張曉婷，戴志飛，岳秀麗

熒光分子成像具有靈敏度高、成像時間短、無放射性損傷、價格較低等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于藥物的開發(fā)遞送和疾病的臨床檢測。熒光分子成像需要用到熒光探針，包括內(nèi)源性熒光基團（例如色氨酸、血紅蛋白）、基因表達的熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白）、外源性小分子熒光基團和熒光納米顆粒（例如吲哚菁綠、量子點）等。其中外源性熒光探針是目前研究的熱點，它們可以與生物大分子或藥物結(jié)合，對其生物學行為進行成像監(jiān)測；還可以通過化學修飾的方法連接靶向配體，實現(xiàn)對目標組織的靶向熒光成像，提高對腫瘤的診斷能力。

目前臨床上使用的熒光探針，在被激發(fā)后會不斷發(fā)出熒光信號，始終處于“開啟”狀態(tài)。常開型熒光探針依靠在目標組織的選擇性定位以及從血液和非目標組織的快速清除，實現(xiàn)對目標組織的高信噪比成像。從藥物遞送的角度來看，這種藥代動力學的要求與延長血液循環(huán)時間以增強目標組織中藥物積累的治療需求是沖突的。為了滿足成像的要求，研究人員開發(fā)了各種靶向熒光探針，以實現(xiàn)對目標組織的特異性富集，提高成像信噪比。然而，不論與目標組織或目標細胞是否鄰近、是否產(chǎn)生相互作用，常開型的靶向熒光探針都會發(fā)出熒光信號，因此存在背景信號的干擾，不能提供足夠高的信噪比（signal-to-background ratios，SBRs）。

熒光探針的特性之一是它們對環(huán)境具有響應(yīng)性，可以將其設(shè)計成未結(jié)合時不發(fā)光，而與特定的靶標分子發(fā)生相互作用后才會發(fā)出熒光，這種僅在目標部位“開啟”的探針被稱為可激活型探針或智能探針[1-2]。不同于常開型熒光探針，可激活型熒光探針一般呈熒光猝滅狀態(tài)，具有很低的背景信號或無背景信號，只在目標組織中產(chǎn)生強烈的熒光信號，因此具有比常開型熒光探針更高的信噪比，提高了對腫瘤靶向成像的特異性和靈敏度。

本文概述了可激活型靶向熒光探針的光物理機制和設(shè)計策略，并對正在進行臨床研究及具有臨床轉(zhuǎn)化價值的可激活型靶向熒光探針進行了介紹。

1 熒光信號猝滅和激活的光物理機制

理想的可激活型熒光探針要求具有很高的激活比率（激活后信號/激活前信號），即在未激活時呈熒光猝滅狀態(tài)，而在被激活后能發(fā)出強烈的熒光。如圖1，熒光探針與其他光學活性物質(zhì)之間發(fā)生相互作用，導致熒光強度或者光譜發(fā)生光物理變化，利用這些光物理機制，可以實現(xiàn)熒光信號的猝滅和激活[3-4]。

圖1 熒光猝滅和激活的光物理機制（熒光基團與其他光學活性物質(zhì)之間的相互作用導致其熒光強度或光譜變化）[3]

1.1 熒光自猝滅

熒光自猝滅，是指同種熒光分子之間產(chǎn)生相互作用而導致熒光強度減弱甚至消失的現(xiàn)象。通常在高濃度下，由于疏水效應(yīng)或 π-π 堆積效應(yīng)，熒光探針會發(fā)生聚集而導致熒光自猝滅。已經(jīng)發(fā)生自猝滅的熒光探針，從聚集到解聚的過程中會產(chǎn)生很強的熒光信號，是一種常用的可激活型熒光探針的設(shè)計思路。

1.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是指通過偶極-偶極耦合作用，將能量以非輻射方式從供體熒光基團傳遞到受體熒光基團的過程。當兩個熒光基團分子距離在 1～10 nm，且供體熒光基團的發(fā)射光譜和受體熒光基團的吸收光譜有重疊，供體的能量會轉(zhuǎn)移到受體，導致供體的熒光減弱或消失，并激發(fā)受體產(chǎn)生熒光。FRET 需要滿足 3 個條件[5]：供體和受體之間距離足夠近；供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有一定的重疊；供體與受體的偶極矩取向處于特定的方向。

1.3 有序聚集

熒光分子之間存在一種有序聚集現(xiàn)象，也叫激子耦合。根據(jù)聚集方式的不同，有序聚集分為兩類：J-聚集和 H-聚集[6]。J-聚集的熒光基團單體呈錯位平行排列，其吸收光譜相對于單體的吸收光譜會發(fā)生紅移；H-聚集的熒光基團單體則以共面堆疊排列，其吸收光譜會發(fā)生藍移，而且通常是沒有熒光的。因此，H-二聚體的形成是設(shè)計可激活型熒光探針的有效機制[7]。

1.4 光致電子轉(zhuǎn)移

另一種熒光猝滅和激活的機制是光致電子轉(zhuǎn)移（photo induced electron transfer，PeT），可以發(fā)生在單個熒光探針分子內(nèi)。PeT 體系是由間隔基團 S（spacer）將受體部分 R（receptor）與熒光基團 F（fluorophore）相連構(gòu)成的，受體部分和熒光基團之間存在光致電子轉(zhuǎn)移，具有很強的熒光猝滅作用。當受體部分與熒光基團分離或失活時，光致電子轉(zhuǎn)移被抑制或完全阻斷，熒光基團就會發(fā)出強烈的熒光，實現(xiàn)對探針的激活。

1.5 不同機制的組合

光致電子轉(zhuǎn)移激活熒光依靠熒光分子內(nèi)部的電子轉(zhuǎn)移，而其他幾種激活熒光的機制則是依靠熒光分子之間的相互作用。因此，可以將光致電子轉(zhuǎn)移與其他激活機制協(xié)同使用，進一步提高熒光激活效率[8]。

2 可激活型熒光探針的設(shè)計策略

2.1 酶反應(yīng)激活熒光探針

目前可激活型熒光探針最常見的設(shè)計策略是利用細胞外或細胞表面分泌的酶對探針進行活化，即酶激活型熒光探針。酶激活型熒光探針在被激活之前保持熒光猝滅狀態(tài)，而在到達特定的微環(huán)境之后，酶解導致其在細胞外空間產(chǎn)生熒光，從而實現(xiàn)高信噪比的成像[9]。腫瘤組織中高表達的特異性酶，例如組織蛋白酶[10-12]、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）[13]、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）[14-15]和 β-半乳糖苷酶[16-17]等，都可以用于酶激活型熒光探針的設(shè)計。在激活過程中，單個靶酶分子能夠激活許多熒光分子，從而放大目標組織的熒光信號。然而，熒光的激活發(fā)生在細胞外環(huán)境，因此激活后的熒光探針可能從目標組織擴散并產(chǎn)生背景信號。

2.2 分子靶向細胞激活熒光探針

第二種可激活型熒光探針的設(shè)計策略是靶細胞特異性激活熒光探針，未激活的熒光探針與靶細胞表面分子結(jié)合，隨后被內(nèi)吞進入細胞溶酶體，并在溶酶體內(nèi)被激活產(chǎn)生熒光（圖2）。與酶激活型熒光探針不同，靶細胞激活型熒光探針依靠探針與細胞表面受體的結(jié)合，具有高度特異性，而且僅在細胞內(nèi)部產(chǎn)生熒光。與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的細胞表面分子，例如過表達的生長因子受體（HER2）[18]、凝集素[7,19]等，可以作為靶細胞激活型熒光探針的特異性靶標。通過將多個熒光基團結(jié)合到同一個配體上，可以將探針的熒光信號放大。然而，在不影響靶細胞結(jié)合特異性的情況下，結(jié)合到單個分子上的熒光基團數(shù)量有限（約 10 個），這使得靶細胞激活型熒光探針的信號放大能力不如酶激活型熒光探針。

2.3 腫瘤微環(huán)境響應(yīng)型熒光探針

除了高表達的特異性酶，腫瘤微環(huán)境的其他理化特性也與正常組織有很大區(qū)別，例如乏氧[20]、微酸性[21]、高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平[22]等，這些差異可以作為可激活型熒光探針的刺激信號。

3 可激活型靶向熒光探針的研究進展

目前臨床前和臨床研究中使用的可激活型熒光探針主要是基于腫瘤組織高表達的組織蛋白酶和 MMP 而設(shè)計的。LUM015 是第一個進入臨床試驗的可激活型熒光探針，由 GGRK 肽、猝滅劑 QSY21、熒光基團 Cy5 和 mPEG多聚鏈（20 kD）連接組成。GGRK 肽是組織蛋白酶的特異性底物，因此 LUM015可以被組織蛋白酶特異性裂解而激活熒光[23]。在正常情況下，LUM015 處于熒光猝滅狀態(tài)，但在被組織蛋白酶水解切割后，猝滅劑 QSY21 與光學片段分開，導致 Cy5 的熒光恢復（圖3）。在一項 I 期臨床試驗中，15 名癌癥患者在手術(shù)前經(jīng)靜脈注射 LUM015，研究結(jié)果表明患者對 LUM015 具有良好的耐受性，手術(shù)切除標本的成像結(jié)果顯示腫瘤組織的熒光信號明顯強于正常組織（NCT01626066）[10]。另一項臨床試驗中，LUM015 被用于識別乳腺癌患者術(shù)后的殘留病灶，結(jié)果表明正常乳房組織沒有明顯的熒光信號，而腫瘤組織觀察到明顯的熒光信號，注射量為 0.5 mg/kg 時成像信噪比可達 4.70，注射量為 1.0 mg/kg 時信噪比達 4.22（NCT03321929）[24]。

圖3 LUM015 的熒光激活過程（其酶解產(chǎn)物包括含有猝滅劑 QSY21 的片段 1、含有 Cy5 的光學活性片段 2 和片段 3）[10]

靶向熒光探針 AVB-620（圖4），是一種基于細胞穿膜肽設(shè)計的可激活型比率熒光探針，能夠被腫瘤微環(huán)境中高表達的 MMP 激活。AVB-620 由可被 MMP 切割的連接臂將細胞穿膜肽和多聚陰離子的掩蔽肽連接，兩個熒光基團Cy5 和 Cy7 再通過中間的多肽連接，最終形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，兩個熒光基團之間產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），導致Cy5 的熒光猝滅。而在 MMP-2 或 MMP-9 的作用下，連接臂被酶解，干擾了 Cy5 和 Cy7 之間的 FRET，導致 Cy5的熒光恢復。細胞穿膜肽能夠攜帶 Cy5進入細胞，而連接了掩蔽肽的 Cy7 不能進入細胞，因此 AVB-620 在腫瘤部位具有很高的 Cy5/Cy7 熒光比值[13]。比率成像受人為信號變化（成像距離和運動引起的偽影、藥物濃度差異導致的信號變化）的干擾較小，成像的精確度更高。在 I 期臨床試驗中，27 名乳腺癌患者經(jīng)靜脈注射了 AVB-620，隨后進行乳腺癌的手術(shù)切除，結(jié)果表明患者對 AVB-620 具有很好的耐受性，而且 AVB-620 提高了術(shù)中乳腺癌檢測的效率[25]。目前 AVB-620 正在進行 II 期臨床試驗，評估其在乳腺癌患者術(shù)中區(qū)分惡性和非惡性組織的準確性（NCT03113825）[26]。

圖4 AVB-620 的化學結(jié)構(gòu)、吸收光譜和熒光光譜[A：AVB-620 的化學結(jié)構(gòu)；B：AVB-620 在 PBS/乙腈（80/20）溶液中的吸收光譜；C：在 TCNB 緩沖液中，AVB-620 用 630 nm 激發(fā)的熒光光譜（紅色）。加入 MMP-9 使 AVB-620 水解，干擾了 Cy5 和 Cy7 之間的 FRET，導致熒光光譜發(fā)生變化（藍色）][13]

酶激活型探針的熒光激活一般發(fā)生在細胞外環(huán)境，激活后的熒光探針可能從目標組織擴散并產(chǎn)生背景信號。一方面，可以通過增加熒光基團的分子量來解決擴散問題，例如LUM015 在熒光基團上引入聚乙二醇（PEG）長鏈的設(shè)計，抑制了其在組織中的快速擴散，延長了成像時間。另一方面，可以對熒光基團進行修飾，使其釋放的熒光片段能夠被腫瘤細胞高效攝取或定位于特定的細胞器，例如 AVB-620 在被酶解激活后，熒光基團可以隨細胞穿膜肽進入細胞。Ofori等[12]利用潛在的親溶酶體效應(yīng)（LLE），設(shè)計了可以定位在細胞溶酶體中的可激活型熒光探針 6QCNIR。6QCNIR 能夠被組織蛋白酶激活，酶解后釋放的熒光基團含有游離氨基而聚集在溶酶體中。Hu 等[11]將棕櫚酰脂質(zhì)鏈引入一種組織蛋白酶激活的熒光探針，使其釋放的熒光基團能夠定位到細胞膜，抑制其在組織中的快速擴散，注射 8 d 后仍然能夠在腫瘤部位檢測到熒光信號。

除了腫瘤特異性酶，目前研究人員針對腫瘤微環(huán)境的其他特性，如乏氧[27]、低 pH[28]、高 ROS 水平[29]、高濃度谷胱甘肽（GSH）[30]等特性設(shè)計了多種可激活型熒光探針，具有很大的臨床潛力。針對腫瘤微環(huán)境的微酸性特性，Zhao等[28]設(shè)計了由聚合物 PEG-b-P(EPA100-r-ICG1) 組成的 pH響應(yīng)性納米探針 PINS（轉(zhuǎn)變 pH = 6.9）。在 pH > 6.9 時，PINS 是穩(wěn)定的膠束結(jié)構(gòu)，ICG 呈熒光猝滅狀態(tài)；在腫瘤酸性的微環(huán)境中，pH < 6.9，PINS 膠束分解成單體，ICG 的熒光得到恢復（圖5）。臨床試驗的結(jié)果表明，患者對ONM-100（PINS 的商品名）的耐受性良好，30 名患者體內(nèi)的 4 種實體腫瘤均可以由 ONM-100 進行體內(nèi)和體外成像。ONM-100 能夠檢測出全部的腫瘤陽性切除邊緣（9/9），還檢測出 4 個未被發(fā)現(xiàn)的隱匿性病變[31]。

圖5 在轉(zhuǎn)變 pH 6.9 下，具有關(guān)/開響應(yīng)的 PINS 納米熒光探針示意圖[當 pH < 6.9 時，納米熒光探針解離成質(zhì)子化、高熒光的單體（ON 狀態(tài)）；當 pH > 6.9 時，納米熒光探針處于猝滅狀態(tài)（OFF 狀態(tài)）][28]

與傳統(tǒng)的近紅外一區(qū)（NIR-I，750～900 nm）相比，近紅外二區(qū)（NIR-II，1000～1700 nm）的光在生物組織的吸收和散射更少、穿透深度更深，而且 NIR-II 波段的人體自發(fā)熒光更弱，因此具有更高的成像信噪比，在生物熒光成像方面的潛力巨大。不僅如此，與 NIR-I 熒光探針類似，NIR-II 熒光探針也可以設(shè)計成對酶、缺氧、pH、金屬離子、受體等物質(zhì)具有響應(yīng)性的可激活型探針[2,32]。Zhan 等[33]開發(fā)了一種可被 MMP-14 激活的 NIR-II 納米熒光探針A&MMP@Ag2S-AF7P，用于體內(nèi)和體外神經(jīng)母細胞瘤的快速診斷分析。A&MMP@Ag2S-AF7P 包含 MMP-14 靶向肽AF7P、聚陽離子細胞穿透肽（R9）和聚陰離子片段（E8）及其中間的連接臂（圖6）。通過神經(jīng)母細胞瘤過表達的MMP-14 的特異性識別和酶解，F(xiàn)RET 被破壞，量子點Ag2S 的 NIR-II 熒光被快速激活。同時，穿膜肽 R9 暴露并引導納米探針被內(nèi)吞進入細胞，從而提供高信噪比的腫瘤成像數(shù)據(jù)。

圖6 NIR-II 可激活型納米熒光探針 A&MMP@Ag2S-AF7P 的示意圖[33]

4 結(jié)論與展望

近幾年，熒光術(shù)中導航技術(shù)發(fā)展迅速，對于熒光探針的需求也日益增長。為了提高對腫瘤靶向成像的特異性和靈敏度，研究人員設(shè)計了可激活型熒光探針。與常開型熒光探針不同，可激活型熒光探針一般呈熒光猝滅狀態(tài)，具有很低的背景信號或無背景信號，只在目標組織中產(chǎn)生強烈的熒光信號，因此具有更高的成像信噪比，為疾病的診斷和治療提供了巨大的希望。

盡管目前已經(jīng)有一些可激活型熒光探針進入臨床試驗，但大部分可激活型熒光探針仍處于實驗室研究階段，在進一步臨床轉(zhuǎn)化之前有許多亟待解決的技術(shù)問題，包括改善熒光特性（如量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性）、提高生物相容性、延長循環(huán)半衰期等。此外，相比于 NIR-I 區(qū)，NIR-II 熒光成像具有更優(yōu)秀的成像信噪比和更深的穿透深度。臨床前研究已經(jīng)開發(fā)了用于術(shù)中檢測的 NIR-II 熒光探針，但是這些探針都是常開型熒光探針，因此開發(fā) NIR-II 的可激活型熒光探針也是當前的研究熱點之一。

由于熒光對于人體的穿透能力較弱，在臨床上熒光成像更適用于淺表組織的成像。將熒光成像與其他成像技術(shù)（如CT、MRI 等）相結(jié)合，可以整合不同成像模態(tài)的優(yōu)點、提高成像能力，基于多模態(tài)成像構(gòu)建的可激活型多模態(tài)探針具有很大的研究價值。進一步將可激活型熒光探針與光療（光熱治療和光動力治療）結(jié)合，實現(xiàn)疾病的診療一體化，是有望提高腫瘤治療效果的研究方向。

盡管可激活型熒光探針的開發(fā)仍然存在許多挑戰(zhàn)，但是隨著研究的深入，可以預期在不久的將來，會有越來越多的可激活型熒光探針進入臨床，為疾病的術(shù)前診斷、術(shù)中檢測和術(shù)后評估等方面提供技術(shù)支持。