石會娟，張敏，張金振，黃京平，趙文，王鵬，胡菡，薛曉鋒，金玥

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京），北京 100193）

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物質(zhì)[1]，含有多種氨基酸、ω-3脂肪酸、復(fù)合維生素B、礦物質(zhì)和多酚等物質(zhì)，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值[2]，被認(rèn)為是人類營養(yǎng)的寶庫[3]。有研究表明蜂花粉具有抗氧化[4]、抗菌[5]、抗炎[6]、抗癌[7]、保肝[8,9]、保護(hù)心臟[10]、抗過敏活性和抑制免疫反應(yīng)[11]的作用，常作為天然膳食補(bǔ)充劑[12-14]。然而，由于特殊的生產(chǎn)方式和暴露的生產(chǎn)環(huán)境，蜂花粉極易吸附環(huán)境中的污染物，常作為環(huán)境指示劑[2]。同時(shí)，蜜源植物種植過程施用農(nóng)藥也會造成蜂花粉污染物殘留，危害食用者健康[15]。

新煙堿農(nóng)藥是目前使用最廣泛的殺蟲劑[16]。這主要得益于其對哺乳動物低毒的特性。然而，已有報(bào)道指出新煙堿農(nóng)藥的過度使用和長期積累，會對哺乳動物產(chǎn)生慢性、累積毒性[17]，導(dǎo)致生育能力下降[18]，發(fā)育遲緩[19]，運(yùn)動活性降低[20]，染色體畸變率增加[21]，誘發(fā)乳腺癌[22]等疾病。目前我國登記使用的新煙堿農(nóng)藥共10種，包括吡蟲啉、噻蟲嗪、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉、呋蟲胺、烯啶蟲胺、氯噻啉、哌蟲啶和環(huán)氧蟲啶，其中前8種使用較廣泛，涉及作物50余種。新煙堿農(nóng)藥具有良好的滲透性和內(nèi)吸傳導(dǎo)性，能夠從土壤、種子、水源遷移至植物花粉和花蜜中，經(jīng)蜜蜂采集污染蜂產(chǎn)品[23]。

Tang等[24]、Wen等[25]和Xiao等[26]均在蜂花粉中檢出多種新煙堿農(nóng)藥。歐盟SANTE/11278/2021規(guī)定了啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺在蜂產(chǎn)品中的最大殘留限量（MRLs）為50 ng/g，噻蟲啉為200 ng/g[27]；日本規(guī)定啶蟲脒在蜂產(chǎn)品中的MRL為200 ng/g[28]；目前我國《GB 2763-2021食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[29]規(guī)定了新煙堿農(nóng)藥在主要糧食作物和果蔬中的MRLs為10～2000 ng/g，而未在蜂產(chǎn)品中規(guī)定其限量。因此，開展我國多地區(qū)、多種蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留分析及其膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估，具有十分重要的意義。

本研究利用QuEChERS前處理方法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法分析了我國主要養(yǎng)蜂區(qū)的66批次蜂花粉樣品中8種常用新煙堿農(nóng)藥的殘留情況，并根據(jù)殘留濃度、膳食結(jié)構(gòu)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估，可為新煙堿農(nóng)藥在蜜粉源植物生長過程中的科學(xué)使用，以及在蜂花粉中MRLs的制定提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1290-6495 高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；天平（十萬分之一天平，百分之一天平），梅特勒-托利多（上海）；TTL-DC Ⅱ水浴氮吹儀，中國同泰聯(lián)公司；CR22GⅡ高速離心機(jī)，日本日立；Vortex-Genie2渦旋混合器，美國Scientific Industries；Integral5 Mili-Q去離子水發(fā)生器，美國Mili-Q。

乙腈、甲醇（色譜級），德國Merck公司；檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉倍半水合物、無水硫酸鎂、氯化鈉、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40～60 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，40～60 μm）、石墨化碳黑（GCB，40～ 60 μm），均購于美國Agilent公司；甲酸（色譜純），美國Fisher Scientific；吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪、噻蟲胺、噻蟲啉、呋蟲胺、氯噻啉、吡蟲啉-d4、啶蟲脒-d3、噻蟲嗪-d3、呋蟲胺-d4（純度均≥98%），天津阿爾塔公司。

1.2 樣品采集

于2022年，在河南、四川、江蘇、甘肅、湖北、山東6個(gè)主要養(yǎng)蜂區(qū)分別采集16、12、9、9、6、5批次，以及其他地區(qū)9批次（安徽2批次，廣東、青海、浙江、山西、吉林、內(nèi)蒙古、江西各1批次）；采集樣品包括油菜花粉28批次，茶花粉17批次，蕎麥花粉10批次，雜花粉7批次，其他花粉4批次（荷花花粉2批次，蠶豆和玉米花粉各1批次）共計(jì)采集蜂花粉樣品66批次，每份樣品500 g，置于樣品瓶中密封，4 ℃條件下保存，備用。

1.3 樣品前處理

參考宋梓豪[30]所開發(fā)的QuEChERS前處理方法：準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）蜂花粉樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻1 min，加入10 mL乙腈渦旋混勻1 min。加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉倍半水合物，劇烈振蕩并渦旋10 min，于4 ℃，9000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確移取7 mL上清液于含有1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18和45 mg GCB的15 mL離心管中。渦旋混勻10 min，于4 ℃，9000 r/min離心10 min。吸取1 mL上清液，于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑? mLφ=20%乙腈水溶液復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 儀器測定條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為φ=0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫：0～4 min，20% A～60% A；4～4.1 min，60% A～100% A；4.1～6 min，100% A～100 %A；6～6.1 min，100% A～20% A；6.1～9.5 min，20% A。柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μL；電離方式：電噴霧電離；掃描方式：正離子掃描，MRM模式；霧化氣：氮?dú)?；霧化氣壓力：310 kPa；離子噴霧電壓：3500 V；干燥器溫度：250 ℃；干燥氣流速：7 L/min；離子監(jiān)測條件參照宋梓豪[30]一文。

1.5 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估

膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估是以毒理學(xué)和殘留化學(xué)評估為基礎(chǔ)，根據(jù)我國居民膳食消費(fèi)量，估算農(nóng)藥的膳食攝入量，計(jì)算膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)，包括長期和短期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。參考我國《食品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評估指南》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2015）第三章，對本研究中來自蜂花粉樣品的新煙堿農(nóng)藥殘留進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評估。

估算蜂花粉長期日均攝入量（National Estimated Daily Intake，NEDI）和短期攝入量（National Estimated Short Term Intake，NESTI），計(jì)算公式如下：

式中：

C——長期日均攝入量（NEDI），g；

D——短期攝入量（NESTI），g；

Z——蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留濃度中值（STMR），ng/g；

F1——長期食用蜂花粉人群的日均消費(fèi)量，取20 g/d；

E——蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的最高殘留濃度（HR），ng/g；

F2——短期內(nèi)單次或多次食用蜂花粉的日攝入量，取40 g/d。

計(jì)算膳食攝入長期風(fēng)險(xiǎn)（RQ1，%）和短期風(fēng)險(xiǎn)（RQ2，%），計(jì)算公式如下：

式中：

Q1——長期風(fēng)險(xiǎn)（RQ1），%；

Q2——短期風(fēng)險(xiǎn)（RQ2），%；

A——每日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI），來源于GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[29]mg/(kg bw·d)；

B——急性參考劑量（Acute Reference Dose，ARfD），來源于英國赫特福德大學(xué)農(nóng)藥特性數(shù)據(jù)庫[31]，mg/(kg bw·d)；

bw——體質(zhì)量，本研究中取60 kg。

計(jì)算各新煙堿農(nóng)藥的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)商，評估風(fēng)險(xiǎn)值大小。RQ值越小風(fēng)險(xiǎn)越小，當(dāng)某種農(nóng)藥在蜂花粉中的殘留水平導(dǎo)致RQ1＞100%時(shí)，表示居民長期攝食該蜂花粉可能帶來不可接受的健康風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)某種農(nóng)藥殘留導(dǎo)致RQ2＞100%時(shí)，表示偶爾、短期攝入該蜂花粉也可能造成健康危害。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0和Excel完成數(shù)據(jù)計(jì)算，Origin完成圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢出限、定量限、線性范圍、回收率及精密度

本研究中8種新煙堿農(nóng)藥的檢出限為0.3 ng/g，定量限為1.0 ng/g，分別以3倍和10倍信噪比計(jì)算獲得。在0.15～50 μg/L范圍內(nèi)具有較好的線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999。對空白蜂花粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)的水平分別為1、2、10、50 ng/g，制備6份，按上述方法連續(xù)三天進(jìn)行測定，考察精密度。結(jié)果表明分析物的平均回收率在83.1%～119%之間，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均小于16.1%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)驗(yàn)方法的定性、定量分析、線性關(guān)系、回收率能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和再現(xiàn)性。

2.2 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留水平

2.2.1 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥殘留的總體情況

如表1所示，在66批次蜂花粉樣品中，共檢出5種新煙堿農(nóng)藥，檢出率最高的是噻蟲嗪（31.8%），其次是吡蟲啉（22.7%）、噻蟲胺（19.7%），啶蟲脒（16.7%）、檢出率最低的是呋蟲胺（12.1%）。平均殘留濃度從高到低依次是啶蟲脒（20.1 ng/g）、呋蟲胺（9.2 ng/g）、吡蟲啉（8.3 ng/g）、噻蟲嗪（8.1 ng/g）和噻蟲胺（1.8 ng/g）。檢出濃度最高的是啶蟲脒（195.1 ng/g），其次是吡蟲啉（59.9 ng/g），僅啶蟲脒和吡蟲啉的最大殘留濃度超過了歐盟規(guī)定的MRLs（50 ng/g）[27]。除啶蟲脒檢出濃度較高外，其余幾種新煙堿農(nóng)藥的檢出濃度范圍與Colding等[32]報(bào)道的結(jié)果相似。啶蟲脒是我國主要使用的新煙堿農(nóng)藥之一，已在我國蜂蜜、蜂花粉和蜂糧樣品中檢出，在Wang等[33]的研究中啶蟲脒是我國蜂蜜中檢出率最高的新煙堿農(nóng)藥。蜂花粉中啶蟲脒的高殘留率和殘留濃度，與其在我國農(nóng)作物上廣泛施用有關(guān)。

表1 蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況Table 1 The detection rate and residue concentration of neonicotinoids in different bee pollen samples

50.0 %的蜂花粉樣品中檢出一種及以上的新煙堿農(nóng)藥，檢出率與Tao等[24]和Wen等[25]的在我國油菜花粉中的檢出結(jié)果相似，低于Mitchell等[34]報(bào)道的蜂蜜樣品中新煙堿農(nóng)藥的檢出率。檢出1種藥物的樣品占比16.7%，檢出多種藥物殘留的樣品占比33.3%（其中檢出2種農(nóng)藥的占21.2%，檢出3種的占4.6%，檢出4種的占7.6%）。茶花粉中新煙堿農(nóng)藥的檢出率最高，達(dá)82.4%，其次為油菜花粉（50.0%）、雜花粉（28.6%）和蕎麥粉（20.0%）。除蕎麥花粉外，其余蜂花粉樣品中均存在多種藥物殘留現(xiàn)象，多殘留比例在茶花粉、雜花粉和油菜花粉中分別為64.6%、28.6%和25.0%，并且只在茶花粉中同時(shí)檢出3～4種新煙堿農(nóng)藥（圖1）。結(jié)果表明，我國蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥呈現(xiàn)多殘留特征，說明在蜜粉源植物種植期有多種藥物混合施用的現(xiàn)象。檢出的33批次蜂花粉樣品中，平均殘留濃度從高到低依次是雜花粉（102.3 ng/g）、蕎麥粉（31.5 ng/g）、茶花粉（14.8 ng/g）、油菜花粉（9.1 ng/g）和其他花粉（5.5 ng/g）。蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的最高殘留濃度為200.7 ng/g（雜花粉），其次為59.9 ng/g（蕎麥粉）。所有陽性樣品中新煙堿農(nóng)藥的平均檢出濃度為18.9 ng/g，中位檢出濃度9.8 ng/g，殘留濃度的中位值均不高于平均值，這表明蜂花粉樣品中的新煙堿農(nóng)藥主要是低濃度殘留。

圖1 不同植物源蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的檢出率Fig.1 The detection rate of neonicotinoids in different bee pollen samples

2.2.2 新煙堿農(nóng)藥在不同植物源蜂花粉樣品中的殘留情況

通過對不同植物源花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留特征的統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析表明茶花粉中新煙堿農(nóng)藥的檢出率，顯著高于油菜花粉、雜花粉和蕎麥花粉；并且茶花粉的多殘留比例，也顯著高于其他三種花粉（P＜0.05）。在我國吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪和呋蟲胺等新煙堿農(nóng)藥已登記用于茶樹防治茶小綠葉蟬等蟲害。在茶樹種植期間，預(yù)防性用藥，以及高頻率和多種藥物混合施用，是導(dǎo)致茶花粉中新煙堿農(nóng)藥多殘留和高殘留率的主要原因。同時(shí)值得注意的是，新煙堿農(nóng)藥中僅噻蟲嗪登記用于油菜的蚜蟲等病蟲害防治，但在油菜花粉中，檢出4種新煙堿農(nóng)藥，說明在油菜種植期存在混用、濫用以及外界環(huán)境污染現(xiàn)象。

檢出的33批次蜂花粉樣品中，雜花粉中新煙堿農(nóng)藥的總平均檢出濃度（102.3 ng/g）以及啶蟲脒平均殘留濃度（98.4 ng/g），均顯著高于茶花粉（14.8 ng/g，2.6 ng/g）和油菜花粉（9.1 ng/g，3.1 ng/g）（t檢驗(yàn)，P＜0.05）。雜花粉的高濃度殘留，主要來自于甘肅單一樣品的高濃度檢出，這可能與單一地區(qū)或單一種植區(qū)域農(nóng)藥大量施用有關(guān)。

2.2.3 不同地區(qū)蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況

如圖2所示，不同地區(qū)的蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況有較大差異，其中來自甘肅省的蜂花粉樣品檢出率和殘留濃度均高于其他省份。檢出率從高到低依次是甘肅?。?7.8%）、江蘇省（55.6%）、河南省（43.8%）、山東省（40.0%）、四川?。?3.3%）和湖北省（16.7%）；平均檢出濃度從高到低依次是甘肅?。?4.3 ng/g）、山東?。?1.4 ng/g）、河南?。?5.4 ng/g）、江蘇?。?.5 ng/g）、四川?。?.2 ng/g）和湖北省（5.5 ng/g）。甘肅地區(qū)的新煙堿農(nóng)藥主要來自于該地區(qū)的雜花粉樣品，而江蘇地區(qū)陽性樣品均為茶花粉。這說明新煙堿農(nóng)藥殘留區(qū)域性差異可能與不同地區(qū)作物種類、種植方式（輪作）、農(nóng)藥施用情況和施藥方式有關(guān)。

圖2 不同地區(qū)蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況Fig.2 The different residue of neonicotinoids in bee pollen samples of different provinces

2.3 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)

近年來，風(fēng)險(xiǎn)評估已廣泛應(yīng)用于人類膳食中農(nóng)藥殘留的暴露風(fēng)險(xiǎn)，為保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供了理論依據(jù)[33]。通過計(jì)算RQ值來反映蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥殘留的膳食風(fēng)險(xiǎn)，分別取殘留濃度的中位值和最大值計(jì)算其長期膳食風(fēng)險(xiǎn)值和短期膳食風(fēng)險(xiǎn)值，結(jié)果見表2。蜂花粉樣品中5種新煙堿農(nóng)藥的長期膳食風(fēng)險(xiǎn)值（RQ1）在0.0006%～0.0021%之間，短期膳食風(fēng)險(xiǎn)值（RQ2）在0.0021%～0.1858%之間，均遠(yuǎn)低于1%，啶蟲脒的RQ2最高，為0.1858%。與譚陽等[15]對蜂蜜中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評估的結(jié)果相近，均遠(yuǎn)低于100%的判定標(biāo)準(zhǔn)，說明蜂花粉中的新煙堿農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)較低，可以接受。

表2 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥殘留的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估Table 2 The dietary risk assessment of neonicotinoids residues in bee pollen samples

膳食風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果顯示本研究中66批次蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留風(fēng)險(xiǎn)均可接受，僅有2批次樣品中的新煙堿農(nóng)藥殘留濃度超過歐盟規(guī)定的MRLs，但均低于日本MRL，整體殘留濃度較低。由于國內(nèi)外蜂花粉植物源存在一定差異，且膳食結(jié)構(gòu)不同，因此可以參照歐盟和日本等國的MRLs，并結(jié)合我國蜜粉源作物種植期間新煙堿農(nóng)藥田間施用量，以及主要人群膳食攝入蜂花粉情況，研制我國蜂產(chǎn)品中的新煙堿農(nóng)藥的MRLs。

農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評估過程中常存在一些不確定因素影響結(jié)果，導(dǎo)致無法完全依據(jù)現(xiàn)實(shí)情況測定風(fēng)險(xiǎn)，如蜂花粉一般作為沖調(diào)食品稀釋飲用，實(shí)際食用的農(nóng)藥濃度比蜂花粉中的殘留濃度要低；本研究中采用的蜂花粉日均攝入量可能與居民實(shí)際食用量存在一定差異，同時(shí)蜂花粉樣品中存在新煙堿農(nóng)藥多殘留的情況，需要進(jìn)一步研究多殘留農(nóng)藥之間的毒性作用是否存在協(xié)同或拮抗。

3 結(jié)論

在檢測的66個(gè)蜂花粉樣品中，50.0%的樣品檢出新煙堿農(nóng)藥殘留，樣品最高檢出濃度200.7 ng/g，啶蟲脒和吡蟲啉的最高檢出濃度超出歐盟的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。不同植物來源和地理來源的蜂花粉樣品間，新煙堿農(nóng)藥的殘留水平存在一定差異，這可能與新煙堿農(nóng)藥的農(nóng)業(yè)施用行為有關(guān)。蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥殘留的長期膳食和短期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)的評估結(jié)果均為低風(fēng)險(xiǎn)，在可接受范圍內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)蜂花粉樣品中普遍存在多種藥物殘留的現(xiàn)象，但累積風(fēng)險(xiǎn)和協(xié)同作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。