許浩翔艾蓉姜玲玲雷露王清峰周景瑞王鑫劉林洋卜芬余波

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州師范學院，貴州 貴陽 550018)

前言

纈草(Valeriana officinalis L.)屬敗醬科，多年生高大草本植物，分布于中國東北、西南地區(qū)[1]，貴州地區(qū)山多，氣候溫和，山陰多潮濕，擁有纈草生長的良好地理環(huán)境。纈草具有安心神，祛風濕，行氣血，止痛的功效；葉揉碎外涂鎮(zhèn)痛活血，根部可入藥，加工成纈草揮發(fā)油、纈草提取物等產(chǎn)品，是藥品、保健品、煙用香精的重要原料，主要出口歐洲和日本，是美國10大暢銷天然產(chǎn)物制劑之一[2，3]。但隨著纈草需求的日益增長，人工種植產(chǎn)業(yè)形成規(guī)?；a(chǎn)，過度的人工干預導致產(chǎn)量提升的同時出現(xiàn)了品種退化，藥材質(zhì)量下降，產(chǎn)油率降低的現(xiàn)象[4]，這些問題嚴重制約了纈草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨機擴增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)是建立在聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)基礎(chǔ)上的遺傳標記技術(shù)，特點是方法簡單不需內(nèi)切酶，具有耗費少效率高的優(yōu)點[5]，該技術(shù)的指紋圖譜在物種分類和品種鑒定，遺傳關(guān)系分析，遺傳多樣性評價，資源保護有非常重要的作用[6]。

為促進黔產(chǎn)纈草的開發(fā)與利用，本研究選用黔產(chǎn)寬葉纈草和尖葉纈草進行隨機擴增多態(tài)性分子標記，篩選RAPD反應體系的影響因素，建立適用于黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR分析的反應條件，提高試驗的穩(wěn)定性和重復性，為黔產(chǎn)纈草優(yōu)質(zhì)資源的鑒別和保護提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

寬葉纈草和尖葉纈草隨機采集于貴州江口縣、劍河縣、岑鞏縣3個地區(qū)，采集后放于硬質(zhì)透明塑料袋冷藏保存，移置實驗室放于冰箱4℃保存，纈草采集地點、采集品種及樣品編號詳見表1。

1.2 實驗試劑和儀器

DNAsecure新型植物DNA提取試劑盒，2×TaqMaster Mix，GoldView I型核酸染色劑，購于天根生化科技有限公司；DL 2000 Marker和Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)，購于大連寶生生物工程股份有限公司；50*TAE Buffer，購于上海生工生物工程股份有限公司。

梯度PCR擴增儀(BIOMETRA)，德國耶拿分析儀器股份公司；凝膠成像儀(BIO-RAD Gel Doc XR)，美國伯樂公司；電泳儀(DDY-10C)，北京六一生物科技有限公司；通臺式冷凍離心機(5804R-effdorf)，德國艾本德股份公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黔產(chǎn)纈草幼葉樣品采摘

采摘寬葉纈草和尖葉纈草的幼葉并進行編號。

1.3.2 試劑盒法提取基因組DNA

根據(jù)天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒說明書進行纈草DNA的提取。

1.3.3 引物篩選

利用Primer 5.0基因分析軟件設(shè)計8對引物，實驗采用多個DNA模板篩選引物，以50μL為PCR反應體系總量進行試驗，每對引物分別對樣品進行PCR擴增，利用0.2%瓊脂糖電泳80min，電壓110V，凝膠成像系統(tǒng)查看DNA指紋圖譜，篩選擴增結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰度高、多態(tài)性豐富的引物。引物編號、引物序列和產(chǎn)物大小詳見表2。

表2 引物序列

1.3.4 退火時間篩選

以50μL的PCR反應體系進行試驗，PCR儀程序設(shè)置不同的退火時間為30s、60s、90s，分別進行擴增，檢測擴增產(chǎn)物多態(tài)性，擴增產(chǎn)物電泳方法同1.3.3。

1.3.5 退火溫度篩選

以50μL的PCR反應體系進行試驗，PCR儀程序置不同的退火溫度為45℃、50℃、55℃，分別進行擴增，檢測擴增產(chǎn)物多態(tài)性，擴增產(chǎn)物電泳方法同1.3.3。

1.3.6 PCR反應酶篩選

將已篩選出的引物、退火時間、退火溫度應用到PCR反應酶的篩選試驗中，以50μL的PCR反應體系試驗，選擇天根生化科技有限公司的2×Taq Master Mix和大連寶生生物科技有限公司的Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)分別進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物多態(tài)性，擴增產(chǎn)物電泳方法同1.3.3。

2 結(jié)果和分析

2.1 引物電泳結(jié)果分析

分別用引物Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8對14個樣品進行PCR擴增，結(jié)果表明，引物Y4能將所有樣品擴增出目的條帶，且清晰度高，表明引物Y4能夠作為黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR引物的擴增。其余7種引物擴增的目的條帶只有部分顯示，且不清晰，表明引物Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y7、Y8不能夠作為黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR引物的擴增，結(jié)果見圖1。

圖1 8種不同引物的電泳結(jié)果

2.2 不同退火時間篩選結(jié)果分析

對黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR反應體系退火時間進行單因素實驗，將退火時間設(shè)置為30s、60s、90s。結(jié)果表明，當退火時間為60s時，樣品均有擴增的目的條帶顯示，豐富度好且清晰度高；當退火時間為30s和90s時，樣品條帶不能夠全部顯示，且存在不清晰條帶。綜合試驗，選擇不同退火時間(30s、60s、90s)對樣品K1、K2、K3、J1、J2、J3進行同板電泳檢測。結(jié)果顯示，不同退火時間對樣品擴增結(jié)果的影響程度大小依次為60s>30s>90s，表明60s的退火時間適合黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR反應體系，結(jié)果見圖2。

注：M為Marker DL2000；K1～K7和J1～J7為樣品目的條帶；K11～K13和J11～J13為退火30s的樣品；K21～K23和J21～J23為退火60s的樣品；K31～K33和J31～J32為退火90s的樣品目的條帶。

2.3 不同退火溫度篩選結(jié)果分析

選取45℃、50℃、55℃對黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR反應體系進行退火溫度單因素實驗。結(jié)果表明，退火溫度為50℃時，樣品擴增的目的條帶數(shù)量多且清晰度高；當退火溫度為45℃、55℃時，樣品擴增的目的條帶清晰度低，數(shù)量低。選擇不同退火溫度(45℃、50℃、55℃)的擴增樣品K1、K2、K3、J1、J2、J3進行同板電泳檢測。結(jié)果顯示，退火50℃時樣品擴增的目的條帶數(shù)量最多且清晰度高，總體顯示不同退火溫度對樣品擴增結(jié)果的影響程度大小依次為50℃>45℃>55℃，表明50℃的退火溫度適合體系，結(jié)果見圖3。

注：M為Marker DL2000；K1～K7和J1～J7為樣品目的條帶；K11～K13和J11～J13為退火45℃的樣品；K21～K23和J21～J23為退火50℃的樣品；K31～K33和J31～J32為退火55℃的樣品目的條帶。

2.4 不同PCR反應酶篩選結(jié)果分析

分別使用天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix和大連寶生生物工程股份有限公司的Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)對黔產(chǎn)纈草進行PCR擴增。結(jié)果顯示，天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix擴增的目的條帶數(shù)量多且清晰度高，大連寶生生物工程股份有限公司的Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)，樣品擴增的目的條帶數(shù)量少且清晰度低。表明天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix更加適合黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR反應體系。擴增結(jié)果見圖4。

注：M為Marker DL2000；K1～K7和J1～J7為樣品目的條帶；K11～K14和J11～J14為天根生化科技有限公司的PCR Master Mix擴增的樣品；K21～K24和J21～J24為大連寶生生物工程股份有限公司的PCR Master Mix擴增的樣品目的條帶。

2.5 PCR最佳反應體系重復性試驗

根據(jù)單因素優(yōu)化實驗結(jié)果，選擇引物F-GAAAAGG GAAGAGGACCTGC、R-AGTTCTCCTCCGCTACCTCC，退火溫度50℃，退火時間60s，天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix反應酶，作為黔產(chǎn)纈草 RAPD-PCR反應體系的條件，在隨后的3周內(nèi)對纈草樣品進行重復多次實驗，結(jié)果表明，在該實驗條件下，重復性高，可靠性強。

3 結(jié)論

在現(xiàn)代藥理學研究中，纈草具有安神、改善睡眠、抗抑郁的作用[7，8]，早在唐代，《新修本草》中便記錄了纈草，《本草綱目》上也記載纈草：“安神，理氣，止痛”。在歐洲，纈草甚至被譽為“睡神草”，所以探究RAPD-PCR最佳反應體系能夠有效應用于纈草種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析，有助于黔產(chǎn)纈草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。RAPD-PCR方法簡單、成本低[9]，其擴增結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性對遺傳多樣性分析研究至關(guān)重要。在本研究中發(fā)現(xiàn)，退火溫度對擴增結(jié)果影響很大，這與史輝等[10]對太子參RAPD反應體系的優(yōu)化實驗中得出的結(jié)果一致。在Williams等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，當退火溫度高于40℃時會抑制RAPD-PCR的反應，從而影響擴增結(jié)果；在本研究中，隨著退火溫度的升高，擴增條帶結(jié)果越不清晰，但是在一定的退火溫度范圍內(nèi)，溫度越高越有利于擴增，本實驗中45℃的擴增結(jié)果條帶數(shù)量少，55℃時條帶不清晰，而在50℃時條帶數(shù)量多且清晰，這可能是因為高溫會消除分子內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)，增強引物與模板的復性，從而提高擴增效率，而溫度過高時，會使引物和模板之間結(jié)合不緊密，容易脫落，減少有效的擴增條帶[12]。

退火時間與引物的長度有關(guān)，過長的退火時間會降低酶的活性，過短的退火時間會導致引物沒有與DNA鏈完全連接，從而影響擴增結(jié)果[13]。在本實驗中，30s和90s的退火時間都不能使擴增條帶清晰明亮，在60s時能夠擴增出所有樣品條帶，并且清晰可見，合適的退火時間能夠讓引物能夠更好的和酶反應，這在王金斌等[14]和南文卓[15]研究中也得到了體現(xiàn)。

TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合作用和核酸外切酶活性，選擇合適的Taq DNA聚合酶對PCR擴增反應至關(guān)重要。本研究中對比了2家不同公司的TaqDNA聚合酶，由于TaqDNA聚合酶是Mg2+依耐性酶，對Mg2+濃度十分敏感[16]，所以當聚合酶用量、dNTPS濃度、緩沖液不同時，會對擴增結(jié)果造成極大的影響。本研究中發(fā)現(xiàn)，天根生化科技有限公司的TaqDNA聚合酶更加適合黔產(chǎn)纈草RAPD-PCR的反應體系。

本研究對黔產(chǎn)纈草建立的RAPD-PCR反應體系和反應程序，為纈草種質(zhì)資源鑒定、種間關(guān)系研究提供依據(jù)，也為選育優(yōu)良的纈草品種創(chuàng)造條件。