo)率高，并且熟期早，綜合性狀較好，因此入選到S3世代。

2018 年在哈爾濱選擇誘導(dǎo)率較好的S3自交果穗種植成穗行，只針對籽粒標(biāo)記進行選擇，選則標(biāo)記清楚的籽粒共種植50 個穗行，每個穗行種植20 株。對S3-9-3 進一步測定， 單株誘導(dǎo)率介于6.21%～9.20%， 平均誘導(dǎo)率為7.89%。 隨著誘導(dǎo)基因不斷純合，單株誘導(dǎo)率比S2有所提高。 S3-9-3 中的第2 株和第6 株誘導(dǎo)率較高，分別達9.20%和8.83%，雖然第2 株的誘導(dǎo)率高于第6 株， 但第2 株自身的雌雄協(xié)調(diào)性較差，自交后秋季結(jié)實率在50%左右，基于此對第2 株予以淘汰。 選擇S3-9-3-6 進入下一代。

2018 年在海南重點選擇誘導(dǎo)率較好， 田間農(nóng)藝性狀較好的50 個S4單株后代果穗種植成穗行。 S4-9-3-6 的單株誘導(dǎo)率介于12.50%～13.39%，平均誘導(dǎo)率為12.79%。 穗行后代中植株性狀和籽粒Navajo 標(biāo)記已趨于穩(wěn)定，所收獲的S3果穗籽粒的Navajo 標(biāo)記幾乎均已純合。在S4-9-3-6 中的第5 株誘導(dǎo)率最高，為13.39%，選擇該單株進入S5代，進行誘導(dǎo)率的重點測定。

2019 年在哈爾濱選擇2018 年海南穗行較為整齊、 誘導(dǎo)率較高的S5自交果穗種植成穗行，S5-9-3-6-5 中的第3 株誘導(dǎo)率為13.36%。 穗行的不同株系間誘導(dǎo)率差異不大。 于是將S5-9-3-6-5-3 單株進行繁殖，并命名為LY9-3（表1）。

2 誘導(dǎo)系LY9-3 的特征特性

誘導(dǎo)系LY9-3 的在哈爾濱地區(qū)生育期113 d 左右，需≥10℃活動積溫2 200℃左右。該誘導(dǎo)系種子發(fā)苗快，幼苗期第一葉鞘紫色，葉片、莖綠色。 雄穗一級分枝8～11 枝，穎殼紫色，花絲、花藥綠色。株高192 cm，穗位高68 cm，成株可見13 片葉。 果穗筒形，穗軸白色，穗長15.1 cm，穗粗4.2 cm，穗行數(shù)12～14 行，籽粒偏硬粒型、粒色黃色帶黑頂,百粒重27.3 g。

3 誘導(dǎo)系LY9-3 的繁殖技術(shù)

3.1 選地與整地

選擇地勢平坦、保水、保肥及排水方便、土質(zhì)肥沃、酸堿度偏中性的地塊。 盡量選擇前茬未使用長殘留農(nóng)藥的大豆、馬鈴薯、玉米等茬口。

無深松基礎(chǔ)地塊秋季采用大型農(nóng)機具深松、旋耕、滅茬、起壟、鎮(zhèn)壓一次性作業(yè)，達到待播種狀態(tài)。有深松基礎(chǔ)的地塊采取秋季滅茬旋耕一次性作業(yè)或春季頂漿滅茬旋耕起壟一次性作業(yè)。

3.2 播種施肥

空間隔離要求繁殖田塊具有500 m 以上的隔離距離， 時間隔離要求開花散粉時間前后間隔30 d 以上。 應(yīng)在5～10 cm 耕層地溫穩(wěn)定通過7～8℃、 土壤含水量25%～30%時搶墑播種。 哈爾濱地區(qū)通常在4 月25 日至5 月1 日之間播種為宜， 種植密度為7.5 萬株/hm2；施用有機肥1.0～1.5 t/hm2，整地時施入；底肥或種肥施五氧化二磷68～95 kg/hm2、氧化鉀58～66 kg/hm2、純氮30～45 kg/hm2；在植株11～12 片葉展開時追施純氮70～100 kg/hm2。

3.3 田間管理與收獲

苗期、拔節(jié)期、抽雄前期進行嚴(yán)格去雜去劣，保證純度。 土壤墑情好、整地精細(xì)的地塊，可在播種后出苗前進行苗前化學(xué)除草，選用乙草胺、2,4-D 丁酯、莠去津、噻吩磺隆等藥劑，均勻噴霧于土壤表面。 在絲黑穗病菌殘留較多地塊， 可采用10%烯唑醇乳油20 g濕拌玉米種100 kg，堆悶24 h。 在玉米螟產(chǎn)卵初期及卵盛期釋放赤眼蜂寄生玉米螟卵，防治玉米螟。 一般在授粉結(jié)束后60～65 d 開始收獲，植株表現(xiàn)中下部葉片變黃，基部葉片干枯，果穗苞葉變白，苞葉干松，籽粒色澤呈現(xiàn)本品種固有顏色，籽粒基部出現(xiàn)黑層，即是最佳收獲期。 在脫粒前一定要人工將異型穗一次性去除再進行果穗脫粒，確保誘導(dǎo)系純度和凈度。

4 應(yīng)用前景

近年來，國內(nèi)外各大育種公司已將玉米DH 育種技術(shù)運用于商業(yè)化育種中， 極大地加速了玉米育種進程。 單倍體誘導(dǎo)工作往往是開展單倍體育種的第一步。 Stock6 是在玉米中發(fā)現(xiàn)的第一個單倍體誘導(dǎo)系， 多數(shù)新誘導(dǎo)系的選育都是在Stock6 的基礎(chǔ)之上改良的[6-7]。 1999 年宋同明等利用BHO 高油群體和Stock6 進行雜交后育成了誘導(dǎo)率達5.8%的誘導(dǎo)系CAU1，填補了我國在這個領(lǐng)域的空白[3]。2007 年吉林省農(nóng)科院從Stock6 與M278 的雜交后代中育出了誘導(dǎo)率高達10%的誘導(dǎo)系吉高誘3 號[8]。 盡管如此，單倍體誘導(dǎo)系的選育速度還是很慢， 優(yōu)良的誘導(dǎo)系較少， 這也反映出在誘導(dǎo)系的選育中存在著一定的難度。 同時，由于黑龍江省的生態(tài)條件存在特殊性，外引的誘導(dǎo)系多表現(xiàn)出熟期晚、花期雌雄不調(diào)、結(jié)實率低和抗逆性差等缺點，難以直接大規(guī)模應(yīng)用。 本研究以外引誘導(dǎo)系EMK-1 與CAU5 雜交組配基礎(chǔ)材料，再按照系譜法嚴(yán)格選擇植株性狀和標(biāo)記性狀的同時，結(jié)合誘導(dǎo)率測定結(jié)果，最終選擇（EMK-1×CAU5）-9-3-6-5-3 作為新選的誘導(dǎo)系， 命名為LY9-3，其平均誘導(dǎo)率達到13.36%。 LY9-3 在黑龍江省生態(tài)條件下具有早熟、抗病、抗倒伏、花粉量大，單倍體誘導(dǎo)率高、籽粒標(biāo)記明顯等特點，可在黑龍江地區(qū)及相似生態(tài)區(qū)開展單倍體誘導(dǎo)工作。